Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

 1 
MỞ ĐẦU 
1. Đặt vấn đề 
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng 
quan trọng hàng đầu ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Việc 
tiêu thụ đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đang gia tăng trên toàn thế giới 
do những tác dụng có lợi tới sức khỏe của con người, như phòng chống ung thư, 
ngăn ngừa bệnh tiểu đường và béo phì, hạ cholesterol và bảo vệ rối loạn thận. 
Hạt đậu tương là nguồn cung cấp dồi dào protein (32%-52%), lipid (12%-25%), 
vitamin (B1, B2, C, D, E...), nhiều amino acid thiết yếu (lysine, tryptophan, 
methionine, cysteine và leucine), chất xơ, năng lượng và các chất chuyển hóa 
thứ cấp. Vì vậy, hạt đậu tương được sử dụng làm thực phẩm cho con người, 
thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, mặt hàng 
xuất khẩu có giá trị kinh tế cao. Không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, 
cây đậu tương còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng 
bền vững tài nguyên đất canh tác. Gần đây, một trong những ứng dụng được 
quan tâm nhiều nhất của cây đậu tương là sản xuất dầu diesel sinh học. 
Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với hạn. Hạn là yếu tố phi 
sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất và có thể làm giảm năng suất cây 
đậu tương khoảng 40%. Hạn ảnh hưởng đến tất cả các thời kì sinh trưởng và 
phát triển của cây đậu tương, trong đó thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã 
được chứng minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Hiện nay, do 
những biến đổi về khí hậu, đặc biệt là hạn kéo dài, lượng mưa không đều ở các 
thời điểm trong năm và giữa các vùng miền gây khó khăn cho sản xuất nông 
nghiệp ở nhiều quốc gia, tại Việt Nam cũng không tránh khỏi những tác động 
tiêu cực đó. Hơn nữa, Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc, 
khả năng giữ nước kém nên việc canh tác các cây trồng nói chung và cây đậu tương 
 2 
nói riêng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn tạo giống đậu tương có khả 
năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết, mang tính thời sự ở Việt Nam cũng như 
trên thế giới. 
Tính chịu hạn của cây đậu tương do nhiều gen quy định, sản phẩm của các 
gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn hoặc có chức 
năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. Một số gen của đậu tương đã được mô tả là 
có phản ứng với tác động của hạn ở mức phiên mã. Trình tự cis và nhân tố trans 
giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng tác động của hạn. Các 
protein DREB - Những nhân tố có tác động trans liên kết với các trình tự cis để 
kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress ở thực vật. 
Việc cải thiện đặc tính di truyền của cây đậu tương để thích nghi với hạn 
được các nhà khoa học tiếp cận theo nhiều hướng: Lai hữu tính, gây đột biến 
thực nghiệm, chọn lọc quần thể, công nghệ tế bào, công nghệ gen. Trong đó, 
công nghệ gen được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao. Gần đây, đã có 
những tiến bộ trong việc cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua các 
kỹ thuật tác động vào nhân tố phiên mã hoặc yếu tố tín hiệu ở cây trồng chuyển 
gen. Tuy nhiên ở nước ta, một số nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chuyển các 
gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn vào cây đậu tương, ít thấy 
công bố kết quả hoàn chỉnh về chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt 
quá trình phiên mã, trong đó có gen GmDREB2. Do đó, việc nghiên cứu đặc tính 
phân tử, xác định chức năng gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới tính chịu 
hạn, cũng như việc chuyển các gen này từ các giống đậu tương có khả năng chịu 
hạn tốt sang giống có khả năng chịu hạn kém đang trở thành hướng nghiên cứu 
triển vọng, nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học ở trong và 
ngoài nước. 
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án: 
"Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu 
hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)". 
 3 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu 
tương Việt Nam có khả năng chịu hạn khác nhau. 
2.2. Biểu hiện được protein tái tổ hợp và chức năng sinh học của gen chuyển 
GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen. 
2.3. Tạo cây đậu tương chuyển gen và biểu hiện được protein tái tổ hợp 
GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen. 
3. Nội dung nghiên cứu 
3.1. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 phân lập 
từ cây đậu tương. Phân tích tính đa dạng trong trình tự nucleotide và protein của 
gen GmDREB2 ở cây đậu tương. 
3.2. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen 
GmDREB2. 
3.3. Nghiên cứu chuyển gen và phân tích biểu hiện gen GmDREB2 trên cây 
thuốc lá: (i) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2. (ii) 
Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trong cây thuốc lá. (iii) 
Đánh giá khả năng chịu hạn của các cây thuốc lá chuyển gen. 
3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây đậu tương và 
phân tích cây đậu tương chuyển gen. 
4. Những đóng góp mới của luận án 
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống, từ việc 
phân lập, tách dòng phân tử gen GmDREB2 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo 
cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển GmDREB2, cụ thể là: 
(1) Gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương có kích thước 480 nucleotide, 
mã hóa cho 159 amino acid. Các trình tự gen GmDREB2 đã được đăng ký trên 
 4 
Ngân hàng Gen mang các mã số: LK936507, LK936508, LK936509, HG965097, 
HG965098, HG965099. 
(2) Protein tái tổ hợp GmDREB2 biểu hiện mạnh trên cây thuốc lá chuyển gen. 
Khi bị hạn, ở các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng prolin tăng từ 
211,17% - 332,44% sau 5 ngày bị stress hạn và tăng từ 262,79% - 466,04% sau 
9 ngày bị stress hạn. 
(3) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang gen GmDREB2 và biểu hiện 
thành công protein tái tổ hợp GmDREB2 trên giống đậu tương DT84. 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 
5.1. Về mặt khoa học 
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen 
GmDREB2 phân lập từ 6 giống đậu tương Việt Nam (DT2008, CB, CBD, ĐT26, 
ĐT51, ĐVN5). Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen 
nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua 
việc tăng cường protein tái tổ hợp GmDREB2 và biểu hiện chức năng sinh học 
của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá và cây đậu tương. Những kết quả 
bước đầu về tạo cây chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật 
chuyển gen trong mục đích nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở 
Việt Nam. 
Các bài báo công bố trên các tạp chí Khoa học - Công nghệ quốc tế và ở 
trong nước, cùng với 6 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu 
tham khảo có giá trị trong việc nghiên cứu, giảng dạy sinh học và công nghệ 
sinh học. 
5.2. Về mặt thực tiễn 
Các trình tự gen GmDREB2 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen 
thực vật mang gen GmDREB2, các cây thuốc lá chuyển gen tạo được có khả năng 
 5 
chịu hạn tốt hơn so với cây đối chứng, các cây đậu tương chuyển gen đã góp phần 
giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải 
thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương nói riêng và các cây trồng khác nói 
chung, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ mới trong thực tiễn chọn giống 
cây trồng chịu hạn ở Việt Nam. 
 6 
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 
1.1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật 
 Stress phi sinh học là nguyên nhân chính dẫn đến mất mùa trên toàn 
thế giới, gây thiệt hại đến năng suất bình quân hơn 50% ở các loại cây trồng 
chính [18]. Trong số các stress phi sinh học, hạn là yếu tố chính làm giảm năng 
suất cây trồng. Stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội môi và phân bố ion trong tế 
bào [197]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn thông qua các con đường 
truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất 
chống oxi hóa, tích lũy các chất tan [36]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, hạn 
gây ra những tác động tiêu cực tới tất cả các cấp độ và các giai đoạn phát triển 
của thực vật. Để chống chịu với các stress hạn, thực vật phải thực hiện thông qua 
chuỗi các quá trình, với sự tham gia của rất nhiều yếu tố. Khi có hạn, các phản 
ứng sinh hóa khác nhau được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều loại 
chất dễ hòa tan, như đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp 
các cây trồng đối phó với hạn [71], tăng lượng chất chống oxy hóa khác nhau, 
chẳng hạn như glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), 
guaiacol peroxidase (POD) và catalase (CAT) chống lại điều kiện oxy hóa để 
phục hồi sau một thời gian nhất định bị hạn [12]. 
 Gần đây, những tiến bộ trong việc hiểu biết về biểu hiện gen, cơ chế 
phiên mã và việc truyền tín hiệu phản ứng với stress hạn của cây trồng đã được 
công bố [198]. Mặt khác, phân tích sinh học phân tử và di truyền học đã tạo điều 
kiện thuận lợi cho những khám phá về chức năng gen [155], [170] và được ứng 
dụng trong kỹ thuật di truyền với việc sử dụng một số gen chức năng hoặc một 
số gen điều hòa để kích hoạt các cơ chế liên quan đến tính chịu hạn, chịu mặn 
của cây trồng [176]. Vì vậy, cơ sở phân tử đặc tính chịu hạn của thực vật nói 
chung và cây đậu tương nói riêng cũng dần được sáng tỏ. Các gen phản ứng với 
 7 
stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính: Nhóm gen chức năng mà sản phẩm 
của chúng tham gia trực tiếp vào các phản ứng stress hạn như gen điều hòa áp 
suất thẩm thấu [167], gen mã hóa các protein chống oxi hóa [100], gen mã hóa 
protein LEA (Late embryogenesis abundant) [181], gen mã hóa protein vận 
chuyển LTP (Lipid trasfer protein) [111], aquaporin [48]; nhóm gen điều khiển 
cho ra các sản phẩm bao gồm các nhân tố phiên mã và các protein kinase truyền 
tin. Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu hạn đang được quan tâm 
nghiên cứu bao gồm DREB [24], WRKY [193], [195], bZIP (Basic leucine 
zipper) [54], MYB (Myeloblastosis oncogene) [90], [103], NCED (Nine-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase) [137] và AP2/ERF [193]. Các protein kinase 
truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [80], MAPK (Mitogen activated 
protein kinase) [112], RPK (Receptor-like protein kinase) [29], PIK (Phophatidyl 
inositol kinase) [185] và protein kinase serine/threonine [102] (Hình 1.1). 
 Hình 1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật 
 8 
 Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn liên quan chặt chẽ với quá 
trình phiên mã. Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng rất nhiều 
của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa. 
 Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều 
khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các 
stress môi trường. Có thể thấy rõ ở cây trồng, các gen mã hóa nhân tố phiên mã 
chiếm một phần lớn trong hệ gen. Ví dụ, ở cây Arabidopsis có đến 1500 TF 
trong hệ gen [140]. Cả hai loại: Nhân tố kích hoạt và ức chế quá trình phiên mã 
đã được sử dụng để nâng cao khả năng chịu hạn cho cây trồng, hầu hết các gen 
này đã được xác định và phân tích ở cây Arabidopsis [19]. Hiện nay, các protein 
DREB (một trong bốn phân họ lớn của họ AP2/ERF) là nhóm TF được nghiên 
cứu thành công nhất trong điều kiện phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu 
hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan 
[71]. Wang và cs (2009) đã xác định được trong cây Arabidopsis có 474 gen 
mục tiêu mà các nhân tố phiên mã DREB tác động [183]. Trong số những gen này, 
có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học và 27 gen cảm ứng với tình trạng 
thiếu nước [106]. 
1.1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2 
Các nhân tố phiên mã có thể được phân chia thành nhiều loại khác nhau 
dựa trên cấu trúc vùng liên kết của chúng với sợi DNA. Các nhân tố phiên mã như 
nhân tố có tác động trans và trình tự cis giữ vai trò trung tâm hoạt hóa promoter 
trong biểu hiện của các gen mục tiêu. Kết quả những phân tích về hoạt hóa 
promoter phản ứng với điều kiện bất lợi, trình tự cis và nhân tố có tác động trans 
liên quan đến phản ứng của các gen với điều kiện bất lợi đã được xác định [178]. 
Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm 
bốn phân họ lớn: AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF 
(Ethylene-responsive element binding factor) và DREB (Dehydration responsive 
element binding ) [148]. 
 9 
1.1.2.1. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF 
Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã có chứa miền 
AP2/ERF. Ở cây Arabidopsis chứa 145 locus gen mã hóa các nhân tố phiên mã 
của họ AP2/ERF [148] và ở lúa có 167 locus [152]. Miền AP2/ERF lần đầu tiên 
được tìm thấy ở Arabidopsis homeotic APETALA 2 [74]. Tương tự, miền này 
cũng tìm thấy ở cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), đó là yếu tố phản ứng với 
ethylene (EREBPs) [124]. Miền AP2/ERF có khoảng 60 amino acid có liên quan 
chặt chẽ với nhau [184]. Protein thuộc họ AP2/ERF là những nhân tố phiên mã 
có ở thực vật và người ta cũng tìm thấy ở cả những thực vật bậc thấp như tảo 
xanh (Chlamydomonas reinhardtii) [157], tương đồng với các miền AP2/ERF ở 
vi khuẩn. Do đó, có giả thuyết cho rằng các miền AP2/ERF được chuyển từ một 
loài vi khuẩn Cyanobacterium cộng sinh hoặc từ một loại vi khuẩn hay virus bởi 
hiện tượng biến nạp gen [98]. Ở đầu N và ở đầu C của miền AP2/ERF có chứa 
một đoạn xoắn β tương tự như kiểu xoắn α có chức năng nhận biết điểm bám 
trên promoter [158]. 
Phân tích mối quan hệ và thiết lập cây phát sinh họ AP2/ERF từ bốn 
phân họ: Arabidopsis, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens và 
Chlamydomonas reinhardtii, mà đại diện tương ứng là thực vật hạt kín, thông đất, 
rêu và tảo xanh (Hình 1.2). Mỗi nhánh trong cây phát sinh đại diện cho một nhóm 
và các thành viên của họ AP2/ERF có thể được chia thành ba nhóm dựa trên cấu 
trúc tổng thể [141]. 
Phân họ AP2/ERF trong nhóm Arabidopsis gồm 14 thành viên chứa hai 
miền AP2/ERF, phân họ RAV gồm 6 thành viên có chứa một miền AP2/ERF và 
thêm một miền B3, trong khi các phân họ khác gồm 125 thành viên chỉ có một 
miền AP2/ERF [152]. Phân họ AP2/ERF ở thực vật có hạt có thể được chia 
thành các phân nhóm AP2 và nhóm ANT [13]. 
 Sakuma và cs (2002) đã phân tích mối quan hệ của 125 thành viên chứa 
duy nhất miền AP2/ERF dựa trên cơ sở miền AP2/ERF của nhóm Arabidopsis. 
 10 
Thông qua phân tích này, 125 thành viên có một miền AP2/ERF được chia thành 
ba nhóm: Nhóm A gồm 56 thành viên thuộc phân họ DREB, nhóm B gồm 65 
thành viên thuộc phân họ ERF và nhóm còn lại gồm 4 thành viên thuộc những 
phân họ khác. Phân họ DREB được chia thành 6 phân nhóm, từ A-1 đến A-6, 
phân họ ERF cũng được chia thành 6 phân nhóm, từ B-1 đến B-6. Các 
DREB1/CBF thuộc phân nhóm A-1 và các DREB2 thuộc phân nhóm A-2 [148]. 
Nakano và cs (2006) phân tích mối quan hệ của các thành viên chứa duy nhất 
miền AP2/ERF trong Arabidopsis và ... lant Cell Physiol, 45, pp. 1042-1052. 
136. Qin F., Sakuma Y., Tran L.S.P., Maruyama K., Kidokoro S., Fujita Y., 
Fujita M., Umezawa T., Sawano Y., Miyazono. K., Tanokura M., Shinozaki 
K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2008), Arabidopsis DREB2A-interacting 
proteins function as RING E3 ligases and negatively regulate plant drought 
 121 
stress-responsive gene expression, Plant Cell, 20, pp. 1693-1707. 
137. Qin X., Zeevaart J.A.D., (1999), The 9-cisepoxycarotenoid cleavage reaction 
is thekey regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean, 
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, pp. 15354-15361. 
138. Qiu Y.P., Yu D.Q. (2009), Over-expression of the stress-induced OsWRKY45 
enhances disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis, Environ. Exp. 
Bot., 65, pp. 35-47. 
139. Rao S.S., Mamadou L., McConnell M., Polisetty R., Kwanyuen P. and 
Hildebrand D. (2009). Non-antibiotic selection systems for soybean somatic 
embryos: The lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent, BMC 
Biotechnology, Nov 18;9:94. doi: 10.1186/1472-6750-9-94. 
140. Ratcliffe O.J., Riechmann J.L. (2002), Arabidopsis transcription factors 
and the regulation of flowering time: a genomic perspective, Curr. Issues 
Mol. Biol., 4, pp. 77-91. 
141. Riechmann J.L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C.Z., Keddie J., 
Adam L., Pineda O., Ratcliffe O.J., Samaha R.R., Crelman R., Pilgrim M., 
Broun P., Zhang J.Z., Ghandehari D., Sherman B.K, Yu G.L. (2000), 
Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among 
eukaryotes, Science, 290, pp. 2105-2110. 
142. Rechsteiner M., Rogers S.W. (1996), PEST sequences and regulation by 
proteolysis, Trends Biochem Sci., 21, pp. 267-271. 
143. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. (2002), The combined effect of drought 
stress and heat shock on gene expression in tobacco, Plant Physiol, 130, 
pp. 1143-1151. 
144. Rizhsky L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., Mittler R. 
(2004), When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a 
combination of drought and heat stress, Plant Physiol, 134, pp. 1683-1696. 
 122 
145. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. (1986), Amino acid sequences 
common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis, Science, 234, 
pp. 364-368. 
146. Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K., 
Yamaguchi-Shinozaki K. (2006a), Functional analysis of an Arabidopsis 
transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression, 
Plant Cell, 18, pp. 1292-1309. 
147. Sakuma Y., Maryyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., Yamaguchi-
Shinozaki K. (2006b), Dual function of an Arabidopsis transcription factor 
DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene 
expression, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103, pp. 18822-18827. 
148. Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J.G., Abe H., Shinozaki K., Yamaguchi-
Shinozaki K. (2002), DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of 
Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and 
cold-inducible gene expression, Biochem. Biophys. Res. Commun., 290, 
pp. 998-1009. 
149. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular cloning a Laboratory 
Manual, Vol 3. 
150. Schramm F., Larkindale J., Kiehlmann E., Ganguli A., Englich G., Vierling E., 
Von Koskull-Doring P. (2008), A cascade of transcription factor DREB2A and 
heat stress transcription factor HsfA3 regulates the heat stress response of 
Arabidopsis, The Plant J., 53, pp. 264-274. 
151. Schramm F., Ganguli A., Kiehlmann E., Englich G., Walch D., Von 
Koskull-Doring P. (2006), The heat stress transcription factor HsfA2 serves 
as a regulatory amplifier of a subset of genes in the heat stress response in 
Arabidopsis, Plant Mol. Biol., 60, pp. 759-772. 
152. Sharoni A.M., Nuruzzaman M., Satoh K., Shimizu T., Kondoh H., Sasaya T., 
 123 
Choi I.-R., Omura T., Kikuchi S. (2011), Gene structures, classification, and 
expression models of the AP2/EREBP transcription factor family in rice, Plant 
Cell Physiol., 52(2), pp. 344-360. 
153. Shen Y.G., Zhang W.K., He S.J., Liu Q., Chen S.Y. (2003), An 
EREBP/AP2-type protein in Triticum aestivum was a DRE-binding 
transcription factor inducedby cold, dehydration and ABA stress, Theor. 
Appl. Genet.,106, pp. 923-930. 
154. Shinwari Z.K., Nakashima K., Miura S., Kasuga M., Seki M., Yamaguchi -
Shinozaki K., Shinozaki K. (1998), An Arabidopsis gene family encoding 
DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene 
expression, Biochem. Biophys. Res. Commun, 250, pp. 161-170. 
155. Seki M., Umezawa T., Urano K., Shinozaki K. (2007), Regulatory metabolic 
networks in drought stress responses, Curr. Opin. Plant Biol., 10, pp. 296-302. 
156. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2000), Molecular responses to 
dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two 
stress signaling pathways, Curr. Opin. Plant Biol., 3, pp. 217-223. 
157. Shigyo M., Hasebe M., Ito M. (2006), Molecular evolution of the AP2 
subfamily, Gene, 366, pp. 256-265. 
158. Shigyo M., Ito M. (2004), Analysis of gymnosperm two-AP2-domain-
containing genes, Dev. Genes Evol. 214, pp. 105-114. 
159. Shukla R.K., Raha S., Tripathi V., Chattopadhyay D. (2006), Expression 
of CAP2, an APETALA2-family transcription factor from chickpea, 
enhances growth and tolerance to dehydration and salt stress in transgenic 
tobacco, Plant Physiol, 142, pp. 113-123. 
160. Somers D.A., Samac D.A., and Olhoft P.M. (2003), Recent advances in 
legume transformation, Plant Physiol, 131, pp. 892-899. 
161. Subramanian S., Graham M.Y., Yu O., and Graham T.L. (2005), RNA 
 124 
interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues 
distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora 
sojae, Plant Physiol, 137, pp. 1-9. 
162. Sulieman S., Ha C.V., Nasr Esfahani M., Watanabe Y., Nishiyama R., 
Pham B.C.T., et al. (2015), DT2008: A Promising New Genetic Resource 
for Improved Drought Tolerance in soybean When Solely Dependent on 
Symbiotic N2 Fixation, Biomed Res. Int., doi:10.1155/2015/687213. 
163. Sun S., Yu J.P., Chen F., Zhao T.J., Fang X.H., Li Y.Q., Sui S.F. (2008), 
TINY, a dehydration-responsive element (DRE)-binding protein-like 
transcription factor connecting the DRE- and ethylene-responsive element-
mediated signaling pathways in Arabidopsis, J. Biol. Chem, 283, pp. 6261-6271. 
164. Stockinger E.J., Gilmour S.J., Thomashow M.F. (1997), Arabidopsis 
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator 
that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that 
stimulates transcription in response to low temperature and water deficit, 
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, pp. 1035-1040. 
165. Thao N.P., Thu N.B., Hoang X.L., Van Ha C., Tran L.S. (2013), 
"Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC 
genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance", Int. J. Mol. 
Sci., 14(12), pp. 23828 - 23841 
166. Thomashow M.F. (1999), Plant cold acclimation: freezing tolerance genes 
and regulatory mechanisms, Ann. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 50, 
pp. 571-599. 
167. Tomy S., Chang Y.M., Chen Y.H., Cao J.C., Wang T.P., et al (2009), 
Salinity effects on the expression of osmoregulatory genes in the euryhaline 
black porgy Acanthopagrus schlegeli, General and Comparative 
Endocrinology, 161, pp. 123-132. 
 125 
168. Tong S., Ni Z., Peng H., Dong G., Sun Q. (2007), Ectopic overexpression 
of wheat TaSrg6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis, Plant 
Science, 172, pp. 1079-1086. 
169. Topping J.F. (1998), Tobacco transformation, Methods Mol. Biol., 81, pp. 
365-372. 
170. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S..D., Fujita Y., Maruyama 
K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004), 
Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress inducible NAC 
transcription factors that bind to a drought responsive cis-element in the early 
responsive to dehydration stress 1 promoter, Plant Cell, 16, pp. 2481-2498. 
171. Tran L.S., Mochida K. (2010a), Functional genomics of soybean for 
improvement of productivity in adverse conditions, Funct Integr Genomics, 
10, pp. 447-462. 
172. Tran T.C.H. (2007), Study on the response capacity of genetic 
transformation of soybean varieties grown in Vietnam, Science & Technology 
Journal of Agriculture and Rural Development, 18, pp. 9-14. 
173. Tran T.C.H., Tran V.H. and La C.T. (2008), Transformation efficiencies of 
the soybean variety PC19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium 
tumefaciens and the cotyledonary node method, Omonrice, 16, pp. 1-8. 
174. Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer 
C.A., Walker D.R., Parrott Trick H.N., and Finer J.J. (1997b), SAAT: 
Aonication-assisted Agrobacterium-mediated trans-formation, Transgenic 
Res, 6, pp. 329-336. 
175. Tripathi P., Rabara R.C., Reese R.N., Miller M.A., Rohila 
J.S., Subramanian S., Shen Q.J., Morandi D., Bücking H., Shulaev 
V., Rushton P.J. (2016), A toolbox of genes, proteins, metabolites and 
promoters for improving drought tolerance in soybean includes the 
 126 
metabolite coumestrol and stomatal development genes, BMC 
Genomics. 17(1),102. doi: 10.1186/s12864-016-2420-0. 
176. Trujillo L., Menendez C., Ochogavia M.E., Hernandez I., Borras O., 
Rodriguez R., Coll Y., Arrieta J.G., Banguela A., Ramirez R., Hernandez L. 
(2009), Engineering drought and salt tolerance in plants using SodERF3, a 
novel sugarcane ethylene responsive factor, Biotech-nologia Aplicada, 26, 
pp. 168-171. 
177. Valliyodan B., Nguyen H. (2006), Understanding regulatory networks and 
engineering for enhanced drought tolerance in plants, Curr. Opin. Plant 
Biol., 9, pp. 1-7. 
178. Vágújfalvi A., Galiba G., Cattivelli L., Dubcovsky J. (2003), The cold-
regulated transcriptional activator Cbf3 is linked to the frost-tolerance locus 
Fr-A2 on wheat chromosome 5A, Mol. Genet. Genomics, 269, pp. 60-67. 
179. Wang G. and Xu Y. (2008), Hypocotyl-based Agrobacterium-medi-ated 
transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA 
interference, Plant Cell Rep., 27, pp. 1177-1184. 
180. Wang N., Liu M., Cheng X. and Ma Y. (2006), Glycine max DREB protein 
(DREB2) gene, complete cds. GenBank: DQ054363.1. 
181. Wang Y., Jiang J., Zhao X., Liu G.., Yang C., et al. (2006), A novel LEA 
gene from Tamarix androssowii confers drought tolerance in transgenic 
tobacco, Plant Science, 171, pp. 655-662. 
182. Wang Q.Y., Guan Y.C., Wu Y.R., Chen H.L., Chen F., Chu C.C. (2008), 
Overex-pression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought and low 
temperature tolerance in both Arabidopsis and rice, Plant Mol. Biol., 67, 
pp. 589-602. 
183. Wang S., Yang S., Yin Y., Guo X., Wang S., et al. (2009), An in 
silico strategy identified the target gene candidates regulated by dehydration 
 127 
responsive element binding proteins (DREBs) in Arabidopsis genome, Plant 
Mol. Biol., 69, pp. 167-178. doi: 10.1007/s11103-008-9414-5. 
184. Weigel D. (1995), The APETALA2 domain is related to a novel type of 
DNA binding domain, Plant Cell , 7, pp. 388-389. 
185. Whitman M., Downes C.P., Keeler M., Keller T., Cantley L. (1988), Type 
Iphosphatidylinositol kinase makes a novel inositol phospholipid, 
phosphatidylinositol-3-phosphate, Nature, 332, pp. 644-646. 
186. Wiebke-Strohm B., Pasquali G., Margis-Pinheiro M., Bencke M., Bücker-
Neto M., Becker-Ritt A.B., Martinelli A.H.S., Polacco J.C., Stolf R., 
Marcelino F.C., et al. (2012), Ubiquitous urease affects soybean 
susceptibility to fungi, Plant Mol. Biol., 79, pp. 75-87. 
187. Xue G.P., Loveridge C.W. (2004), HvDRF1 is involved in abscisic acid-
mediated gene regulation in barley and produces two forms of AP2 
transcriptional activators, interacting preferably with a CT-rich element, The 
Plant J., 37, pp. 326-339. 
188. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2006), Transcriptional regulatory 
networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses, 
Annu. Rev. Plant Biol, 57, pp. 781-803. 
189. Yoshida T., Sakuma Y., Todaka D., Maruyama K., Qin F., Mizoi J., 
Kidokoro S., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2008), 
Functional analysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3 
in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory 
system, Biochem. Biophys. Res. Commun, 368, pp. 515-521. 
190. Yorinori J.T., Paiva W.M., Frederick R.D., Costamilan L.M., Bertagnolli 
P.F., Hartman G.E., Godoy C.V., Nunes J.J.R. (2005), Epidemics of soybean 
rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003, 
Plant Dis, 89, pp. 675-677. 
 128 
191. Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z. and Polacco J.C. (2004), Refined 
glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean 
[Glycine max (L.) Merrill], Plant Cell Rep, 22, pp. 478-482. 
192. Zhang G., Chen M., Chen X., Xu Z., Guan S., et al. (2008), Phylogeny, 
gene structures, and expression patterns of the ERF gene family in soybean 
(Glycine max L.), J. Exp. Bot., 59, pp. 4095-4107. 
193. Zhang G., Chen M., Li L., Xu Z., Chen X., et al. (2009), Overexpression 
of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for 
increasedtolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco, J. 
Exp. Bot., 60, pp. 3781-3796. 
194. Zhang X., Wollenweber B., Jiang D., Liu F., Zhao J. (2008), Water 
deficits and heat shock effects on photosynthesis of a 
transgenic Arabidopsis thaliana constitutively expressing ABP9, a bZIP 
transcription factor, J. Exp. Bot., 59, pp. 839-848. 
195. Zhou Q.Y., Tian A.G., Zou H.F., Xie Z.M., Lei G., et al. (2008), Soybean 
WRKY type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and 
GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic 
Arabidopsis plants, Plant Biotechnology Journal, 6, pp. 486-503. 
196. Zhou J., Xie J., Liao H., Wang X. (2014), Overexpression of β-expansin 
gene GmEXPB2 improves phosphorus efficiency in soybean, Physiol. Plant., 
150(2), pp. 194-204. 
197. Zhu J.K. (2001), Plant salt tolerance, Trends Plant Sci., 6, pp. 66-71. 
198. Zhu Q., Zhang J., Gao X., Tong J., Xiao L., Li W., Zhang H. (2010), The 
Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA, salt 
and osmotic stress responses, Gene, 457, pp. 1-12. 
199. Zhuang J., Cai B., Peng R.H., Zhu B., Jin X.F., et al. (2008), Genome-wide 
analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa, Biochem. 
Biophys. Res. Commun., 371, pp. 468-474. 
 129 
200. Zhuang J., Peng R.H., Cheng Z.M., Zhang J., Cai B., et al. (2009), 
Genome-wide analysis of the putative AP2/ERF family genes in Vitis 
vinifera, Scientia Horticulturae, 123, pp. 73-81. 
201.  
202.