Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn (staphylococcus spp.) sản sinh màng sinh học

Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 8: 744-752 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(8): 744-752-
www.vnua.edu.vn 
744 
NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH 
CỦA TỤ CẦU KHUẨN (Staphylococcus spp.) SẢN SINH MÀNG SINH HỌC 
Nguyễn Văn Giáp*, Cao Thị Bích Phượng 
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 
*Tác giả liên hệ: nvgiap@vnua.edu.vn 
Ngày nhận bài: 01.10.2018 Ngày chấp nhận đăng: 07.11.2018 
TÓM TẮT 
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng 
kháng sinh của các chủng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.). Bằng phương pháp định lượng đã xác định được sự 
hình thành màng sinh học của tụ cầu khuẩn với 51,61% số chủng sản sinh màng sinh học ở mức mạnh, trung bình 
và yếu. Kết quả nghiên cứu biến động của màng sinh học sản sinh theo thời gian cho thấy tụ cầu khuẩn hình thành 
màng sinh học tăng dần trong khoảng 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm trong khoảng 24-40 giờ sau nuôi cấy trên đĩa 
nhựa 96 giếng. Về khả năng đề kháng kháng sinh, đã xác định được tụ cầu khuẩn nằm trong màng sinh học đề 
kháng với nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển vi khuẩn 
ở dạng tự do. 
Từ khóa: Vi khuẩn, màng sinh học, đề kháng kháng sinh. 
Biofilm Forming and Antibiotic Resistance 
of Biofilm Producing Staphylococcus spp. 
ABSTRACT 
This study was conducted to determine the biofilm formation and antibiotic resistance of the biofilm-forming 
Staphylococcus spp. By the application of microtiter plate test, a quantitative method, the biofilm formation of 
staphylococci was determined. It was found that 51.61% strains produced biofilms at strong, medium and weak 
levels. Study on the production of biofilm over time showed that the biofilm formation by staphylococci increased from 
4 hours to 20 hours, and then decreased from 24 hours to 40 hours post innoculation in 96-wells plate. In terms of 
antibiotic resistance, the biofilm producing strains were able to survive under the concentrations of antibiotics of 10 to 
100 times higher than the planktonic bacteria. 
Keywords: Bacteria, biofilm, antibiotic resistance. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Màng sinh học (biofilm) là têp hĉp các vi 
sinh vêt liên kết chặt chẽ vĆi nhau ć trên bề mặt 
vêt chçt và đþĉc bao bọc bći chçt nền ngoäi bào 
có thành phæn chính là polysaccharide (Donlan, 
2002). Về thành phæn vi sinh vêt, màng sinh 
học có thể bao gồm một hoặc nhiều loài vi khuèn 
khác nhau (Thorntonet al., 2011; Yanget al., 
2011). Về cçu trúc, màng sinh học hoàn chînh có 
tính phân lĆp và không đồng nhçt (Stewart & 
Franklin, 2008), trong đó vùng lõi cûa màng 
sinh học bao gồm các tế bào vi khuèn chuyển 
sang träng thái tïnh, không hoät động 
(persister) và chiếm khoâng 1% trong tổng số vi 
khuèn cçu thành lĆp màng sinh học. Trong 
nhiều bệnh nhiễm trùng män tính, să hình 
thành màng sinh học làm cho vi khuèn rçt khó 
bð tiêu diệt bći kháng sinh, bći lẽ khi ngÿng 
dùng thuốc, vi khuèn ć träng thái không hoät 
động trong màng sinh học (persister cells) sẽ hồi 
phýc và gây nhiễm trùng trć läi. Do đþĉc lĆp 
Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng 
745 
polysaccharide bao bọc nên vi khuèn có khâ 
nëng bám dính, tồn täi lâu dài trên bề mặt, đề 
kháng tốt vĆi hiện tþĉng thăc bào và să tác 
động cûa kháng sinh (Costertonet al., 1999). 
DþĆi să bâo vệ cûa lĆp màng sinh học này, vi 
khuèn có thể chống chðu đþĉc kháng sinh ć liều 
cao mà chî vĆi liều kháng sinh bìng 1/1.000 liều 
lþĉng này vi khuèn không nìm trong màng sinh 
học đã bð tiêu diệt (Costertonet al., 1999). 
Thuốc kháng sinh đþĉc dùng phổ biến để 
điều trð các bệnh nhiễm khuèn. Tuy nhiên, cách 
sā dýng kháng sinh hiện nay đþĉc đánh giá là 
chþa hĉp lý, phổ biến nhçt là tình träng läm 
dýng kháng sinh (Lê Vën Nëm và Hoàng Triều, 
2016) đã làm gia tëng tình träng kháng thuốc 
cûa vi khuèn gây bệnh. Ở vi khuèn, hiện tþĉng 
kháng thuốc kháng sinh do gen kháng kháng 
sinh quy đðnh và gen này có thể đþĉc truyền 
ngang giĂa các chûng vi khuèn hoặc bći thăc 
khuèn thể. Ngoài ra, một số vi khuèn trong quá 
trình sinh trþćng và phát triển hình thành màng 
sinh học nên có khâ nëng đề kháng cao vĆi kháng 
sinh mặc dù chúng không mang gen kháng 
kháng sinh. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên 
cĀu mĀc độ kháng thuốc (Nguyễn ĐĀc Hiền, 
2012) và hiện tþĉng kháng kháng sinh trong mối 
tþĄng quan vĆi các gen kháng thuốc (Võ Thành 
Thìn, 2011). Tuy vêy, nghiên cĀu khâ nëng hình 
thành màng sinh học và đánh giá ânh hþćng cûa 
màng sinh học tĆi sĀc đề kháng kháng sinh cûa 
các vi khuèn chþa đþĉc thăc hiện. Xuçt phát tÿ 
nhĂng vçn đề nêu trên, nghiên cĀu này đã chọn 
tý cæu khuèn làm đối tþĉng nghiên cĀu nhìm 
xác đðnh khâ nëng hình thành màng sinh học và 
tìm hiểu tính đề kháng kháng sinh cûa chúng 
nìm trong màng sinh học. 
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Nguyên liệu 
- Chûng vi khuèn Staphylococcus spp. phân 
lêp đþĉc ć đþąng hô hçp cûa lĉn/gà khỏe. 
- Môi trþąng phân lêp và nuôi cçy vi khuèn: 
thäch thþąng (1054500500, Merck), tryptic soy 
broth (BA-257107, BD), yeast extract (LP0021, 
Oxoid). 
- Giçy tèm kháng sinh (Nam Khoa Biotek) 
- Đïa nhăa 96 giếng vô trùng (SPL Life 
Sciences). 
- Hóa chçt dùng trong đðnh lþĉng màng 
sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dðch 1% 
tím kết tinh (crystal violet), dung dðch cồn 80% 
có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate. 
- Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808). 
2.2. Phương pháp 
2.2.1. Phân lập và thuần khiết tụ cầu khuẩn 
Dùng tëm bông vô trùng lçy dðch hæu họng, 
xoang müi cûa gà/lĉn khỏe mänh. Các méu tëm 
bông đþĉc bâo quân trong nþĆc thðt và giĂ ć 4C 
trong suốt quá trình vên chuyển. Các bþĆc phân 
lêp và thuæn khiết vi khuèn hiếu khí đþĉc thăc 
hiện theo quy trình thþąng quy cûa Bộ môn Vi 
sinh vêt - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện 
Nông nghiệp Việt Nam. 
2.2.2. Định lượng màng sinh học 
Đðnh lþĉng khâ nëng sân sinh màng sinh 
học đþĉc thăc hiện trên đïa 96 giếng 
(Stepanovicet al., 2007). Các bþĆc đþĉc tóm tít 
nhþ sau: (i) nuôi cçy vi khuèn trong môi trþąng 
lỏng bìng đïa nhăa vô trùng 96 giếng ć 37oC 
trong vòng 24 gią; (ii) rāa trôi vi khuèn không 
bám vào thành/đáy đïabìng PBS 1x; (iii) cố 
đðnh màng sinh học bìng methanol trong vòng 
20 phút ć nhiệt độ phòng; (iv) nhuộm màng 
sinh học bìng dung dðch tím kết tinh 1%; (v) đo 
mêt độ quang cûa thuốc nhuộm tím kết tinh 
đþĉc giĂ läi trong màng sinh học ć bþĆc sóng 
630 nm; (vi) đánh giá mĀc sân sinh màng sinh 
học theo Stepanovicet al. (2000): ODc = 
ODđc+3SD, trong đó ODc là giá trð OD ngþĈng 
dþĄng tính (cut-off value), ODđc là giá trð OD 
trung bình cûa các méu đối chĀng åm, SD là độ 
lệch chuèn cûa giá trð OD cûa các méu đối 
chĀng âm. Méu dþĄng tính (sân sinh màng 
sinh học) là méu có giá trð ODméu > ODc. MĀc 
täo màng sinh học đþĉc đánh giá nhþ sau: 
không täo màng sinh học (ODméu ≤ ODc), täo 
màng sinh học yếu (ODc < ODméu ≤ 2ODc), 
täo màng sinh học trung bình (2ODc < ODméu 
Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (Biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn (Staphylococcus 
spp.) sản sinh màng sinh học 
746 
≤ 4ODc) và täo màng sinh học mänh (4ODc < 
ODméu). 
2.2.3. Nghiên cứu biến động màng sinh học 
theo thời gian 
Để nghiên cĀu biến động cûa să sân sinh 
màng sinh học theo thąi gian, vi khuèn đþĉc nuôi 
ć các giếng cûa đïa 96 giếng (Stepanovicet al., 
2007) trong điều kiện nuôi tïnh ć 37C. Sau mỗi 4 
gią, loäi bỏ dung dðch trong giếng, rāa để loäi bỏ 
vi khuèn tă do, cố đðnh màng sinh học hình 
thành (nếu có) sau mỗi 4 gią. Đðnh lþĉng màng 
sinh học sân sinh täi mỗi thąi điểm đþĉc thăc 
hiện theo phþĄng pháp trình bày ć mýc 2.2.2. 
2.2.4. Xác định khả năng đề kháng kháng 
sinh 
Nghiên cĀu khâ nëng đề kháng kháng sinh 
cûa vi khuèn nìm trong màng sinh học đþĉc 
thăc hiện theo phþĄng pháp cûa Ceri et 
al.(1999) vĆi một số điều chînh, tóm tít nhþ sau: 
(i) xác đðnh loäi kháng sinh mà vi khuèn phân 
lêp mén câm; (ii) xác đðnh nồng độ kháng sinh 
nhỏ nhçt Āc chế să phát triển cûa vi khuèn 
(MIC); (iii) nuôi cçy tïnh vi khuèn ć đïa 96 
giếng, trong vòng 20 gią để hình thành biofilm; 
(iv) loäi bỏ hoàn toàn vi khuèn không nìm trong 
lĆp biofilm, giĂ läi biofilm; (v) thêm kháng sinh 
ć nồng độ cao hĄn 10 và 100 læn MIC, lþu kháng 
sinh trong vòng 12 gią; (vi) loäi bỏ kháng sinh, 
bổ sung môi trþąng và nuôi thêm trong vòng 24 
gią ć 37C; (vii) thu huyễn dðch vi khuèn ć các 
giếng, đo giá trð OD ć bþĆc sóng 630 nm và xác 
đðnh tỷ lệ số vi khuèn ć các nồng độ kháng sinh 
khác nhau so vĆi giếng đối chĀng vi khuèn 
(không bổ sung kháng sinh). Các bþĆc kể trên 
đþĉc tóm tít ć hình 1. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Định lượng khả năng sản sinh màng 
sinh học của tụ cầu khuẩn 
Nghiên cĀu này đþĉc thăc hiện nhìm xác 
đðnh khâ nëng sân sinh màng sinh học cûa vi 
khuèn và trâ ląi câu hỏi vi khuèn nìm trong 
màng sinh học đề kháng nhþ thế nào vĆi loäi 
kháng sinh mà vi khuèn ć däng tă do mén câm. 
Do vêy, tý cæu khuèn (Staphylococcus spp.) đã 
đþĉc lăa chọn để nghiên cĀu bći đåy là loäi vi 
khuèn thþąng gặp, dễ phân lêp bìng môi trþąng 
nuôi cçy thông thþąng, có thể nhên biết thông 
qua màu síc khuèn läc và hình thái đặc trþng 
dþĆi kính hiển vi quang học. Đã có 31 chûng tý 
cæu khuèn thuæn khiết đþĉc lăa chọn để nghiên 
cĀu khâ nëng sân sinh màng sinh học, vĆi kết 
quâ đþĉc minh họa ć hình 2. 
Hình 1. Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh 
Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng 
747 
Ghi chú: Mỗi chủng tụ cầu được nuôi ở 4 giếng (theo cột). Các 
giếng đối chứng âm (Đ.c) được đóng khung. Mẫu hình thành màng 
sinh học ở mức mạnh (M), trung bình (TB), yếu (Y) và không hình 
thành (-). 
Hình 2. Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn 
Kết quâ cho thçy8 giếng đối chĀng âm (chî 
có môi trþąng nuôi vi khuèn) có hiện tþĉng giĂ 
màu thuốc nhuộm rçt ít. Ở các giếng nuôi cçy vi 
khuèn, màu thuốc nhuộm tím kết tinh đþĉc giĂ 
läi ć các mĀc độ khác nhau (Hình 2). Một số 
méu có màu giống đối chĀng åm và đþĉc đánh 
giá âm tính (không hình thành màng sinh học); 
một số méu đþĉc ký hiệu bìng chĂ cái Y, TB và 
M là các méu có hiện tþĉng giĂ màu thuốc 
nhuộm và đþĉc đánh giá dþĄng tính ć các mĀc 
læn lþĉt là yếu, trung bình và mänh. Hình ânh 
màng sinh học sân sinh bći tý cæu khuèn đþĉc 
minh họa ć hình 3. 
Ở giếng đối chĀng âm (Hình3D) không có să 
phát triển cûa vi khuèn và không có hiện tþĉng 
giĂ màu thuốc nhuộm tím kết tinh. Trong khi 
đó, ć giếng có màng sinh học đþĉc đánh giá hình 
thành ć mĀc mänh (Hình3A) và trung bình 
(Hình3B) có thể thçy các mâng/đám vi khuèn 
(müi tên) giĂ màu thuốc nhuộm bám ć đáy 
giếng. Giếng ć hình 3C có să hình thành màng 
sinh học ć mĀc yếu và không quan sát đþĉc các 
mâng vi khuèn bám ć đáy giếng. 
Hiện nay, nghiên cĀu khâ nëng hình thành 
màng sinh học cûa vi khuèn đþĉc chia thành hai 
nhóm chính. Nhóm đðnh tính (phát hiện có/ 
không să hình thành màng sinh học) gồm: (i) 
phþĄng pháp ống nghiệm (tube method) đþĉc 
phát triển tÿ nëm 1982 (Christensen, 1982) và 
một số câi tiến sau này (Almshawit et al., 2014; 
Paytubi et al., 2014), (ii) phþĄng pháp thā khâ 
nëng täo chçt nhày (slime) trên thäch bổ sung đỏ 
Congo (Freeman et al., 1989;Darwish, 2013). 
Nhóm đðnh lþĉng (xác đðnh mĀc độ hình thành 
màng sinh học) vĆi phþĄng pháp đïa nhăa 
(microtiter plate test) (Stepanovic et al., 
2000)đþĉc dùng phổ biến. Ngoài ra, đối vĆi 
Staphylococcus aureus và các chûng tý cæu khuèn 
không gåy đông vón huyết tþĄng, nghiên cĀu să 
hình thành màng sinh học có thể đþĉc thăc hiện 
gián tiếp thông qua xác đðnh să có mặt cûa các 
gen quyết đðnh khâ nëng sân sinh màng sinh học, 
nhþ gen eno, icaA, icaD và bap (Darwish, 2013). 
Trong nghiên cĀu này, phþĄng pháp đïa nhăa 
(Stepanovic et al., 2007) đã đþĉc chọn bći có thể 
dùng các hóa chçt thông dýng (tím kết tinh) để 
Đ.c
M
MTB (-)Y
MY
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (Biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn (Staphylococcus 
spp.) sản sinh màng sinh học 
748 
nhuộm màng sinh học và cho phép đðnh lþĉng 
khâ nëng sân sinh màng sinh học ć các mĀc 
mänh, trung bình, yếu và không hình thành. Để 
làm rõ mĀc hình thành màng sinh học (phân ánh 
gián tiếp qua lþĉng thuốc nhuộm đþĉc giĂ läi), 
mêt độ quang cûa thuốc nhuộm trong mỗi giếng 
đã đþĉc đo và so sánh vĆi giá trð ODc, 2ODc, 
4ODc cûa đối chĀng åm để xác đðnh méu hình 
thành/không hình thành, cüng nhþ mĀc độ sân 
sinh màng sinh học (Hình 4). 
Ghi chú: Sự hình thành màng sinh học được đánh giá 
ở mức mạnh (A), trung bình (B) và yếu (C) so với đối 
chứng âm (D) không hình thành màng sinh học. 
Hình 3. Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (100X) 
Ghi chú: Do mỗi chủng vi khuẩn được nuôi ở 4 giếng nên giá trị OD của 
màu thuốc nhuộm giữ trong màng sinh học được biểu diễn dưới dạng giá 
trị trung bình (chấm tròn) và khoâng biến động (thanh dọc). 
Hình 4. Kết quả định lượng mức sản sinh màng sinh học của tụ cầu khuẩn 
0.000
0.350
0.700
1.050
1.400
1.750
M
1
2
M
1
3
M
1
4
M
1
5
M
1
6
M
1
7
M
1
8
M
1
9
M
2
0
M
2
4
.1
M
2
4
.2
M
2
4
.3
M
2
4
.4
M
3
9
.2
M
3
9
.4
M
4
7
.1
M
4
7
.3
M
4
9
.1
M
4
9
.2
M
5
0
.5
M
5
1
.7
M
5
1
.9
M
5
2
.5
M
5
3
.1
M
5
3
.3
M
5
4
.3
M
5
4
.5
M
5
6
.2
M
5
6
.4
M
5
8
.1
M
5
8
.3
ODc =
2ODc =
4ODc =
(+
) M
ạn
h
(+
) T
ru
n
g
 b
ìn
h
(+
) Y
ếu
Â
m
 tín
h
Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng 
749 
Kết quâ tính giá trð ngþĈng cûa đối chĀng âm 
cho giá trð ODc = 0,350. Kết quâ ć hình 4 cho thçy 
có 16/31 méu (chiếm 51,61%) có khâ nëng hình 
thành màng sinh học ć 3 mĀc: mänh, trung bình 
và yếu. Có 15/31 méu đþĉc đánh giá là không sân 
sinh màng sinh học. Tý cæu khuèn là loäi vi 
khuèn thþąng gặp ć ngoài môi trþąng, trên cĄ thể 
động vêt khỏe mänh hoặc động vêt míc bệnh. Một 
số nghiên cĀu trên thế giĆi cho thçy có khoâng 
37,5-57% số chûng tý cæu khuèn (phân lêp đþĉc 
tÿ nhiều loäi méu khác nhau) có khâ nëng sân 
sinh biofilm (Mirani, 2013;Oliveiraet al., 2006). 
Cùng vĆi nhiều kết quâ đã đþĉc công bố (Oliveira 
et al, 2006, Babraet al., 2013), nghiên cĀu này cho 
thçy khâ nëng sân sinh màng sinh học là phổ biến 
cûa tý cæu khuèn. 
3.2. Sự hình thành màng sinh học theo thời 
gian của tụ cầu khuẩn 
Để lăa chọn đþĉc thąi điểm tý cæu khuèn 
sân sinh màng sinh học căc đäi phýc vý cho 
nghiên cĀu tính đề kháng kháng sinh, cæn thiết 
phâi làm rõ đặc điểm hình thành màng sinh học 
theo thąi gian. Trên cĄ sć kết quâ nghiên cĀu về 
khâ nëng hình thành màng sinh học (Hình 4), 7 
chûng vi khuèn sân sinh màng sinh học ć các 
mĀc khác nhau đþĉc chọn để nghiên cĀu. Hình 
5 là ânh chýp đïa nhuộm màng sinh học theo 
thąi gian (tÿ 4 đến 40 gią sau nuôi vi khuèn). 
Ở giếng đối chĀng (Đ.c) và méu M12 (đã 
đþĉc xác đðnh không hình thành màng sinh học, 
trình bày ć hình 4), täi tçt câ các thąi điểm thu 
méu (tÿ 4 gią đến 40 gią) giá trð OD cûa thuốc 
nhuộm tím kết tinh giĂ läi trong giếng đều thçp 
hĄn giá trð ngþĈng ODc và không có să biến 
động trong suốt thąi gian theo dõi (Hình5). Nói 
cách khác, méu này không có să hình thành 
màng sinh học theo thąi gian. Đối vĆi méu 
M49.1 và M24.2 (đã đþĉc xác đðnh sân sinh 
màng sinh học ć mĀc yếu, hình 4), giá trð OD 
cûa thuốc nhuộm giĂ läi trong giếng ít biến 
động theo thąi gian (Hình5). Ngþĉc läi, vĆi các 
méu đþĉc xác đðnh hình thành biofilm ć mĀc 
trung bình và mänh (M47.1, M54.3 và M49.2), 
các giá trð OD có xu hþĆng tëng dæn trong 
khoâng 4 gią đến 20 gią, sau đó giâm (tÿ 24 gią 
đến 40 gią). 
Kết quâ cho thçy să hình thành màng sinh 
học là một quá trình động và phý thuộc vào thąi 
gian. Cüng dễ nhên thçy màng sinh học sân sinh 
không luôn luôn tþĄng quan tỷ lệ thuên vĆi thąi 
gian nuôi cçy tïnh vi khuèn (màng sinh học hình 
Ghi chú: Màng sinh học được xác định thông qua hiện tượng giữ 
màu thuốc nhuộm trong giếng. Màu thuốc nhuộm càng đậm tương 
ứng với màng sinh học hình thành càng mạnh. 
Hình 5. Sự hình thành màng sinh học theo thời gian 
M49.2
M54.3
M47.1
Đ.c
M12
M52.2
M24.2
M49.1
4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h
Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (Biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn (Staphylococcus 
spp.) sản sinh màng sinh học 
750 
Ghi chú: 31 chủng tụ cầu khuẩn được thử tính mẫn câm với 8 loại kháng sinh: 
Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin 
(Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và Trimethprime/ sulfamethoxazol (Bt). 
Với mỗi loại kháng sinh, đường nét đứt màu đỏ phân chia ranh giới giữa khâ năng 
kháng (phía bên trái) và tính mẫn câm (phía bên phâi). 
Hình 6. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của tụ cầu khuẩn 
thành ć mĀc căc đäi sau đó giâm xuống). Kết quâ 
này là do (i) să giâm theo thąi gian các chçt dinh 
dþĈng có trong giếng nuôi vi khuèn và do (ii) song 
song vĆi quá trình täo màng sinh học luôn có hiện 
tþĉng phá vĈ một phæn cçu trúc màng sinh học để 
giâi phóng vi khuèn khỏi màng. 
Kết quâ nghiên cĀu công bố nëm 2006 
(Hola, 2006) về ânh hþćng cûa thąi gian, chçt 
dinh dþĈng và nhiệt độ đến să hình thành 
biofilm cho thçy vi khuèn Staphylococcus 
epidermidis hình thành màng sinh học rçt chêm 
theo thąi gian ć điều kiện nuôi cçy là 25oC. 
Ngþĉc läi, ć 37oC, vi khuèn hình thành màng 
sinh học một cách nhanh chóng (sau nuôi 
khoâng 2-4 gią), lĆp màng sinh học này hoàn 
chînh sau nuôi cçy tÿ 12-14 gią, sau đó giâm 
dæn nếu tiếp týc duy trì tÿ 34-42 gią. Nhþ vêy, 
kết quâ trình bày ć hình 5 là tþĄng đồng khi 
cüng chî ra să biến động cûa lĆp màng sinh học 
đþĉc hình thành theo thąi gian. 
3.3. Khả năng đề kháng kháng sinh của tụ 
cầu khuẩn sản sinh màng sinh học 
Để nghiên cĀu ânh hþćng cûa màng sinh 
học tĆi khâ nëng đề kháng kháng sinh, trþĆc hết 
cæn phâi tìm đþĉc loäi kháng sinh mà vi khuèn 
ć däng tă do mén câm. Tham khâo cĄ sć dĂ liệu 
cûa EUCAST về các loäi kháng sinh mà tý cæu 
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Ne (30µg)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Dx (30µg)
0
5
10
15
20
25
30
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Pn (10UI)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Te (30µg)
0
1
2
3
4
5
6
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Kn (30µg)
0
1
2
3
4
5
6
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Ge (10µg)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Nr (10µg)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
<
=
1
0
1
2
1
4
1
6
1
8
2
0
2
2
2
4
2
6
2
8
3
0
Bt (1,25/23,75µg)
Số
 lư
ợ
n
g
 c
h
ủ
n
g
 v
i k
h
u
ẩ
n
Số
 lư
ợ
n
g
 c
h
ủ
n
g
 v
i k
h
u
ẩ
n
Số
 lư
ợ
n
g
 c
h
ủ
n
g
 v
i k
h
u
ẩ
n
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng 
751 
Bảng 1. Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn 
Mẫu 
thử nghiệm 
Nồng độ kháng sinh 
Đối chứng 
100 MIC 10 MIC 1 MIC 0 MIC 
M24.1 0,238 0,227 0,513 1,646 0,042 
M24.2 0,187 0,186 0,325 1,631 0,043 
M39.2 0,312 0,259 0,608 1,631 0,044 
M47.1 0,157 0,347 0,437 1,614 0,042 
M49.1 0,216 0,292 0,615 1,649 0,032 
M49.2 0,227 0,272 0,415 1,671 0,040 
Trung bình 0,223 0,264 0,485 1,640 0,041 
khuèn mén câm (The European Committee on 
Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), tính 
mén câm vĆi một số loäi kháng sinh đã đþĉc thā 
và trình bày ć hình 6. 
Kết quâ hình 6 cho biết các chûng tý cæu 
khuèn có tính mén câm và kháng không giống 
nhau vĆi mỗi loäi kháng sinh. Tçt câ 31/31 
chûng đều kháng penicillin (đþąng kính vòng vô 
khuèn <26 mm, theo khuyến cáo cûa EUCAST). 
Kết quâ này phù hĉp vĆi đặc điểm cûa các 
chûng tý cæu khuèn đều sân sinh enzyme 
penicillinase. Ngoài ra, 31/31 chûng tý cæu 
khuèn này còn kháng tetracycline. VĆi 
norfloxacin, đa số các chûng tý cæu khuèn 
(22/31 chûng) mén câm (đþąng kính vòng vô 
khuèn >18 mm, theo khuyến cáo cûa EUCAST). 
Trên cĄ sć phån tích trên, norfloxacin đã 
đþĉc chọn để nghiên cĀu khâ nëng đề kháng 
kháng sinh ć nồng độ cao gçp 10 læn và 100 læn 
nồng độ tối thiểu Āc chế vi khuèn (MIC) để tác 
động lên vi khuèn nìm trong lĆp màng sinh 
học. Sau 12 gią duy trì kháng sinh trong giếng 
nuôi vi khuèn, bổ sung môi trþąng không có 
kháng sinh và tiếp týc nuôi trong vòng 24 gią. 
Kết quâ xác đðnh khâ nëng hồi phýc cûa 6 
chûng tý cæu khuèn nìm trong màng sinh học 
sau khi chðu tác động cûa kháng sinh đþĉc 
trình bày ć bâng 1. 
Ở các méu đối chĀng (không có vi khuèn), 
môi trþąng nuôi không có hiện tþĉng vèn đýc, 
vĆi giá trð OD ć bþĆc sóng 630 nm (OD630) tÿ 
0,032 đến 0,044 (cột 6, bâng 1). Trong khi đó, ć 
các méu nuôi vi khuèn nìm trong lĆp màng 
sinh học (sau thąi gian tác động cûa kháng 
sinh) có hiện tþĉng vèn đýc, vĆi giá trð OD630 
tëng tỷ lệ nghðch vĆi nồng độ kháng sinh. Ở 
nồng độ kháng sinh 100x, 10x và 1x, đêm độ vi 
khuèn giâm xçp xî 7,4 læn (1,640/0,223), 6,2 
læn (1,640/0,264) và 3,4 læn (1,640/0,485) so vĆi 
đêm độ vi khuèn ć giếng không có kháng sinh 
(0x). Kết quâ ć bâng 1 chĀng tỏ còn vi khuèn 
sống sót trong lĆp màng sinh học sau thąi gian 
tác động cûa kháng sinh. Nói cách khác, vi 
khuèn nìm trong màng sinh học đề kháng vĆi 
nồng độ kháng sinh cao gçp 10 læn và 100 læn 
nồng độ MIC. 
Trong một công bố về khâ nëng đề kháng 
kháng sinh cûa Staphylococcus aureus, tác giâ 
Urish đã rút ra kết luên: Să có mặt cûa kháng 
sinh (cefazolin) ć các nồng độ cao gçp 2, 20 và 
200 læn chî làm giâm lþĉng mĀc hình thành 
màng sinh học mà không thể loäi bỏ đþĉc hoàn 
toàn màng sinh học (Urishet al., 2016). Đáng 
chú ý, tỷ lệ vi khuèn nìm trong màng sinh học 
sống sót dao động tÿ 2,0% đến 57,9% sau khi 
chðu tác động cûa 3 loäi kháng sinh là cefazolin, 
gentamicin và vancomycin ć nồng độ gçp 10 læn 
nồng độ tối thiểu Āc chế vi khuèn (Urishet al, 
2016). So sánh vĆi kết quâ kể trên, kết quâ cûa 
nghiên cĀu này là phù hĉp khi chĀng minh đþĉc 
khâ nëng đề kháng cao vĆi kháng sinh cûa vi 
khuèn nìm trong lĆp màng sinh học. Do đó, cæn 
phát triển nghiên cĀu theo hþĆng tìm kiếm hóa 
chçt hoặc thâo dþĉc để kết hĉp vĆi kháng sinh 
nhìm làm giâm sĀc đề kháng kháng sinh cûa vi 
khuèn hình thành màng sinh học. 
Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (Biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của tụ cầu khuẩn (Staphylococcus 
spp.) sản sinh màng sinh học 
752 
4. KẾT LUẬN 
Có 51,61% số chûng tý cæu khuèn phân lêp 
sân sinh màng sinh học ć các mĀc mänh, trung 
bình và yếu. Màng sinh học đþĉc hình thành là 
kết quâ cûa quá trình động. VĆi các chûng tý 
cæu khuèn phân lêp, màng sinh học sân sinh 
tëng trong khoâng 4 gią đến 20 gią, sau đó giâm 
trong khoâng 24 gią đến 40 gią. Tý cæu khuèn 
nìm trong màng sinh học đề kháng vĆi nồng độ 
kháng sinh cao gçp 10 læn và 100 læn nồng độ 
tối thiểu Āc chế vi khuèn ć däng tă do. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Almshawit H., I. Macreadie, D. Grando (2014). A 
simple and inexpensive device for biofilm analysis. 
J Microbiol Methods, 98: 59-63. 
Babra C., J.G. Tiwari, G. Pier, T.H. Thein, R. Sunagar, 
S. Sundareshan, S. Isloor, N.R. Hegde, S. de Wet, 
M. Deighton, J. Gibson, P. Costantino, J. 
Wetherall, T. Mukkur (2013). The persistence of 
biofilm-associated antibiotic resistance of 
Staphylococcus aureus isolated from clinical 
bovine mastitis cases in Australia. Folia Microbiol 
(Praha), 58: 469-474. 
Ceri H., M.E. Olson, C. Stremick, R.R. Read, D. 
Morck, A. Buret (1999). The Calgary Biofilm 
Device: new technology for rapid determination of 
antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. 
Clin. Microbiol, 37: 1771-1776. 
Christensen G.D., W.A. Simpson, A.L. Bisno, E.H. 
Beachey (1982). Adherence of slime-producing 
strains of Staphylococcus epidermidis to smooth 
surfaces. Infection and Immunity, 37: 318-326. 
Costerton J.W., P.S. Stewart, E. P. Greenberg (1999). 
Bacterial biofilms: a common cause of persistent 
infections. Science, 284: 1318-1322. 
Darwish S.F., H.A. Asfour (2013). Investigation of 
biofilm forming ability in Staphylococci causing 
bovine mastitis using phenotypic and genotypic 
assays. Scientific World Journal, 5: 378-492. 
Donlan R.M. (2002). Biofilms: Microbial life on 
surfaces. Emerging Infectious Diseases, 8(9): 881-
890. 
Freeman D.J., F.R. Falkiner, C.T. Keane (1989). New 
method for detecting slime production by 
coagulase negative staphylococci. J. Clin. Pathol, 
42: 872-874. 
Hola V., F. Ruzicka, M. Votava (2006). The dynamics 
of Staphylococcus epidermidis biofilm formation 
in relation to nutrition, temperature and time. 
Scripta Medica, 79: 169-174. 
Lê Văn Năm và Hoàng Triều (2016). Thuốc thú y và 
một số tồn tại trong quá trình sử dụng. Tạp chí 
Khoa học kỹ thuật Thú y, 23: 85-89. 
Mirani Z.A., M. Aziz, M.N. Khan, I. Lal, N.U. Hassan, 
and S.I. Khan (2013). Biofilm formation and 
dispersal of Staphylococcus aureus under the 
influence of oxacillin. Microb. Pathog., 6: 66-72. 
Nguyễn Đức Hiền (2012). Tình hình nhiễm và mức độ 
kháng thuốc của Salmonella spp. phân lập từ vịt và 
môi trường nuôi vịt tại thành phố Cần Thơ. Tạp chí 
Khoa học, 22: 1-7. 
Oliveira M., R. Bexiga, S.F. Nunes, C. Carneiro, L.M. 
Cavaco, F. Bernardo and C.L. Vilela (2006). 
Biofilm-forming ability profiling of Staphylococcus 
aureus and Staphylococcus epidermidis mastitis 
isolates. Vet. Microbiol, 118: 133-140. 
Paytubi S., P. Guirado, C. Balsalobre and C. Madrid 
(2014). An improved and versatile methodology to 
quantify biofilms formed on solid surfaces and 
exposed to the air-liquid interphase. J. Microbiol 
Methods, 103: 77-79. 
Stepanovic S., D. Vukovic, I. Dakic, B. Savic and M. 
Svabic-Vlahovic (2000). A modified microtiter-plate 
test for quantification of staphylococcal biofilm 
formation. J Microbiol Methods, 40: 175-179. 
Stepanovic S., D. Vukovic, V. Hola, G. Di Bonaventura, 
S. Djukic, I. Cirkovic và F. Ruzicka (2007). 
Quantification of biofilm in microtiter plates: 
overview of testing conditions and practical 
recommendations for assessment of biofilm 
production by staphylococci. APMIS, 115: 891-899. 
Stewart P.S. and M.J. Franklin (2008). Physiological 
heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol, 
6: 199-210. 
The European Committee on Antimicrobial 
Susceptibility Testing (2017). Breakpoint tables for 
interpretation of MICs and zone diameters. http: 
//www.eucast.org, Version 7.0. 
Thornton R.B., P.J. Rigby, S.P. Wiertsema, P. Filion, J. 
Langlands, H.L. Coates, S. Vijayasekaran, A.D. 
Keil and P.C. Richmond (2011). Multi-species 
bacterial biofilm and intracellular infection in otitis 
media. BMC Pediatr, 11: p. 94. 
Urish K.L., P.W. DeMuth, B.W. Kwan, D.W. Craft, D. 
Ma, H. Haider, R.S. Tuan, T.K. Wood and C.M. 
Davis (2016). Antibiotic-tolerant Staphylococcus 
aureus biofilm persists on arthroplasty materials. 
Clin Orthop Relat Res., 474: 1649-1656. 
Võ Thành Thìn (2011). Phân tích một số gen kháng 
kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con 
mắc bệnh tiêu chảy. Tạp chí Khoa học kỹ thuật 
Thú y, 18: 20-25. 
Yang L., Y. Liu, H. Wu, N. Hoiby, S. Molin and Z.-j. 
Song (2011). Current understanding of multi-
species biofilms. Int. J. Oral. Sci., 3: 74-81.