Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích (radix morindae officinalis) của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 
PHẠM VĂN KIỀN 
NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU 
CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH 
(RADIX MORINDAE OFFICINALIS) 
CỦA VIỆT NAM 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
HÀ NỘI, NĂM 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 
PHẠM VĂN KIỀN 
NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU 
CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH 
(RADIX MORINDAE OFFICINALIS) 
CỦA VIỆT NAM 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT 
MÃ SỐ: 62720410 
 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đoàn Cao Sơn 
 PGS. TS. Bùi Hồng Cường 
HÀ NỘI, NĂM 2021
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết 
quả trình bày trong luận án là trung thực và là một phần của đề tài cấp nhà nước 
“Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích 
Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc 
Chương trình “Khoa học và công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp 
hóa dược đến năm 2020” mà tôi có tham gia và được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề 
tài. 
 NCS. PhạmVăn Kiền 
LỜI CẢM ƠN 
 Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả 
của nhiều cá nhân, tập thể, của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. 
 Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. TS. Đoàn Cao Sơn 
– Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS. TS. Bùi Hồng Cường 
– Phó trưởng Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, những 
người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành 
luận án. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng 
Đào tạo Sau đại học, GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, cùng các thầy, cô của Bộ 
môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, tận 
tình giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận án này. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Công thương đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà 
nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba 
kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS. TS. 
Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh, chủ 
nhiệm đề tài và các anh, chị, em đồng nghiệp của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược 
dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung 
ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, giúp đỡ 
và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm để tôi hoàn thành luận án. 
 Cuối cùng, tôi xin chân thành cả ơn gia đình tôi và những người bạn, đồng 
nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên khích lệ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. 
 Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
NCS. Phạm Văn Kiền 
MỤC LỤC 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... i 
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ............................................................................ iii 
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ .................................................................... vii 
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 
1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) ............................................. 3 
1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích .............................................................................. 3 
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 3 
1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến ................................................................................. 4 
1.1.4. Thành phần hoá học .......................................................................................... 4 
1.1.5. Tác dụng dược lý ............................................................................................... 5 
1.1.6. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích ..................................................... 5 
1.2. Monotropein và nystose ....................................................................................... 6 
1.2.1. Monotropein ...................................................................................................... 6 
1.2.2. Nystose .............................................................................................................. 8 
1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose .................................... 12 
1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt 
Nam ........................................................................................................................... 12 
1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích ................................... 13 
1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis 
How ........................................................................................................................... 15 
1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật ............................................. 15 
1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR) .............................................................. 16 
1.4.3. Các trình tự gen thường dùng cho thực vật .................................................... 18 
1.4.4. Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How .................... 22 
1.6. Tính cấp thiết của luận án .................................................................................. 23 
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 25 
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 25 
2.2. Phương tiện nghiên cứu ..................................................................................... 25 
2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn....................................................................... 25 
2.2.2. Hóa chất và thuốc thử ..................................................................................... 25 
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................. 26 
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27 
2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ....... 27 
2.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
 ................................................................................................................................... 37 
2.3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ................................................. 39 
2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN..... 44 
2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một 
số chỉ tiêu định tính, định lượng ............................................................................... 48 
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 49 
3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose .......... 49 
3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein ......................... 49 
3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose ................................. 54 
3.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng 
phương pháp sắc ký lớp mỏng .................................................................................. 59 
3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích 60 
3.2.1. Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein và nystose ....................... 60 
3.2.2. Phân lập và tinh chế monotropein .................................................................. 61 
3.2.3. Phân lập và tinh chế nystose ........................................................................... 63 
3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn ................... 65 
3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose .................................................... 67 
3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein .................................................................. 67 
3.3.2. Thiết lập chất chuẩn nystose ........................................................................... 75 
3.3.3. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích.... 83 
3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN ....... 85 
3.4.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu .......................................................... 85 
3.4.2. Nhân bản đoạn gen ......................................................................................... 86 
3.4.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu ........................................................ 87 
3.4.4. Phân tích trình tự gen ..................................................................................... 89 
3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số 
chỉ tiêu định tính và định lượng ................................................................................ 93 
3.5.1. Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba 
kích trong Dược điển Việt Nam................................................................................. 93 
3.5.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI ..... 94 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 101 
4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ........ 101 
4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược 
liệu rễ Ba kích ......................................................................................................... 101 
4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ 
Ba kích ..................................................................................................................... 103 
4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC ........ 105 
4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
 ................................................................................................................................. 105 
4.2.1. Chiết cao toàn phần ...................................................................................... 105 
4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein .................................................................... 106 
4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose ............................................................................. 107 
4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được ........................... 108 
4.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose .................................................. 109 
4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN ..... 112 
4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số 
chỉ tiêu định tính, định lượng .................................................................................. 118 
4.5.1. Bổ sung chỉ tiêu định tính.............................................................................. 118 
4.5.2. Bổ sung chỉ tiêu định lượng .......................................................................... 120 
4.6. Những đóng góp mới của luận án .................................................................... 122 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 123 
Kết luận ................................................................................................................... 123 
Kiến nghị ................................................................................................................. 123 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 
i 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 
ADN : Acid Deoxyribo Nucleic 
ARN : Acid ribonucleic 
AFLP 
: Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các 
đoạn được nhân bản chọn lọc 
APG II 
: Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng loài 
thực vật hạt kín 
ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN 
CBOL : Consortium for the Barcode of Life 
cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp 
ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể 
DĐVN : Dược điển Việt Nam 
DNA : Deoxyribo Nucleic Acid 
dNTP : Deoxynucleoside triphosphate 
dATP : Deoxyadenosine triphosphate 
dCTP : Deoxycytidine triphosphate 
dGTP : Deoxyguanosine triphosphate 
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid 
ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi 
EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu 
ETS : External transcribed spacer – Vùng sao mã ngoài gene 
FHH 
: Diễn đàn hòa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình 
Dương 
HPLC-DAD
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector mảng diod 
HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi 
FOS : Fructo Oligo Saccharid 
ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế 
ii 
IGS : Intergenic spacer – vùng chen giữa các gene 
IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) 
ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản giữa 
ITS : Internal transcribed spacer 
KNV : Kiểm nghiệm viên 
LDL : Low density lipoprotein 
LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn 
matK : Maturase K 
MeOH : Methanol 
mRNA : Messenger Ribonucleic acid 
NCBI : National Center for Biotechnology Information 
PTN : Phòng thử nghiệm 
PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen 
QTL : Quantiative Trait loci 
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA 
rbcL : Rubisco large subunit gene 
SKLM : Sắc ký lớp mỏng 
SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ 
TBE : Tris/Borate/EDTA 
TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng 
TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng 
TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu sao chép 
TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane 
USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ 
UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến 
WHO : World health organization - Tổ chức Y tế thế giới 
iii 
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU 
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda ................................................................ 3 
Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển ...................... 5 
Bảng 1.3. Chương trình gradient dung môi định lượng nystose ..... ... ÂN TÍCH CỦA 2 PHÒNG THÍ 
NGHIỆM THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE 
t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 
Đồng nhất lô 
Đánh giá liên phòng 
thí nghiệm 
Trung bình 98.13 97.82 
Phương sai 0.94 0.30 
Số quan sát 10 6 
Giả thuyết về sự khác biệt 0 
Bậc tự do 14 
t thực nghiệm 0.808 
P(T<=t) one-tail (Xác xuất T < t 
thực nghiệm 1 phía) 0.2163 
t lý thuyết 1 phía 1.761 
P(T<=t) two-tail (Xác xuất T < t 
thực nghiệm 2 phía) 0.4326 
t lý thuyết 2 phía 2.1448 
 PL-47 
PHỤ LỤC 14: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHẤT CHUẨN DƯỢC ĐIỂN 
VIỆT NAM NYSTOSE 
 PL-48 
 PL-49 
PHỤ LỤC 15: SẮC KÝ ĐỒ CỦA NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CHẤT 
CHUẨN NYSTOSE (0119.C006.01) 
1. Thời gian 6 tháng 
1.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 
 PL-50 
1.2. Sắc ký đồ dung dịch thử nystose 
 PL-51 
2. Thời gian 1 năm 
2.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nystose 
 PL-52 
2.2. Sắc ký đồ dung dịch thử nystose 
 PL-53 
PHỤ LỤC 16: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHẤT CHUẨN SIGMA NYSTOSE 
 PL-54 
PHỤ LỤC 17: QUY TRÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE 
1. Mục đích 
Quy định phạm vi trách nhiệm và nội dung các bước thực hiện việc kiểm tra 
chất lượng để thiết lập chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose tại Viện Kiểm nghiệm 
thuốc Trung ương. 
2. Phạm vi áp dụng 
Được áp dụng tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương bởi những cán bộ đã 
được đào tạo phù hợp. 
3. Tài liệu tham khảo 
 Dược điển Việt Nam V 
 Thủ tục Thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn/ống chuẩn độ: VKN/TT/06.20 
4. Trách nhiệm 
Tất cả các cán bộ có liên quan đến việc thiết lập, hiệu chuẩn và bảo quản chất 
chuẩn Dược điển Việt Nam nystose thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phải 
thực hiện đúng theo quy trình này. 
5. Nội dung 
Cấu trúc hoá học của nystose 
Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-2-[[(2R,3S,4S,5R)-2-
[[(2R,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-
dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5-
(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol 
Công thức phân tử: C24H42O21 Khối lượng phân tử: 666,58 
5.1. Mục đích sử dụng: Sử dụng trong các phép thử định tính và định lượng bằng 
phương pháp phân tích hóa lý. 
 PL-55 
5.2. Mô tả 
Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước. 
5.3. Tiêu chuẩn chất lượng 
5.3.1. Định tính 
A. Phương pháp phổ hồng ngoại (DĐVN V – Phụ lục 4.2) 
Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại 
của nystose chuẩn và có các đỉnh đặc trưng: 3406, 1652, 1458, 1325, 1132, 1059, 999 
cm-1. 
B. Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V – Phụ lục 5.3) 
Trong phần định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu 
tương ứng với thời gian lưu của pic nystose trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. 
5.3.2. Mất khối lượng do làm khô: (Phương pháp TGA) 
Yêu cầu: Không quá 2,5% 
- Thiết bị: Máy phân tích nhiệt trọng lực TGA. 
- Chương trình gia nhiệt: 25ºC đến 105ºC, tốc độ gia nhiệt 10˚C/phút, giữ ở 105ºC 
trong 180 phút. 
- Lượng mẫu thử: Khoảng 5,0 mg chế phẩm. 
5.3.3. Nhiệt độ nóng chảy: (DĐVN V – Phụ lục 6.7) 
Yêu cầu: 134 – 135 oC 
5.3.4. Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (DĐVN V – Phụ lục 5.3). 
Yêu cầu: Chế phẩm phải chứa không dưới 97,0% nystose (C24H42O21), tính theo 
nguyên trạng. 
* Điều kiện sắc ký: 
- Cột sắc ký: RP18 Ultra (250 mm x 4,6 mm, 5 µm). 
 - Pha động: Methanol - Nước (3 : 97). 
 - Detector ELSD: Nhiệt độ hoá hơi: 90 ºC; Độ phát hiện: Gain 6; Áp suất khí 
nitơ: 3,5 bar. 
 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. 
 PL-56 
 - Thể tích tiêm: 10 µl. 
* Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn 
 - Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10,0 mg chuẩn nystose, hòa tan và 
định mức thành 10,0 ml dung dịch bằng pha động. Lấy 4,0 ml dung dịch, pha loãng 
và định mức thành 10,0 ml bằng pha động. 
 - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10,0 mg nguyên liệu nystose, hòa tan 
và định mức thành 25,0 ml dung dịch bằng pha động. 
* Tiến hành 
- Độ thích hợp của hệ thống sắc ký: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu 
và Ln(diện tích pic) của pic nystose trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không 
được lớn hơn 2,0 %. Số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không thấp hơn 2.000. 
- Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Tiến 
hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi thời gian lưu và diện tích của các pic nystose. 
* Tính toán kết quả 
- Hàm lượng (%) nystose (C24H42O41), tính theo nguyên trạng trong nguyên liệu 
được tính theo công thức: 
𝑋 (%) = 𝑒
(ln 𝑆𝑇×
𝑙𝑛𝐶𝑐
𝑙𝑛𝑆𝐶
)
×
25
𝑚 × 1000
 ×
1
1000
× 100 
trong đó: 
SC: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 
ST: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch thử 
CC: nồng độ nystose trong dung dịch chuẩn (µg/ml) 
m: lượng cân mẫu thử (g). 
5.3.5. Tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V – Phụ lục 5.4). 
Yêu cầu: Không quá 1 % 
Điều kiện sắc ký: 
- Bản mỏng: Silica gel GF254. 
- Dung môi khai triển: Ethyl acetat – nước- acid formic – acid acetic (6 : 3 : 2 : 
2). 
 PL-57 
- Thuốc thử hiện vết: Thêm từ từ 11 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc (TT) 
vào 89 ml ethanol (TT), thêm 2,75 g α-naphthol và 7 ml nước, trộn đều. 
Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch đối chiếu: 
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn nystose trong methanol có nồng độ 0,05 
mg/ml. 
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10 mg chế phẩm, hoà tan và định mức 
thành 10 ml dung dịch bằng methanol. 
- Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,0 ml dung dịch thử và pha loãng thành 100 ml 
bằng methanol. 
Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc 
ký tới khi dung môi đi được khoảng ¾ bản mỏng, lấy bản mỏng ra, để khô trong 
không khí và phun thuốc thử hiện vết, sấy bản mỏng ở 110 ºC trong 3 phút. 
Đánh giá: Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường, bất kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ 
của dung dịch thử cũng không được đậm màu hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung 
dịch đối chiếu (1 %). 
5.4. Hoá chất, thuốc thử 
5.4.1. Chất chuẩn 
Chất chuẩn nystose hãng Sigma Aldrich 
5.4.2. Cột sắc ký: 
RP18 Ultra (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) 
5.4.3. Hoá chất, dung môi 
- Methanol (TT) 
- Nước cất (TT). 
5.5. Nghiên cứu độ ổn định 
Độ ổn định chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose được nghiên cứu dựa trên 
các tiêu chí sau: 
* Định lượng: 
- Tiến hành thử nghiệm trên 06 thử của ít nhất 3 lọ khác nhau. 
- Phương pháp thử theo Mục 5.3.4. 
 PL-58 
- Yêu cầu: Hàm lượng chất chuẩn không sai khác quá 1,0 % so với hàm lượng 
chuẩn công bố; Giá trị (%) RSD 1,0 %. 
* Tạp chất liên quan: 
- Tiến hành kiểm tra trên 3 lọ (ống) mẫu thử riêng biệt 
- Phương pháp thử theo Mục 5.3.5. 
- Yêu cầu: Hàm lượng tạp chất phải đạt theo yêu cầu của Mục 5.3.5. 
5.6. Bảo quản 
Chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose được bảo quản tại kho lạnh bảo quản 
chất chuẩn, điều kiện nhiệt độ 2 oC – 8 oC và tránh ánh sáng. 
 PL-59 
PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ KIỂM TRA DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH THEO 
DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V 
Tiến hành kiểm tra chất lượng 4 mẫu Ba kích BK1, BK3, BK4 và BK5 theo 
chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Việt Nam V, kết quả thu được như 
sau: 
1. Mô tả 
 Rễ hình trụ tròn hay hơi dẹt, cong queo. Mặt ngoài màu nâu xám hoặc nâu 
nhạt, có nhiều vân dọc và ngang. Nhiều chỗ nứt ngang sâu tới lõi gỗ. Mặt cắt có phần 
thịt dày màu tím xám hoặc màu hồng nhạt, giữa là lõi gỗ nhỏ màu vàng nâu, vị hơi 
ngọt và hơi chát. 
 Hình ảnh 4 mẫu Ba kích sau khi loại bỏ rễ con, rửa sạch và sấy tới khô ở nhiệt 
độ 50 oC được trình bày tại Hình 1. 
BK1 
BK3 
BK4 
BK5 
Hình 1. Hình thái của dược liệu Ba kích 
2. Vi phẫu: 
 Dùng lưỡi dao lam cắt dược liệu thành từng lát mỏng 10 µm đến 20 µm. Ngâm 
các lát cắt vào dung dịch javen đến trắng, rửa sạch javen bằng nước cất. Tiếp tục 
 PL-60 
ngâm lát cắt trong dung dịch xanh methylen 0,02 % (TT) từ 30 giây đến 60 giây, rửa 
nhanh lát cắt bằng nước cất. Ngâm lát cắt trong dung dịch đỏ carmin 0,5 % (TT) tới 
khi thấy màu bắt rõ, rửa sạch lát cắt bằng nước cất. 
 Đặc điểm vi phẫu của 4 mẫu Ba kích như sau: Mặt cắt ngang hình tròn, cấu 
tạo từ ngoài vào trong gồm: 
 - Lớp bần gồm 2 đến 3 hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành vòng tròn đồng 
tâm và dãy xuyên tâm, trong lớp bần thường có các tế bào chứa bó tinh thể calci 
oxalat hình kim. 
 - Tế bào mô cứng xếp liền nhau tạo thành vòng sát lớp bần. 
 - Mô mềm vỏ dày, cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn, các tế 
bào ở phần ngoài bị ép bẹp. 
 - Phía trong mô mềm là libe, gồm các tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục. Rải 
rác trong mô mềm và libe có các bó tinh thể calci oxalat hình kim. 
 - Gỗ gồm các mạch gỗ lớn xếp thành bó, các bó kết hợp với nhau tạo thành lõi 
hình sao 5, 6 cạnh. Trong mô gỗ có những đám tế bào không hóa gỗ. 
 Kết quả đặc điểm vi phẫu của 4 mẫu Ba kích được trình bày tại Hình 2, Hình 
3, Hình 4 và Hình 5. 
 PL-61 
1. Bần 
2. Tinh thể canxi oxalat hình kim 
3. Tế bào mô cứng 
4. Mô mềm 
5. Libe 
6. Gỗ 
Hình 2: Vi phẫu rễ Ba kích BK1 
1 
2 
3 
4 
6 
5 
1 
2 
 PL-62 
1. Bần 2. Tinh thể canxi oxalat hình kim 3. Tế bào mô cứng 
 4. Mô mềm 5. Libe 6. Gỗ 
Hình 3: Vi phẫu rễ Ba kích BK3 
1 
3 
4 
5 
6 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
2 
2 
2 
 PL-63 
 1. Bần 2. Tinh thể canxi oxalat hình kim 
 3. Tế bào mô cứng 4. Mô mềm 5. Libe 6. Gỗ 
Hình 4: Vi phẫu rễ Ba kích BK4 
1 
2 
3 
4 
6 
5 
1 
2 
3 
4 
 PL-64 
1. Bần 
2. Tinh thể canxi oxalat hình kim 
3. Tế bào mô cứng 4. Mô mềm 
5. Libe 6. Gỗ 
Hình 5: Vi phẫu rễ Ba kích BK5 
3. Soi bột: 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
 PL-65 
 Lấy một lượng nhỏ bột (qua rây có kích thước mắt rây khoảng 250 µm), cho 
vào một giọt nước đã có sẵn trên lam kính, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm 
dung dịch, đậy lam kính, di nhẹ lam kính, dùng giấy thấm lau sạch nước xung quanh 
lam kính và tiêu bản, sau đó quan sát dưới kính hiển vi. 
 Bột màu nâu nhạt, đem soi bột dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: 
- Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật. 
 - Mảnh mô mềm cấu tạo bởi các tế bào hình nhiều cạnh thành mỏng, một số 
tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim. 
- Sợi gỗ. 
 - Tế bào mô cứng có các loại: 
+ Tế bào mô cứng thành dày hóa gỗ, các lỗ trao đổi rõ. 
+ Tế bào mô cứng thành dày hóa gỗ, các lỗ trao đổi rõ, khoang rộng. 
- Nhiều tinh thể calci oxalat hình kim, dài khoảng 0,1 mm và các đoạn gãy của 
chúng. 
- Rải rác có các hạt tinh bột. 
- Mảnh mạch dạng điểm. 
Kết quả hình ảnh soi bột 4 mẫu Ba kích được trình bày tại Hình 6, Hình 7, 
Hình 8 và Hình 9. 
 PL-66 
1. Bần 
2. Mảnh mô mềm 
3. Sợi gỗ 
4. Tế bào mô cứng 
5. Tinh thể calci oxalat hình kim 
6. Mảnh mạch điểm 
Hình 6. Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK1 
6a 
1 2a 2b 
3 4a 4b 
4
C 
5 
6b 
 PL-67 
1. Bần 2. Mảnh mô mềm 3. Sợi gỗ 
4. Tế bào mô cứng 5. Tinh thể calci oxalat hình kim 6. Hạt tinh bột 
7. Mảnh mạch điểm 
Hình 7. Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK3 
1 2 3a 
4d 
5a 
5b 
5c 
6
b 
4a 4b 4c 
7 
 PL-68 
1. Bần 
2. Mảnh mô mềm 
3. Sợi gỗ 
4. Tế bào mô cứng 
5. Tinh thể calci oxalat hình kim 
6. Mảnh mạch điểm 
Hình 8. Các đặc điểm soi bột rễ Ba kích BK4 
1 2 3 
4a 4
b 
5a 
a 
5b 
a 
6 
 PL-69 
1. Bần 2. Mảnh mô mềm 3. Sợi gỗ 
4. Tế bào mô cứng 5. Tinh thể calci oxalat hình kim 6. Hạt tinh bột 
7. Mảnh mạch điểm 
Hình 9. Các đặc điểm soi rễ Ba kích BK5 
1 2a 3a 
3
b 
4a 4b 
4d 4
C 
5a 
5b 
6 
7 
 PL-70 
4. Định tính 
A. Cân chính xác khoảng 0,15 bột dược liệu Ba kích, tiến hành vi thăng hoa sẽ được 
tinh thể màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm, sẽ ngả màu đỏ tím. 
B. Đun sôi 0,10 g bột dược liệu với 1 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT) và 9 ml 
nước, rồi lọc. Thêm acid hydrocloric (TT) cho đến phản ứng hơi acid và 10 ml ether 
ethylic (TT), lắc. Lớp ether sẽ nhuộm màu vàng (Hình 10). Gạn riêng lớp ether, thêm 
5 ml dung dịch amoniac đậm đặc (TT), lắc. Lớp dung dịch amoniac sẽ nhuộm màu 
đỏ tím bền vững (Hình 11). 
Hình 10. Lớp dung môi ether của 4 mẫu dược liệu Ba kích 
Hình 11. Lớp dung môi amoniac của 4 mẫu dược liệu Ba kích 
Các mẫu nghiên cứu đều cho kết quả phản ứng có màu ở lớp dung môi ether và 
amoniac tương đương với màu của như mẫu chuẩn Ba kích (lớp dung môi ether có 
màu vàng, lớp dung môi amnoniac có màu đỏ tím). 
 PL-71 
C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 
 Điều kiện sắc ký: 
- Bản mỏng silicagel G 
- Dung môi khai triển: Ether dầu hoả (30o) – ethyl acetat – acid acetic băng 
(7,5 : 2,5 : 0,25). 
- Dung dịch thử: Cân khoảng 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, lắc để nước 
thấm đều dược liệu, để yên 15 phút, nghiền bột dược liệu trong cối sứ thành bột ướt, 
thêm 40 ml methanol (TT), cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu trên cách 
thuỷ 30 phút, lọc, làm bay hơi dung môi đến cạn. Thêm 5 ml nước và 20 ml ether dầu 
hoả (30o) (TT), lắc khoảng 5 phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết ether dầu hoả, làm 
bay hơi hết dung môi. Hoà cắn trong 2 ml methanol (TT), làm dung dịch thử. 
Dung dịch đối chiếu: Lấy 5,0123 g dược liệu Ba kích chuẩn và tiến hành như 
dung dịch thử. 
Hình 3. 1. Hình ảnh sắc ký đồ SKLM các mẫu Ba kích – Phương pháp B 
Nhận xét: Trên sắc ký đồ các mẫu thử đều các vết có cùng Rf và cùng màu sắc với 
các vết trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Ba kích. 
5. Độ ẩm 
Phương pháp sấy. 
Kết quả kiểm tra độ ẩm của 4 mẫu dược liệu Ba kích 
 PL-72 
Mẫu BK1 BK3 BK4 BK5 
Độ ẩm (%) 9,14 11,52 9,74 10,49 
Yêu cầu ≤ 12,0 % 
Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt 
6. Tỷ lệ vụn nát 
 Kết quả kiểm tra tỷ lệ vụn nát của 4 mẫu dược liệu Ba kích 
Mẫu BK1 BK3 BK4 BK5 
Kết quả Không có 
Yêu cầu ≤ 5,0 % 
Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt 
7.Tạp chất 
 Kết quả kiểm tra tạp chất của 4 mẫu dược liệu Ba kích 
Mẫu BK1 BK3 BK4 BK5 
Kết quả Không có tạp chất; Không có dược liệu xơ, hóa gỗ 
Yêu cầu 
Tạp chất khác: Không quá 1,0 %. 
Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 0,3 cm: 
Không được có 
Kết quả Đạt Đạt Đạt Đạt 
Kết luận chung: 4 mẫu dược liệu BK1, BK3, BK4 và BK5 đạt yêu cầu chất lượng 
theo Dược điển Việt Nam V. 
 PL-73 
PHỤ LỤC 19: KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MONOTROPEIN TRONG MỘT 
SỐ DƯỢC LIỆU BA KÍCH 
Stt Tên mẫu 
Hàm lượng (%) 
monotropein tính theo 
dược liệu khô kiệt 
RSD 
(%) 
Nơi thu hái 
1 Mẫu 1 1,7 0,3 Lục Ngạn, Bắc Giang 
2 Mẫu 2 0,7 0,8 Phú Lương, Thái Nguyên 
3 Mẫu 3 0,6 0,8 Tây Giang, Quảng Nam 
4 Mẫu 4 0,5 0,8 Tây Giang, Quảng Nam 
5 Mẫu 5 1,8 1,6 Ba Chẽ, Quảng Ninh 
6 Mẫu 6 0,6 0,4 Đông Giang, Quảng Nam 
7 Mẫu 7 0,3 1,1 Tây Giang, Quảng Nam 
8 Mẫu 8 1,8 0,2 Ba Chẽ, Quảng Ninh 
9 Mẫu 9 0,7 0,9 Đắk Hà – Kon Tum 
10 Mẫu 10 1,1 0,2 Phú Lương, Thái Nguyên 
11 Mẫu 11 1,1 0,5 Sơn Động, Bắc Giang 
12 Mẫu 12 0,9 1,4 Phước Sơn, Quảng Nam 
13 Mẫu 13 0,7 1,9 Đông Giang, Quảng Nam 
14 Mẫu 14 0,8 1,8 Tây Giang, Quảng Nam 
15 Mẫu 15 0,2 0,2 Tây Giang, Quảng Nam 
16 Mẫu 16 2,4 1,9 Vân Đồn, Quảng Ninh 
17 BK1 1,0 0,7 Lục Ngạn, Bắc Giang 
18 BK3 3,1 0,5 Vân Đồn, Quảng Ninh 
19 BK4 1,3 0,6 Hoành Bồ, Quảng Ninh 
20 BK5 2,1 0,7 Tây Giang, Quảng Nam