Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh của cao đặc testin CT3 trên động vật thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG SINH TINH 
CỦA CAO ĐẶC TESTIN CT3 TRÊN 
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 	BỘ QUỐC PHÒNG 
HỌC VIỆN QUÂN Y
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG SINH TINH 
CỦA CAO ĐẶC TESTIN CT3 TRÊN 
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
Chuyên ngành: Dược lý và Độc chất
Mã số: 9720118
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Vũ Mạnh Hùng
2. PGS.TS Vũ Văn Điền
HÀ NỘI - 2021
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
	Phó giáo sư, Tiến sĩ Vũ Mạnh Hùng người Thầy đáng kính với lòng nhiệt tình luôn dành thời gian và công sức để động viên giúp đỡ tôi, trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này.
	Phó giáo sư, Tiến sĩ Vũ Văn Điền người Thầy tâm huyết, tận tình luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, giúp đỡ cũng như động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án này.
Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Ngân là người Thầy, người anh đã trực tiếp hướng dẫn cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu chuyên ngành Dược lý - Độc chất và cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình hoàn thành luận án này.
	Tôi xin chân thành cảm ơn:
	Ban Giám đốc, phòng Đào tạo Sau Đại học - Học Viện Quân Y đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
	Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, các Giảng viên và kỹ thuật viên đã chia sẻ kinh nghiệm, tư vấn chuyên môn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình triển khai các hoạt động nghiên cứu của đề tài luận án.
	Ban Giám hiệu, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Bộ môn Mô phôi, cùng các đồng nghiệp - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên nơi tôi đang công tác đã luôn động viên, hỗ trợ để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập.
	Từ đáy lòng mình, tôi xin gửi lòng cảm ơn đến tất cả những người thân trong gia đình. Bố mẹ hai bên đã luôn bên cạnh, hỗ trợ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống. Người chồng, người bạn tri kỉ luôn bên tôi, hỗ trợ tôi trong sự nghiệp cũng như cuộc sống gia đình. Hai thiên thần bé nhỏ của tôi: Châu Minh Nguyệt, Châu Vân Long, hai con là động lực để tôi phấn đấu trên con đường sự nghiệp của mình.
	Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả
Nguyễn Thị Phương Thảo
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan 
Luận án “Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh của cao đặc Testin CT3 trên động vật thực nghiệm” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn.
Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và được công bố một phần trong các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng được công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc các công trình nghiên cứu khoa học của các tác giả khác. Nếu có điều gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả
Nguyễn Thị Phương Thảo
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
AR
Androgen receptor
cGMP
Guanosine phosphat
Cs
Cộng sự
CT3
Công thức 3
DĐVN
Dược điển Việt Nam
DHT
Dihydrotestosteron
DNA
Deoxyribonucleic acid
DV
Dương vật
eNOS
Endothelial nitric oxid
FSH
Follicle stimulating hormon
GnRH
Gonadotropin releasing hormon
Gy
Gray (đơn vị đo lượng hấp thụ bức xạ ion hóa)
ICP
Intracavernous pressure (áp lực trong thể hang)
LD
Lethal dose (liều gây chết)
LH
Luteinising hormon 
NADPH-d
Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat diaphorase
NCKH
Nghiên cứu khoa học
NO
Nitric oxid
NOS
Nitric oxid synthase
NST
Nhiễm sắc thể
OECD
Organisation for Economic Co-operation and Development (Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế)
OST
Ống sinh tinh
PDE-5
Phosphodiesterase-5
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
ROS
Phản ứng oxy hóa (Reactive oxygen species)
SGTT	
Suy giảm tinh trùng
SHBG
Sex hormon binding globulin
TLCT
Trọng lượng cơ thể
TN
Thí nghiệm
WHO
World health organization (Tổ chức Y tế thế giới)
YHCT
Y học cổ truyền
YHHĐ
Y học hiện đại
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
2.1. 	Thang điểm Johnsen	56
2.2. 	Thang điểm Mustafa	62
3.1. 	Kết quả đánh giá độc tính cấp của Testin CT3	69
3.2. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến trọng lượng cơ thể thỏ	71
3.3. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến số lượng hồng cầu thỏ	72
3.4. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến huyết sắc tố	73
3.5. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến số lượng bạch cầu thỏ	74
3.6. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến số lượng tiểu cầu	75
3.7. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến hoạt độ AST	76
3.8. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến hoạt độ ALT	77
3.9. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến nồng độ ure	78
3.10. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến creatinin	79
3.11. 	Chỉ số phôi thai của thế hệ P mang thai F1	82
3.12. 	Chỉ số phôi thai của thế hệ F1 mang thai F2	83
3.13. 	Ảnh hưởng Testin CT3 đến sự sinh con thế hệ P	83
3.14. 	Ảnh hưởng Testin CT3 đến sự sinh con thế hệ F1	84
3.15. 	Ảnh hưởng đến trọng lượng trên mô hình stress nhiệt	84
3.16. 	Tác dụng của Testin CT3 lên trọng lượng cơ quan sinh dục chuột suy giảm sinh sản bằng stress nhiệt	85
3.17. 	Tác dụng Testin CT3 đối với mức độ di động của tinh trùng	87
3.18. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 tới trọng lượng cơ thể chuột trên mô hình gây suy giảm sinh sản bằng stress giam giữ	92
3.19. 	Tác dụng của Testin CT3 lên trọng lượng tinh hoàn, túi tinh chuột gây suy giảm sinh sản bằng stress giam giữ	93
3.20. 	Tác dụng của Testin CT3 lên trọng lượng tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, cơ nâng hậu môn trên mô hình stress giam giữ	94
3.21. 	Tác dụng của Testin CT3 đến kích thước ống sinh tinh	95
3.22. 	Đánh giá ống sinh tinh theo thang điểm Mustafa	98
3.23. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 đến trọng lượng chuột trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính androgen	101
3.24. 	Ảnh hưởng Testin CT3 đến trọng lượng quy đầu, tuyến tiền liệt trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính androgen	102
3.25. 	Ảnh hưởng Testin CT3 đến trọng lượng túi tinh, tuyến Cowper, cơ nâng hậu môn trong đánh giá hoạt tính androgen	103
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.1. 	Mối tương quan giữa liều dùng và tỷ lệ chuột chết trong 72h	70
3.2. 	Ảnh hưởng của Testin CT3 lên khả năng mang thai	81
3.3. 	Ảnh hưởng Testin CT3 đến số lượng tinh trùng	86
3.4. 	Nồng độ testosteron	88
3.5. 	Tỷ lệ nhóm điểm theo Johnsen	89
3.6. 	Biểu đồ Boxplot phân bố điểm Johnsen	90
3.7. 	Biểu đồ Boxplot phân bố điểm Mustafa của 4 lô nghiên cứu	99
3.8. 	Tỷ lệ nhóm điểm theoMustafa	100
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1. 	Mặt cắt ngang ống dẫn tinh	3
1.2. 	Quá trình sinh tinh	4
1.3. 	Hệ thống sinh sản chuột đực (A) và người (B)	12
1.4. 	Tinh hoàn chuột đực (A) và tinh hoàn người (B)	13
1.5. 	Ống sinh tinh chuột (A) và người (B)	14
1.6. 	Tuyến tiền liệt chuột	17
1.7. 	Tuyến hành niệu đạo chuột	19
1.8. 	Giải phẫu vùng tuyến bao quy đầu chuột	20
1.9. 	Niệu đạo dương vật (A) và niệu đạo màng (B)	21
1.10. 	Dương vật chuột	22
2.1. 	Tóm tắt quy trình sản xuất Testin CT3	45
2.2. 	Sơ đồ các bước nghiên cứu	47
2.3. 	Sơ đồ nghiên cứu độc tính cấp của Testin CT3	49
2.4. 	Sơ đồ nghiên cứu độc tính bán trường diễn Testin CT3	51
2.5. 	Gây tổn thương tinh hoàn bằng ngâm vào nước nóng 42ºC	53
2.6. 	Sơ đồ nghiên cứu theo mô hình stress nhiệt	55
2.7. 	Bình ổn nhiệt vạn năng	57
2.8. 	Buồng đếm Makler	58
2.9. 	Máy bách phân bạch cầu	58
2.10. 	Gây suy giảm sinh sản chuột bằng stress giam giữ	60
2.11. 	Sơ đồ nghiên cứu theo mô hình stress giam giữ	61
2.12. 	Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính androgen	66
2.14. 	Kim cho chuột nhắt và chuột cống uống thuốc	67
2.15. 	Quy trình cho chuột uống thuốc	68
3.1. 	Ảnh mô bệnh học gan thỏ thực nghiệm	80
3.2. 	Ảnh mô bệnh học thận thỏ thực nghiệm	80
3.3. 	Ảnh mô bệnh học lách thỏ thực nghiệm	80
3.4. 	Điểm Johnsen đánh giá ống sinh tinh qua mặt cắt ngang	91
3.5. 	Kích thước OST và lòng OST lô chứng	96
3.6. 	Kích thước OST và lòng OST lô mô hình	96
3.7. 	Kích thước OST và lòng OST lô trị 1	97
3.8. 	Kích thước OST và lòng OST lô trị 2	97
3.9. 	Điểm đánh giá ống sinh tinh qua mặt cắt ngang	101
ĐẶT VẤN ĐỀ
	Xã hội ngày một phát triển nhưng kèm theo công nghiệp hóa, hiện đại hóa làm ô nhiễm môi trường, stress, lạm dụng hóa chất... Những yếu tố đó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên quá trình sản sinh và trưởng thành của tinh trùng, khiến cơ chế bệnh sinh của suy giảm tinh trùng rất phức tạp.
	Khả năng sinh sản của nam giới thông qua sự sản sinh tinh dịch bao gồm tinh trùng có chất lượng và bình thường về số lượng, phù hợp với mong muốn và khả năng giao phối [1]. Có rất nhiều lý do dẫn đến xuất hiện vô sinh ở nam giới như rối loạn di truyền, tắc nghẽn hay biến dạng ống sinh tinh, giảm sản xuất tinh trùng, giảm chất lượng các thông số tinh dịch, rối loạn chức năng cương dương và bệnh liệt dương [2]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các thông số tinh dịch ở 25 - 40% nam thanh niên thấp hơn so với tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới [3]. Nồng độ tinh trùng thấp là nguyên nhân dẫn đến vô sinh ở nam giới [4]. Trong đó suy giảm tinh trùng là một trong những nguyên nhân trực tiếp gây vô sinh. Tình trạng suy giảm tinh trùng ngày nay có xu hướng gia tăng, tuy không gây nguy hiểm và không phải là bệnh lý cấp tính cần xử trí ngay, nhưng ảnh hưởng nhiều đến tâm lý cũng như giảm chất lượng cuộc sống hàng ngày của bệnh nhân. Hiện nay, việc điều trị suy giảm tinh trùng còn gặp nhiều khó khăn do cơ chế bệnh phức tạp, nên mặc dù có nhiều phương pháp điều trị được đưa ra nhưng kết quả còn hạn chế theo từng nguyên nhân.
	Các phương pháp điều trị theo y học hiện đại đã có nhiều thành tựu trong điều trị suy giảm tinh trùng và mang lại một số kết quả nhất định trong cải thiện triệu chứng cũng như chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân, nhưng kết quả không ổn định và có nhiều tác dụng không mong muốn. Các phương pháp điều trị khác nhau như phẫu thuật, hóa chất, thuốc y học cổ truyền sẵn có đều có thể giúp tăng cường khả năng sinh sản. Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam có xu hướng nghiên cứu các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Theo nhiều nghiên cứu, thuốc có nguồn gốc từ dược liệu có ảnh hưởng tích cực đến các thông số tinh trùng [5]. Vì vậy, việc sử dụng các phương thuốc y học cổ truyền trong điều trị suy giảm tinh trùng đã và đang được quan tâm. Các bài thuốc Y học cổ truyền là một trong những phương pháp chữa suy giảm tinh trùng có hiệu quả trên thực tế.
	Cao đặc Testin CT3 (công thức 3) gồm 8 vị dược liệu: bá bệnh, dâm dương hoắc, ba kích, xà sàng tử, bạch tật lê, hoàng kỳ, đương quy, câu kỷ tử. Testin CT3 được thiết kế dựa trên cơ sở lý luận và biện chứng của Y học cổ truyền, có tác dụng bổ thận, sinh tinh, ích khí huyết, điều trị suy giảm chức năng sinh dục nam. Sản phẩm trong nghiên cứu này được bào chế dưới dạng cao đặc với mục đích kết hợp các dược liệu trên sẽ tạo ra tác dụng mạnh hơn và ít độc tính hơn. Do đó để góp phần tạo tiền đề nghiên cứu phát triển bài thuốc này trên thực tiễn, đề tài: “Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh của cao đặc Testin CT3 trên động vật thực nghiệm” được thực hiện nhằm 2 mục tiêu:
Xác định được độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, độc tính sinh sản và phát triển của cao đặc Testin CT3.
Đánh giá được tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh của cao đặc Testin CT3 trên mô hình gây suy giảm sinh sản chuột đực thực nghiệm. 
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Quá trình sinh tinh
Quá trình sinh tinh xảy ra ở các ống sinh tinh trong suốt cuộc đời hoạt động sinh dục của người đàn ông do sự kích thích của hormon hướng sinh dục của thùy trước tuyến yên. Quá trình này bắt đầu từ lúc dậy thì và kéo dài liên tục trong quãng đời còn lại nhưng giảm đáng kể ở tuổi già [6].
Hình 1.1. Mặt cắt ngang ống dẫn tinh 
* Nguồn: theo Guyton A.C và Cs (2011) [6]
* Các bước của quá trình sinh tinh:
Trong suốt quá trình hình thành phôi, từ các tế bào mầm ban đầu phải trải qua rất nhiều giai đoạn trong quá trình biệt hóa để trở thành tinh trùng. Các tế bào mầm nguyên thủy di cư vào tinh hoàn và trở thành các tế bào chưa trưởng thành, còn được gọi là tinh nguyên bào nằm thành 2-3 lớp của mặt trong ống sinh tinh. Đến tuổi dậy thì, các tinh nguyên bào bắt đầu gián phân, tăng sinh và biệt hóa liên tục để hình thành tinh trùng [6]. Hiện tượng này gọi là quá trình sinh tinh, quá trình sinh tinh trải qua 3 giai đoạn:
- Sinh tinh bào: Giai đoạn đầu của quá trình sinh tinh, là quá trình tinh nguyên bào phân chia, sản xuất liên tiếp các thế hệ tế bào và đến cuối cùng tạo thành tinh bào. Quá trình sinh tinh xảy ra trong ống sinh tinh theo hướng hướng tâm, khởi đầu từ các tế bào mầm sinh dục trong ống sinh tinh sẽ biệt hoá thành các tinh nguyên bào, tinh nguyên bào di chuyển từ màng đáy của ống sinh tinh đi vào trung tâm ống sinh tinh. Tinh nguyên bào là những tế bào nhỏ, nằm ở vùng ngoại vi biểu mô tinh, xen giữa màng đáy với tế bào Sertoli . Tinh nguyên bào phân chia gián phân để tăng nhanh về số lượng. Một số tinh nguyên bào biệt hoá thành tinh bào I [6], [7], [8].
Hình 1.2. Quá trình sinh tinh
* Nguồn: theo Guyton A.C và Cs (2011) [6]
	- Giảm phân: là quá trình tinh bào chia đôi qua 2 lần liên tục, quá trình này giảm một nửa nhiễm sắc thể (NST) và DNA trong mỗi tế bào. Ở giai đoạn này, tinh bào I tiến hành giảm phân lần 1 tạo nên 2 tinh bào II, mỗi tinh bào II có bộ NST đơn bội n = 23. Các NST giới tính X và Y cũng phân ly cho hai tinh bào. Tinh bào II vừa được sinh ra sẽ tiến hành giảm phân lần 2 ngay, cuối cùng sản xuất ra tinh tử (tiền tinh trùng) [6], [7], [8].
- Tạo tinh trùng: Tiền tinh trùng hay tinh tử được sinh ra sau giảm phân có bộ NST đơn bội n = 23. Có hai loại tinh tử: loại mang NST X và loại mang NST Y. Tinh tử không phân chia mà trải qua quá trình biệt hoá để trở thành tinh trùng. Tinh tử trưởng thành (tinh trùng chưa trưởng thành) không còn dính với nhau mà tách ra và đi vào lòng ống sinh tinh. Các thành phần không cần thiết sẽ bị loại bỏ trong quá trình biệt hoá và bị các tế bào Sertoli thực bào. Dấu hiệu để nhận biết tinh trùng chưa trưởng thành hoàn toàn là còn giọt bào tương bám quanh cổ tinh trùng [6], [7], [8].
Quá trình sinh tinh xảy ra không đồng thời cũng không đồng bộ ở các ống sinh tinh. Quá trình này xảy ra theo cách liên tiếp, giải thích sự xuất hiện không giống nhau của các pha trong quá trình sinh tinh ở những vị trí khác nhau trong ống sinh tinh. Điều này giải thích tại sao lại có thể gặp tinh trùng ở một số nơi của ống sinh tinh mà chỉ gặp tiền tinh trùng ở các nơi khác [9].
* Tình trùng trưởng thành
	Khoảng thời gian để hoàn tất một chu kỳ tạo tinh trùng khoảng 64 - 72 ngày. Bên cạnh việc diễn ra chậm, thì quá trình sinh tinh xảy ra không đồng thời cũng không đồng bộ ở các ống sinh tinh [9]. 
Các tinh trùng ở tinh hoàn hầu như không di động hoặc di động yếu. Tinh trùng c ... 7). Ascorbic acid reduces redox potential in human spermatozoa subjected to heat - induced oxidative stress, Andrologia. 49(10): 1-8.
157.	Setchell B. P., Bergh A., Widmark A., et al. (1995). Effect of testicular temperature on vasomotion and blood flow, International journal of andrology. 18: 120-126.
158.	Ghasemi N., Babaei H., Azizallahi S., et al. (2009). Effect of long term administration of zinc after scrotal heating on mice spermatozoa and subsequent offspring quality, Andrologia. 41: 222-228.
159.	Ngoula F., Lontio F., Tchoffo H., et al. (2020). Heat induces oxidative stress: Reproductive organ weights and serum metabolite profile, testes structure, and function impairment in male Cavy (Cavia porcellus), Frontiers in Veterinary science. 7: 1-7.
160.	Flanagan S., Moseley P., Buettner G. (1998). Increased flux of free radicals in cells subjected to hyperthermia: detection by electrong paramagnetic resonance spin trapping, Federation of European Biochemical Societies. 431: 285-286.
161.	Koppers A., Deiuliis G., Finnie J., et al. (2008). Significance of mitochondrial reactive oxygen species in the generation of oxidative stress in spermatozoa, Journal clin endocrinol metab. 93(8): 3199-3207.
162.	Marai I., Habeeb A., Gad A. (2002). Rabbit's productive, reproductive and physiological performance traits as affected by heat stress: a review, Livestock science. 78: 71-90.
163.	Agarwal A., Durairajanayagam D., Halabi J., et al. (2014). Proteomics, oxidative stress and male infertility, Reproductive BioMedicne online. 29: 32-58.
164.	Wen Q., Cheng C., Liu Y. (2016). Development, function and fate of fetal Leydig cells, Semin Cell Dev Biol. 59: 89-98.
165.	McBride J., Coward R. (2016). Recovery of spermatogenesis following testosteron replacement therapy or anabolic-androgenic steroid use, Asian journal of Androl. 18: 373-380.
166.	Nguyễn Thành Như (2013). Nam khoa lâm sàng, Nhà xuất bản tổng hợp TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh.
167.	Carreau S., Silandre D., Bourguiba S., et al. (2007). Estrogens and male reproduction: a new concept, Brazilian journal of Medical and Biological research. 40: 761-768.
168.	Tamer S., Yildirim A., Arabaci S., et al. (2019). Treatment with estrogen receptor agonist ERβ improves torsion-induced oxidative testis injury in rats, Life Sciences. 222: 203-211.
169.	Ruwanpura S., Mclachlan R., Meachem S. (2010). Hormonal regulation of male germ cell development, Journal of Endocrinology. 205: 177-131.
170.	Joseph D., O'Brien D., Sullivan P., et al. (1997). Overexpression of androgen-binding protein/sex hormon-binding globulin in male transgenic mice: tissue distribution and phenotypic disorders, Biology of reproduction. 56: 21-32.
171.	Gao j., Zuo Y., So K., et al. (2012). Electroacupuncture enhances spermatogenesis in rats after scrotal heat treatment, Spermatogenesis. 2(1): 52-63.
172.	Snyder P., Peachey H., Berlin J., et al. (2000). Effects of testosterone replacement in Hypogonadal men, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85(8): 2670-2677.
173.	Rehman S., Choe K., Yoo H. (2016). Review on a Traditional Herbal Medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its Traditional Uses, Chemistry, Evidence-Based Pharmacology and Toxicology, Molecules. 21(331): 1-31.
174.	Low B., Das P., Chan K. (2013). Standardized quassinoid-rich Eurycoma longifolia extract improved spermatogenesis and fertility in male rats via the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, Journal of Ethnopharmacology. 145(3): 706-714.
175.	Dohle G., Elzanaty S., Casteren N. (2012). Testicular biopsy: clinical practice and interpretation, Asian journal of Andrology. 14: 88-93.
176.	Teixeira T., Pariz J., Dutra R., et al. (2019). Cut-off values of the Johnsen score and copenhagen index as histopathological prognostic factors for postoperative semen quality in selected infertile patients undergoing microsurgical correction of bilateral subclinical varicocele, Translational Andrology and Urology. 8(4): 346-355.
177.	Paul C., Teng S., Saunders P. (2009). A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death, Biology of reproduction. 80: 913-919.
178.	Chrousos G., Gold P. (1992). The concepts of stress and stress system disorders. Overview of physical and behavioral homeostasis, Journal of the American Medical Association. 267(9): 1244-1252.
179.	Rai D., Bhatia G., Palit G., et al. (2003). Adaptogenic effect of Bacopa monniera (Brahmi), Pharmacology biochemistry and behavior. 75: 823-830.
180.	Rivier C., Rivest S. (1991). Effect of stress on the activity of the Hypothalamic-pituitary-gonadal axis: Peripheral and centrer mechanisms, Biology of reproduction. 45: 523-532.
181.	Pacak K., Palkovits M., Yadid G., et al. (1998). Heterogeneous neurochemical responses to different stressors: a test of Selye's doctrine of nonspecificity, Am Journal Physiol 275: 1247-1255.
182.	Tilbrook A., Turner A., Clarke I. (2000). Effects of stress on reproduction in non-rodent mammals: the role of glucocorticoids and sex differences, Journal of Reproduction and Fertility. 5: 105-113.
183.	Van de Kar L., Blair M. (1999). Forebrain pathways mediating stress-induced hormone secretion, Frontiers in Neuroendocrinology. 20: 1-48.
184.	PaCák K. (2000). Stressor-specific activation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical axis, Physiological research. 49: 11-17.
185.	Yazawa H., Sasagawa I., Ishigooka M., et al. (1999). Effect of immobilization stress on testicular germ cell apoptosis in rats, Human Reproduction. 14(7): 1806-1810.
186.	Maehara K., Hasegawa T., Xiao H., et al. (1999). Cooperative interaction of NF-UB and C/EBP binding sites is necessary for manganese superoxide dismutase gene transcription mediated by lipopolysaccharide and interferon-Q, Federation of European Biochemical Societies. 449: 115-119.
187.	Brann D., Mahesh V. (1991). Role of corticosteroids in female reproduction, FASEB. 5: 2691-2698.
188.	Fenster L., Katz D., Wyrobek A., et al. (1997). Effects of Psychological stress on human semen quality, Journal of Andrology. 18(2): 194-202.
189.	Gao H., Shan L., Monder C., et al. (1996). Suppression of endogenous corticosterone levels in vivo increases the steroidogenic capacity of purified rat Leydig cell in vitro, Endocrinology. 137(5): 1714-1718.
190.	Maric D., Kostic T., Kovacevic R. (1996). Effects of acute and chronic immobilization stress on rat Leydig cell steroidogenesis, Journal Steroid Biochem Mol Biol. 58: 351-355.
191.	Herman J., Adams D., Prewitt C. (1995). Regulatory changes in neuroendocrine stress - intergrative circuitry produced by a variable stress paradigm, Neuroendocrinology. 61(2): 180-190.
192.	Marin M., Cruz F., Planeta C. (2007). Chronic restraint or variable stresses differently affect the behavior, corticosterone secretion and body weight in rats, Physiological and behavior. 90: 29-35.
193.	Ortiz J., Fitzgerald L., Lane S., et al. (1996). Biochemical adaptations in the mesolimbic dopamine system in response to repeated stress, Neuropsycho pharmacology. 14(6): 443-452.
194.	Martí O., Martí J., Armario A. (1994). Effects of chronic stress on food intake in rats: influence of stressor intensity and duration of daily exposure, Physiological and behavior. 55(4): 747-753.
195.	Márquez S., Jaime H., Palacios G., et al. (2003). Body weight gain and diurnal differences of corticosterone changes in response to acute and chronic stress in rats, Psychoneuroendocrinology. 28: 207-227.
196.	Mehfooz A., Wei Q., Zheng K., et al. (2018). Protective roles of Rutin against restraint stress on spermatogenesis in testes of adult mice Tissue and Cell. 50: 133-143.
197.	Carlsen E., Giwercman A., Keiding N., et al. (1992). Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years, BMJ. 305: 609-613.
198.	Swan S., Elkin E., Fenster L. (2000). The question of declining sperm density revisited: An analysis of 101 studies published 1934-1996, Environmental health perspectives. 108(10): 961-966.
199.	Kumar S., Kumari A., Murarka S. (2009). Lifestyle factors in deteriorating male reproductive health, Indian journal of experimental biology. 47: 615-624.
200.	Gao H., Tong M., Hu Y., et al. (2002). Glucocorticoid induces apoptosis in rat Leydig cells, Endocrinology. 143(1): 130-138.
201.	Andersen M., Bignotto M., Machado R., et al. (2004). Different stress modalities result in distinct steroid hormone responses by male rats, Brazilian journal of Medical and Biological research. 37: 791-797.
202.	Palma B., Suchecki D., Tufik S. (2000). Differential effects of acute cold and footshock on the sleep of rats, Brain research. 861: 97-104.
203.	Olawuyi T., Ukwenya V., Jimoh A., et al. (2019). Histomorphometric evaluation of seminiferous tubules and stereological assessment of germ cells in testes following administration of aqueous leaf-extract of Lawsonia inermis on aluminium - induced oxidative stress in adult Wistar rats, JBRA Assisted reproduction. 23(1): 24-32.
204.	Chang M., Kim W., Yang W., et al. (2008). Cytoprotective effects of Morinda officinalis against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in Leydig TM3 cells, Asian J Androl 10(4): 667-674.
205.	Chen T., Xiang J., Wang W. (2016). Effect of Morinda officinalis extract on model rat with cytoxan induced testis injury, Chinese Journal Anatomy. 39: 422-425.
206.	U.S. Environmental Protection Agency (2011). Hershberger Assay, Washington, DC.
207.	Kang I., Kim H., Shin J., et al. (2004). Comparison of anti-androgen activity of flutamid vinclozolin, procymidone, linuron, and p, p'-DDE in rodent 10-day Hershberger assay, Toxicology. 199: 145-159.
208.	Đỗ Thị Nguyệt Quế, Nguyễn Thu Hằng, Vũ Văn Điền (2015). Đánh giá hoạt tính androgen của cao đặc Testin trên chuột cống thực nghiệm, Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc. 3: 16-20.
209.	Nguyễn Mạnh Quân, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương (2008). Nghiên cứu tác dụng của ba kích (Monrida officinalis How) lên sự phát triển của cơ quan sinh dục chuột cống đực, Tạp chí nghiên cứu y học. 53(1): 77-84.
210.	Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Mai Thanh Tâm, Trần Công Luận (2012). Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của ba kích (Morinda officinalis How.), Nghiên cứu y học - Y học TP. Hồ Chí Minh. 16(1): 192-198.
PHỤ LỤC 1
HÌNH ẢNH SO SÁNH GIẢI PHẪU, MÔ HỌC 
CƠ QUAN SINH DỤC GIỮA NGƯỜI VÀ CHUỘT
Hình 1. Ống dẫn tinh người
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
Biểu mô (E), vách cơ (M), hạt sắc tố lipid màu vàng/nâu (L) và (N). Mỗi ống dẫn tinh gồm vách cơ (1) và nếp niêm mạc (2), chất nhầy (3). 
Hình 2. Ống dẫn tinh chuột
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
Ống dẫn tinh chuột gồm cơ trơn (SM) và biểu mô trụ cao (E) và sự bài tiết trong lòng ống (S)
Hình 3. Tuyến tiền liệt người
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
Vùng trung tâm bao quanh ống xuất tinh (ED). Vùng chuyển tiếp (TZ) được phân cách từ vùng ngoại vi (PZ) bằng mô sợi (mũi tên), bao quanh phần niệu đạo (UR) tiền liệt. Tuyền tiền liệt người được bao quanh bởi bao vỏ (C).
Hình 4. Tuyến tiền liệt chuột (A) và người (B)
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
Tuyến tiền liệt được chia ra thành các thùy bao quanh niệu đạo (Ur): túi tinh (SV), thùy trước (AP), thùy lưng (DP), thùy bên (LP), thùy bụng (VP).
Hình 5. Tuyến bao quy đầu chuột
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
(A - nang tuyến, D - ống tiết, SC - tế bào tiết bã nhờn)
Hình 6. Ụ tinh dịch của chuột
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
Hình 7. Niệu đạo dương vật người
Nguồn: Knoblaugh S. và Cs (2018) [13]
(E - biểu mô cột, P - tuyến quanh niệu đạo)
PHỤ LỤC 2
TỔNG QUAN CÁC DƯỢC LIỆU TRONG TESTIN CT3
STT
Dược liệu
Tên khoa học
Bộ phận dùng
Tác dụng dược lý
1
Bá bệnh
Radix Eurycomae longifoliae
Rễ phơi hoặc
sấy khô
- Tăng khả năng sinh sản nam (tăng thể tích tinh dịch, số lượng tinh trùng, khả năng di động tinh trùng), tăng sản xuất testosteron, tăng hành vi tình dục.
- Tác dụng chống sốt rét, ức chế tính độc hại tế bào, kháng khuẩn, chống viêm, chống âu lo, chống đái tháo đường, chống loãng xương
2
Dâm dương hoắc
Herba Epimedii
Toàn bộ cây phần trên mặt đất
- Tăng cường hoạt động tình dục, tăng khả năng sống, cải thiện số lượng tinh trùng trên in vivo và in vitro, tăng trọng lượng bộ phận sinh dục, tăng testosteron, tăng hoạt động hệ nội tiết sinh sản nam, chống oxy hóa, tăng ham muốn tình dục, cải thiện chức năng cương dương
3
Ba kích
Radix Morindae officinalis
Rễ phơi hay
sấy khô
- Tăng số lượng và hoạt động tinh trùng trên chuột gây suy giảm bởi cytoxan. Giảm cytokine, GnRH, FSH, LH, kháng thể kháng tinh trùng, điều hòa testosteron, inhibin B.
4
Xà sàng tử
Fructus Cniddii
Quả già phơi hay sấy khô
- Bổ thận, cường dương, kiểm soát hành vi tình dục và khả năng cương dương, tăng hoạt tính androgen, gonadotropin và nitric oxid synthase.
- Tác dụng trên tim mạch, hô hấp, hệ nội tiết, hệ miễn dịch, bảo vệ thần kinh, chống lo âu, tăng cường trí nhớ, chống viêm và phòng chống ngứa, chống ung thư, bảo vệ gan, chống loãng xương.
5
Bạch tật lê
Fructus Tribuli terrestris
Rễ phơi hay
sấy khô
- Tác dụng với các trường hợp rối loạn cương dương, tăng khả năng di chuyển và số lượng tinh trùng, tăng tinh bào gốc, tinh bào thứ cấp, tinh tử, tế bào Sertoli và tinh nguyên bào. Tăng nồng độ DHT, tăng cường khả năng sinh sản, kích thích tình dục.
- Tác dụng lợi tiểu, chống sỏi niệu, tác dụng trên bệnh đái tháo đường, phòng ngừa và điều trị bệnh tim mạch, bảo vệ tế bào thần kinh, chống ung thư, kháng khuẩn.
6
Hoàng kỳ
Radix Astragali membranacei
Rễ phơi hay
sấy khô
- Tăng cường khả năng miễn dịch, cường tráng cơ thể do tăng sức đề kháng, duy trì cân bằng nội môi, tác dụng như nội tiết tố sinh dục, hưng phấn thần kinh trung ương, thúc đẩy quá trình chuyển hóa, lợi niệu, tăng co bóp cơ tim, hạ áp do giãn mạch ngoại vi, giảm albumin niệu, tăng co bóp tử cung, bảo vệ gan, chống giảm glycogen trong gan, chống viêm, kháng khuẩn.
7
Đương quy
Radix Angelicae sinensis
Rễ phơi hay
sấy khô
- Trên tim nước sắc kích thích tử cung; tinh dầu ức chế trực tiếp an toàn hơn tropin, điều hòa nhịp tim; ức chế giãn mạch vành và dưỡng tim. Trên huyết áp nước sắc làm tăng, tinh dầu làm hạ. Trên thần kinh giúp trấn tĩnh hoạt động của vỏ đại não. Tác dụng trên hiện tượng thiếu vitamin E. Tác dụng kháng khuẩn, giảm cholesterol máu, tăng số lượng hồng cầu (bổ huyết), tăng cường khả năng miễn dịch, giảm tác dụng phụ của thuốc chống ung thư, giảm đau nội tạng, an thần, nhuận tràng, chống viêm, giãn cơ trơn phế quản.
8
Câu kỷ tử
Fructus Lycii
Quả chín phơi hay sấy khô
- Tăng cường miễn dịch không đặc hiệu, nâng cao khả năng thực bào của tế bào thực bào. Tăng cường chức năng tạo máu trên chuột nhắt. Chất Betain có tác dụng kích thích sinh vật cho vào thức ăn gà tăng trọng đẻ trứng nhiều, làm chuột tăng trọng lượng. Betain có tác dụng bảo vệ gan, chống thoái hóa mỡ và hạ đường huyết. Tác dụng làm giảm cholesterol. Nước sắc hạ huyết áp, hưng phấn tử cung cô lập. Ức chế tế bào ung thư trên chuột
PHỤ LỤC 3