Phân lập và xác định serotyp của các chủng vi khuẩn haemophilus parasuis phân lập từ lợn tại tỉnh Thanh hóa, Hưng yên và Hà Nam

Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 12: 1068-1078 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(12): 1068-1078 
www.vnua.edu.vn 
1068 
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SEROTYP CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Haemophilus parasuis 
PHÂN LẬP TỪ LỢN TẠI TỈNH THANH HÓA, HƯNG YÊN VÀ HÀ NAM 
Trương Quang Lâm*, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Huyên 
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 
*Tác giả liên hệ: tqlam@vnua.edu.vn 
Ngày nhận bài: 30.07.2018 Ngày chấp nhận đăng: 05.03.2019 
TÓM TẮT 
Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập và xác định các tuýp huyết thanh (serotyp) của các chủng vi khuẩn 
Haemophilus parasuis phân lập từ lợn nghi mắc bệnh Glasser. Tổng số 205 mẫu bệnh phẩm gồm dịch ngoáy mũi, 
dịch ngoáy khí quản, dịch khớp, tim, phổi thu thập từ 41 lợn thuộc địa bàn 3 tỉnh Thanh Hóa, Hưng Yên, Hà Nam đã 
được sử dụng trong nghiên cứu. Hai mươi hai chủng nghi ngờ đã được phân lập đặc điểm như sau: khuẩn lạc kích 
thước nhỏ, trong suốt, không dung huyết, bắt màu Gram âm, trực khuẩn đa hình thái, catalase, oxidase và yếu tố V 
dương tính, indol và urease âm tính, có khả năng lên men đường glucose, galactose, fructose, sucrose và không 
mọc trên môi trường MacConkey. Có 20/22 chủng phân lập cho kết quả giám định PCR dương tính với H. parasuis. 
Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng phương pháp multiplex PCR (mPCR) trong việc xác định các 
serotyp của vi khuẩn H. parasuis. Kết quả mPCR cho thấy các serotyp (serotyp) của vi khuẩn H. parasuis phân lập 
từ thực địa rất đa dạng. Đáng chú ý, seroype 4, 5 và 1 là phổ biến nhất với tỷ lệ lần lượt 30%, 25% và 15%, tiếp theo 
là serotyp 13 với 5%, serotyp 2 với 5%, các chủng chưa xác định được serotyp chiếm 20%. 
Từ khóa: Haemophilus parasuis, phân lập, PCR, multiplex PCR, serotyp. 
Isolation and Serotyping of Haemophilus parasuis Strains from Pigs Raised 
in the Provinces of Thanh Hoa, Hung Yen, and Ha Nam of Northern Vietnam 
ABSTRACT 
The aim of this study was to determine the serotypes of Haemophilus parasuis strains isolated from suspected 
pig cases of glasser disease. A total of 205 specimens including nasal, trachea, joint fluids, heart and lung collected 
from 41 suspected pigs in Thanh Hoa, Hung Yen and Ha Nam province were used for bacterial isolation and 
identification. The isolates (22 isolates in total) of H. parasuis from pigs suspected of being infected with H. parasuis 
showed the major characteristics of small, transparent, and non-hemolytic colonies, gram negative, pleomorphic rod 
from short to long bacilli, catalase, oxidase and V factor positive, indole and urease negative, and capable of 
fermentating glucose, galactose and fructose, and unable to grow on MacConkey agar. These isolates were 
confirmed by specific PCR as H. parasuis. In the present study, for the first time, we reported the application of 
multiplex PCR assay for serotype determination of H. parasuis isolates from the field in Vietnam. mPCR results 
showed variable distributions in the serotypes of H. parasuis isolated from the field. Remarkably, serotypes 4, 5 and 1 
were the most prevalent with 25%, 25% and 15%, respectively, followed by serotypes 13 and 2 with 5%, and non-
typable serotype with 20%. 
Keywords: Haemophilus parasuis, isolation, PCR, multiplex PCR, serotype. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Bệnh Glasser do vi khuẩn Gram âm từ dịch 
tiết, fibrin bám dính của lợn bị ảnh hưởng bởi 
viêm thanh dịch có tơ huyết ở màng não, màng 
phổi, màng ngoài tim, phúc mạc và viêm khớp 
đã được mô tả lần đầu tiên bởi Glasser vào năm 
1910 (Little et al., 1970; Nedbalcov et al., 2006). 
Tuy nhiên, Schermer & Ehrlich mới là người 
phân lập đầu tiên nhóm vi khuẩn này vào năm 
1922 (Little et al., 1970). Đến năm 1943, bệnh 
đã được Hiarre & Wramby nghiên cứu phân loại 
Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Huyên 
1069 
chi tiết dựa trên các đặc tính sinh hóa, đặc tính 
loài và được đặt tên là Haemophilus suis. Năm 
1969, Biberstein và White đã chứng minh rằng 
sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh Glasser 
trên lợn chỉ phụ thuộc vào yếu tố NAD. Tuy 
nhiên, Kilian et al. (1976) đã tiến hành phân 
loại các chủng vi khuẩn Haemophilus và đặt tên 
H. suis là Haemophilus parasuis. Vi khuẩn H. 
parasuis có đặc điểm sau: Trực khuẩn Gram 
âm, có tiêm mao và giáp mô, cần yếu tố V, hiếu 
khí hay yếm khí tùy ý, không gây dung huyết. 
Vi khuẩn này thường nhiễm ghép với lợn bị 
bệnh tai xanh (virus PRRS) gây ra nhiều thiệt 
hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn khắp nơi 
trên thế giới (Solano et al., 1997). 
H. parasuis có 15 serotyp khác nhau, trong đó 
một số serotyp có độc tính cao và gây tử vong 
trong vòng 4 ngày như serotyp 1, 5, 10, 12, 13 
và 14 (Kielstein et al., 1990; Nedbalcov et al., 
2006). Do sự đa dạng về các serotyp hiện diện 
trên đàn lợn tại các quốc gia và ở các vùng địa lý 
khác nhau và đáp ứng miễn dịch chéo giữa các 
serotyp nên rất khó để phát triển một loại 
vacxin bảo vệ có hiệu quả có thể sử dụng rộng 
rãi trên toàn thế giới (Nedbalcov et al., 2006). 
Do đó, thuốc kháng sinh vẫn đóng một vai trò 
quan trọng và được chứng minh có hiệu quả 
trong điều trị và kiểm soát bệnh Glasser trên 
lợn (Aarestrup et al., 2004; Aragon et al., 2012; 
Vilalta et al., 2012). 
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh 
học phân tử multiplex PCR với độ đặc hiệu, 
chính xác và tin cậy cao đã được sử dụng rộng 
rãi trên thế giới trong xác định các serotyp của 
vi khuẩn H. parasuis. Kỹ thuật mPCR sử dụng 
các cặp primers đặc hiệu được phát triển dựa 
trên các gen mã hóa sinh tổng hợp các cấu trúc 
polysaccharide ngoại bào, như kháng nguyên O 
có bản chất là lipopolysaccharides (LPS) và 
kháng nguyên vỏ capsules chính của vi khuẩn 
H. parasuis (Howell et al., 2015; Wang et al., 
2017; Aiqing et al., 2017). Các công trình nghiên 
cứu sử dụng phương pháp mPCR đã xác định 
được 15 serotyp tham chiếu (serotyp từ 1 tới 15) 
của vi khuẩn H. parasuis. So sánh với phương 
pháp xét nghiệm cổ điển khuếch tán miễn dịch 
trên thạch (AGID, agar gel-immuno-diffusion 
test), phương pháp mPCR cho kết quả có độ 
nhạy và đặc hiệu cao hơn (Howell et al., 2015; 
Wang et al., 2017; Aiqing et al., 2017). 
Tại Việt Nam, cùng với sự phát triển của 
ngành chăn nuôi thì dịch bệnh cũng phát sinh, 
lây lan và gây thiệt hại lớn về kinh tế. Một 
trong những bệnh thường xảy ra trong những 
năm gần đây là bệnh Tai xanh hay Hội chứng 
rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine 
Reproductive and Respiratory Syndrom virus-
PRRSV). Virus PRRS tấn công và tiêu diệt các 
đại thực bào ở phổi dẫn đến hiện tượng suy 
giảm miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện thuận lợi 
cho các vi khuẩn gây bệnh kế phát trên đường 
hô hấp như Actinobacillus pleuropneumoniae, 
Pasteurella multocida, Streptococcus suis 
serotyp 2, Bordetella bronchiseptica (Nguyễn 
Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007; Bùi Quang 
Anh và cs., 2008; Cù Hữu Phú, 2011). Ngoài ra, 
sự hiện diện của bệnh Glasser do vi khuẩn 
H. parasuis gây ra, cũng đã được ghi nhận tại 
Việt Nam với các triệu trứng lâm sàng và bệnh 
tích điển hình trên lợn bệnh cũng như lợn 
nhiễm bệnh Tai xanh hoặc hội chứng gầy còm 
sau cai sữa. Sự nhiễm khuẩn kế phát do vi 
khuẩn H. parasuis trên những đàn lợn mắc 
bệnh PRRS là rất phổ biến trên thế giới, thường 
dẫn đến tỉ lệ tử vong cao ở lợn con từ 6-14 tuần 
tuổi (Palzer et al., 2015). Nhiều công bố khoa 
học trên thế giới đã phân lập, xác định các 
serotyp có độc lực cao của vi khuẩn H. parasuis 
và chứng minh hiện tượng này (Palzer et al., 
2015). Gần đây, Lâm Thị Thu Hương và cs. 
(2012) đã tiến hành khảo sát các vi khuẩn đồng 
nhiễm trên lợn mắc hội chứng gầy còm sau cai 
sữa (PCV2) tại các trại lợn trên địa bàn hai tỉnh 
miền Đông Nam bộ. Kết quả phát hiện trực tiếp 
bằng phương pháp PCR cho thấy tỉ lệ lợn nhiễm 
vi khuẩn H. parasuis đạt ở mức cao với 17,5% 
trong nhóm lợn bị nhiễm virus PCV2. Trong một 
nghiên cứu khác, Lê Văn Lãnh và cs. (2012) đã 
tiến hành khảo sát các vi khuẩn đồng nhiễm 
trên lợn nghi mắc bệnh suyễn do Mycoplasma 
tại trại lợn tại một số tỉnh phía Bắc, kết quả cho 
thấy tỉ lệ lợn nhiễm vi khuẩn H. parasuis đạt ở 
mức 11,32% trong tổng số 106 mẫu xét nghiệm. 
Mặc dù được coi là mầm bệnh truyền nhiễm 
quan trọng trên lợn, các nghiên cứu để phân lập 
và giám sát sự lưu hành các serotyp của vi 
Phân lập và xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Haemophilus parasuis phân lập từ lợn tại tỉnh Thanh Hóa, 
Hưng Yên và Hà Nam 
1070 
khuẩn H. parasuis tại Việt Nam hiện còn rất 
hạn chế. Do đó, nghiên cứu này được tiến hành 
nhằm mục đích phân lập và xác định các 
serotyp đang lưu hành và gây bệnh trên lợn của 
vi khuẩn H. parasuis tại một số tỉnh phía Bắc 
tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề 
cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát 
triển vacxin phù hợp, có hiệu quả, giảm thiểu 
thiệt hại do H. parasuis gây ra cho người chăn 
nuôi đồng thời nâng cao khả năng phòng chống 
dịch bệnh trên đàn lợn. 
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1. Vật liệu nghiên cứu 
Lợn nghi mắc bệnh Glasser: Mẫu bệnh phẩm 
bao gồm dịch ngoáy xoang mũi, dịch ngoáy khí 
quản, dịch khớp, phổi, tim được thu thập từ mỗi 
lợn có triệu trứng, bệnh tích nghi mắc bệnh 
Glasser tại các địa bàn thuộc tỉnh Thanh Hóa, 
Hưng Yên, Hà Nam trong khoảng thời gian từ 
tháng 12/2016 đến 10/2017. Đối với lợn được mổ 
khám tại khu vực xử lý mẫu của phòng thí 
nghiệm, mẫu bệnh phẩm tại các vị trí khác nhau 
được giữ riêng biệt trong các hộp, túi đựng mẫu, 
cho vào thùng chuyển mẫu và chuyển thẳng lên 
phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập. Đối với 
mẫu được mổ khám tại thực địa, các mẫu được 
giữ trong các túi đựng mẫu riêng biệt cho từng vị 
trí lấy mẫu, giữ trong thùng bảo ôn (2-8C) và 
chuyển đến phòng thí nghiệm để tiến hành phân 
lập trong vòng 24 giờ. 
 Môi trường, hóa chất sử dụng bao gồm: 
Thạch blood agar base (BD); Tryptic soya broth 
- TSB (Merck); Thạch MacConkey (BD); 
Catalase (Hydrogen peroxide 3%, Merck); 
Oxidase (1% N, N-dimethyl-p-
phenylenediamine hydrochloride, Sigma); 
Kovac’s/Indol (Merck); Urea base (BD); Bộ kit 
nhuộm Gram (Merck); Glucose (Merck); Lactose 
(Merck); Galactose (Merck); Fructose (Merck); 
Sucrose (Sigma); Mannitol (Merck); 
Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt 
(NAD, Sigma); Huyết thanh thai bò (FBS-Fetal 
bovine serum, Gibco); Kit chiết tách DNA 
(QIAGEN); GoTaq PCR green (Promega). 
2.2. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 
H. parasuis 
Các mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi 
trường thạch máu sử dụng 5% máu thỏ (RBA) 
và 5% máu cừu (SBA) có kèm đường cấy vi 
khuẩn S. aureus ở điều kiện hiếu khí 37°C với 
5% CO2 trong thời gian 24-48 giờ. Các đĩa thạch 
được kiểm tra hàng ngày về khả năng mọc và sự 
phát triển của khuẩn lạc. Các khuẩn lạc nghi 
ngờ vi khuẩn H. parasuis được cấy chuyển sang 
môi trường thạch tương tự hoặc môi trường tăng 
sinh tryptic soy broth (TSB) có bổ sung 0,01% 
yếu tố V-nicotinamide adenine dinucleotide 
(NAD) và huyết thanh để giám định đặc tính 
sinh hóa học: nhuộm Gram, thử các phản ứng 
catalase, indol, urease, oxidase, cAMP, khả 
năng phụ thuộc vào yếu tố V (NAD), khả năng 
dung huyết, khả năng lên men đường glucose, 
galactose, fructose, sucrose, mannitol, lactose và 
khả năng mọc trên môi trường MacConkey. 
2.3. Tách chiết DNA từ mẫu 
Canh khuẩn hoặc khuẩn lạc sau nuôi cấy 
của các chủng riêng biệt cần xét nghiệm được 
tách chiết DNA tổng số sử dụng kit tách chiết 
QIAamp DNA Extraction Kit (Qiagen, Mỹ) theo 
quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản 
phẩm PCR hay mPCR được cắt và tách chiết từ 
gel sau điện di sử dụng kit tách chiết QIA quick 
Gel Extraction Kit (Qiagen, Mỹ) theo quy trình 
hướng dẫn của nhà sản xuất. 
2.4. Giám định vi khuẩn H. parasuis bằng 
phương pháp PCR 
DNA của vi khuẩn được tách chiết sử dụng 
Kit chiết tách DNA thương mại QIAamp DNA 
Mini Kit (QIAGEN). Quy trình chiết tách DNA 
được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản 
xuất. Phản ứng PCR dùng để giám định các 
chủng phân lập sử dụng cặp mồi đặc hiệu HPS-
F/HPS-R (Bảng 1) khuếch đại đoạn gene 16S 
rRNA của vi khuẩn H. parasuis (Oliveira et al., 
2001). Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 
6,5 µL nuclease-free water; 12,5 µL 2X Go Taq 
green master mix (Promega); 1 µL reverse 
primer (10 pmole HPS-F); 1 µL forward primer 
Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Huyên 
1071 
(10 pmole HPS-R); 5 µL khuôn mẫu DNA. Đối 
chứng dương sử dụng trong phản ứng PCR là 
chủng VNUA-HP02 phân lập từ lợn bệnh tại 
Phú Thọ vào 10/2016. Chủng VNUA-HP02 có 
đầy đủ các đặc tính đặc trưng về nhuộm Gram, 
hình thái, đặc tính sinh hóa và trình tự gene 
16S rRNA tương đồng 99,03-100% với các chủng 
vi khuẩn H. parasuis tham chiếu trên thế giới 
(phân tích bằng phần mềm MEGA6 và dữ liệu 
Genbank thông qua phân tích BLAST của 
NCBI). Chu trình nhiệt được thực hiện gồm 3 
bước bao gồm: Tiền biến tính ở nhiệt độ 94°C 
trong 5 phút; Chu kỳ lặp lại 30 lần: Biến tính ở 
nhiệt độ 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 56°C 
trong 60 giây, tổng hợp kéo dài ở 72°C trong 90 
giây; Hoàn thành ở 72°C trong 7 phút. Sản 
phẩm PCR được điện di trên gel 1,2% (TBE 1X) 
với thang DNA chuẩn 100 bp (marker). Sử dụng 
nguồn điện di ở hiệu điện thế 100V cường độ 
100 mA, thời gian chạy điện di trong 35 phút. 
Sản phẩm PCR cho sản phẩm có độ dài 821 bp. 
2.5. Định serotyp vi khuẩn H. parasuis 
bằng phương pháp multiplex PCR 
Phản ứng mPCR được dùng để xác định 
serotyp của các chủng phân lập sử dụng các cặp 
mồi đặc hiệu được liệt kê ở bảng 1 (Howell et al., 
2015; Aiqing et al., 2017). Thành phần 30µl 
phản ứng mPCR bao gồm: 6 µL GoTaq green 5X 
(Promega, Mỹ), 1,5 units GoTaq DNA 
polymerase (Promega, Mỹ), 0,75 µL hỗn hợp 
dNTPs (10 mM; Promega, Mỹ) gồm 0, 25 mM 
mỗi dNTP, 1,5 mM MgCl2 (Promega, Mỹ), 30 
pmole mỗi primer, nuclease-free water 
(Promega, Mỹ), và khuôn mẫu DNA. Hai phản 
ứng mPCR được sử dụng bao gồm (mPCR1) các 
cặp mồi HP1, HP2, HP4, HP5-HP12, HP10, 
HP13, HP14, HP15 và (mPCR2) các cặp mồi 
HP3, HP6, HP7, HP8, HP9, HP11. Đối chứng 
dương (VNUA-HP02) sử dụng trong mPCR đã 
được xác định là serotyp 4 trước đó bằng phương 
pháp mPCR, tinh khiết DNA từ gel, giải trình 
tự wciP gene và phân tích bằng phần mềm 
MEGA6 và dữ liệu Genbank thông qua phân 
tích BLAST của NCBI. Chu trình nhiệt được 
thực hiện gồm 3 bước bao gồm: Tiền biến tính ở 
nhiệt độ 94°C trong 5 phút; Chu kỳ lặp lại 30 
lần: Biến tính ở nhiệt độ 94°C trong 30 giây, gắn 
mồi ở 58°C trong 60 giây, tổng hợp kéo dài ở 
72°C trong 90 giây; Hoàn thành ở 72°C trong 7 
phút. Đối với các chủng dương tính mPCR sử 
dụng cặp mồi HP5-12F/HP5-12R cần tiến hành 
thêm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 
HP12F/HP12F đặc hiệu cho serotype 12 để chẩn 
đoán phân biệt serotype 5 và 12 (Thành phần và 
điều kiện phản ứng như trình bày ở mục 2.4). 
Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1.2% (TBE 
1X) với thang DNA chuẩn 100 bp (marker). Sử 
 ... ị Huyên 
1073 
Bảng 2. Kết quả lựa chọn môi trường phân lập vi khuẩn H. parasuis từ các loại bệnh phẩm 
Bệnh phẩm 
Số 
xét nghiệm 
Môi trường RBA Môi trường SBA 
Số khuẩn lạc nghi H. parasuis Tỷ lệ (%) Số khuẩn lạc nghi H. parasuis Tỷ lệ (%) 
Dịch ngoáy khí quản 5 4 80 4 80 
Dịch khớp 5 2 40 2 40 
Tim 5 2 40 2 40 
Phổi 5 3 60 3 60 
Ghi chú: A - Viêm fibrin màng bao tim, có dịch; B - Viêm màng phổi phủ fibrin; 
C - Viêm khớp có dịch; D - Vi khuẩn H. parasuis mọc trên môi trường thạch 
máu cừu; E- Vi khuẩn H. parasuis mọc trên môi trường thạch máu thỏ. 
Hình 1. Hình ảnh bệnh tích điển hình ở lợn nhiễm bệnh Glasser 
và khả năng mọc của vi khuẩn H. parasuis trên môi trường thạch máu 
H. parasuis là vi khuẩn khu trú ở đường hô 
hấp trên, do đó tỷ lệ phân lập vi khuẩn này ở 
dịch ngoáy mũi, dịch ngoáy khí quản, phổi hay 
dịch khớp khá cao (Olivera, 2004; Turni et al., 
2007). Tuy nhiên, việc phân lập vi khuẩn H. 
parasuis từ dịch ngoáy mũi không được khuyến 
cáo vì thường mất nhiều công sức và thời gian, 
do có rất nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau khu 
trú ở đường hô hấp trên của lợn. Tỷ lệ các chủng 
phân lập từ các vị trí lấy mẫu hay loại mẫu 
bệnh phẩm trong nghiên cứu này (66/205 chiếm 
32,19%) phù hợp với nghiên cứu trước đây của 
Turni et al. (2007) khi tiến hành phân lập vi 
khuẩn H. parasuis từ các loại mẫu bệnh phẩm 
thu thập từ lợn nhiễm bệnh. Kết quả cho thấy, 
với các mẫu bệnh phẩm từ lợn có triệu chứng và 
bệnh tích đặc trưng của bệnh Glasser như lợn 
sốt cao, ho, thở thể bụng, ăn kém, gầy sút cân, 
sưng khớp, mổ khám có bệnh tích viêm fibrin 
bám dính ở màng phổi, màng tim, xoang bụng, 
xoang bao tim viêm tích nước, viêm đa khớp cho 
tỷ lệ phân lập vi khuẩn H. parasuis cao. 
Phân lập và xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Haemophilus parasuis phân lập từ lợn tại tỉnh Thanh Hóa, 
Hưng Yên và Hà Nam 
1074 
Bảng 3. Kết quả phân lập vi khuẩn H. parasuis từ các loại bệnh phẩm 
Bệnh phẩm 
Số mẫu 
xét nghiệm 
Môi trường RBA 
Khuẩn lạc nghi H. parasuis Tỷ lệ (%) 
Dịch ngoáy mũi 41 15 36,58 
Dịch ngoáy khí quản 41 17 41,46 
Dịch khớp 41 7 17 
Tim 41 10 24,39 
Phổi 41 17 41,46 
Tổng 205 66 32,19 
Ghi chú: A, B - Vi khuẩn bắt màu Gram âm, trực khuẩn đa hình thái, từ 
dạng trực khuẩn ngắn đến dạng sợi nhỏ mảnh dài; C, D - Chủng phân lập 
của vi khuẩn H. parasuis trên thạch máu thỏ tạo khuẩn lạc với kích thước 
nhỏ, trong suốt, không dung huyết, mọc xung quanh đường cấy S. aureus. 
Hình 2. Hình thái vi khuẩn H. parasuis từ các chủng phân lập được 
3.3. Giám định đặc tính sinh hóa học của 
các chủng phân lập 
Tổng số 66 khuẩn lạc nghi ngờ được phân 
lập từ các mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy mũi, dịch 
ngoáy khí quản, phổi, tim và dịch khớp của 22 
lợn xét nghiệm trên. Qua sàng lọc các khuẩn 
lạc nghi ngờ của mỗi lợn xét nghiệm, có 22 chủng 
phân lập nghi ngờ vi khuẩn H. parasuis từ 22 
lợn xét nghiệm được sử dụng cho các nghiên cứu 
tiếp theo. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa 
học của các chủng phân lập nghi ngờ là vi 
khuẩn H. parasuis (Bảng 4) cho thấy 22/22 
(100%) chủng vi khuẩn đều bắt màu Gram âm 
và cho kết quả âm tính với phản ứng urease, 
Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Huyên 
1075 
cAMP và indol. Có 22 và 20 trong tổng số 22 
chủng phân lập xét nghiệm cho kết quả lần lượt 
dương tính với phản ứng oxidase và catalase. 
Các chủng vi khuẩn phân lập hầu hết đều phụ 
thuộc vào yếu tố V (20/22), không có khả năng 
dung huyết (hemolysis) và không phát triển 
trên môi trường thạch MacConkey. Cả 22 chủng 
đều có khả năng lên men đường glucose, 
galactose, fructose, sucrose và không có khả 
năng lên men đường mannitol, lactose. 
Bảng 4. Kết quả giám định sinh hóa các chủng nghi ngờ vi khuẩn H. parasuis 
Chỉ tiêu xét nghiệm Số chủng test Kết quả tham chiếu Kết quả xét nghiệm (Tỷ lệ%) 
Bắt màu Gram âm 22 + 22/22 (100) 
Hemolysis 22 22/22 (100) 
cAMP 22 22/22 (100) 
Urease 22 22/22 (100) 
Yếu tố V 22 + 20/22 (91) 
Oxidase 22 + 22/22 (100) 
Catalase 22 + 20/22 (91) 
Indol 22 22/22 (100) 
Glucose 22 + 22/22 (100) 
Galactose 22 + 22/22 (100) 
Mannitol 22 22/22 (100) 
Lactose 22 22/22 (100) 
Sucrose 22 + 22/22 (100) 
Fructose 22 + 22/22 (100) 
MacConkey 22 22/22 (100) 
Ghi chú:  2/22 chủng cho kết quả dương tính nhẹ đối với phản ứng catalase và không phụ thuộc vào yếu tố V. 
Ghi chú: Giếng thang DNA chuẩn 100 bp (M-Maker); Giếng 2: Đối chứng dương VNUA-HP02 (+); 
Giếng 3 đến giếng 11: sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn H. parasuis phân lập từ lợn bệnh, theo 
thứ tự lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9; Giếng 12: Đối chứng âm (-). 
Hình 3. Kết quả giám định các chủng phân lập vi khuẩn H. parasuis bằng phản ứng PCR 
Phân lập và xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Haemophilus parasuis phân lập từ lợn tại tỉnh Thanh Hóa, 
Hưng Yên và Hà Nam 
1076 
Quan sát đặc tính mọc của các chủng vi 
khuẩn trên môi trường nuôi cấy cho thấy có 
10/22 chủng mọc bình thường và 12/22 chủng 
mọc yếu trên môi trường nuôi cấy. Cả 22 khuẩn 
lạc nghi ngờ phân lập được từ các tỉnh Thanh 
Hóa, Hưng Yên, Hà Nam đều có đặc tính sinh 
hóa học phù hợp với các nghiên cứu trước đây về 
vi khuẩn H. parasuis (Keilstein et al., 2001; 
Olivera et al., 2004; Pereira et al., 2017). 
Nghiên cứu giám định 22 chủng phân lập 
bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 
HPS-F/HPS-R để phát hiện DNA của vi khuẩn 
H. parasuis. Kết quả giám định bằng phản ứng 
PCR cho thấy 20/22 chủng phân lập cho kết quả 
PCR dương tính với DNA của vi khuẩn 
H. parasuis cho sản phẩm PCR có độ dài 821 bp 
như thiết kế (Hình 3). 
3.4. Định serotyp của các chủng vi khuẩn 
H. parasuis phân lập tại các địa phương 
nghiên cứu 
Các serotyp của các chủng phân lập vi 
khuẩn H. parasuis đã được xác định bằng kỹ 
thuật sinh học phân tử mPCR. Kết quả mPCR 
cho thấy 16/20 chủng vi khuẩn H. parasuis 
dương tính với serotyp 1, 2, 4, 5/12 và 13 cho sản 
phẩm PCR có độ dài như thiết kế (Bảng 1; 
Hình 4). Do cặp mồi HP5-12-F/HP5-12-R không 
thể phân biệt serotyp 5 hoặc 12, chúng tôi sử 
dụng cặp mồi đặc hiệu HP12F/HP12R để phân 
biệt các serotyp này (Aiqing et al., 2017). Kết quả 
xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi HP12F/HP12R 
cho thấy cả 5 chủng vi khuẩn xét nghiệm (dương 
tính với cặp mồi HP5-12F/HP5-12-R) đều âm 
tính với serotyp 12 (0/5). Phân tích kết quả cho 
thấy sự đa dạng các serotyp trong số các chủng vi 
khuẩn H. parasuis phân lập được từ thực địa các 
tỉnh Thanh Hóa, Hưng Yên và Hà Nam (Hình 4). 
Đáng chú ý, serotyp 4, 5 và 1 là phổ biến nhất với 
tỷ lệ lần lượt 30% (6/20), 25% (5/20) và 15% 
(3/20). Chiếm tỷ lệ thấp hơn lần lượt là các chủng 
vi khuẩn thuộc serotyp 13 với 5% (1/20), serotyp 
2 với 5% (1/20). Tuy nhiên, các chủng phân lập 
chưa xác định được serotyp (non-typable serotyp) 
chiếm 20% (4/20). Số lượng các chủng vi khuẩn 
H. parasuis chưa xác định serotyp thường được 
đề cập nhiều trong hầu hết các nghiên cứu trên 
thế giới (Keilstein et al., 2001; Olivera et al., 
2004; Howell et al., 2015; Pereira et al., 2017; 
Aiqing et al., 2017). Các nhà khoa học hiện vẫn 
đang nỗ lực nghiên cứu phát triển các phương 
pháp chẩn đoán, phân tích genome để phát hiện 
các serotyp mới của vi khuẩn H. parasuis gây 
bệnh trên lợn trên toàn thế giới. 
Ghi chú: A - Tỷ lệ% các serotyps của các chủng vi khuẩn H. parasuis phân lập tại thực địa; B- 
Kết quả mPCR xác định các serotyp từ các chủng vi khuẩn H. parasuis phân lập tại thực địa. 
Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Maker); Giếng 1: Đối chứng dương VNUA-HP02 serotyp 4 
(HP4); Giếng 2-3: các chủng phân lập serotyp 1 (HP1); Giếng 4: chủng phân lập serotyp 2 
(HP2); Giếng 5-6: các chủng phân lập serotyp 4 (HP4); Giếng 7-8: các chủng phân lập serotyp 5 
(HP5); Giếng 9: chủng phân lập serotyp 13 (HP13); Giếng 10: chủng phân lập non-typable 
serotyp; Giếng 11: Đối chứng âm. 
Hình 4. Tỷ lệ các serotyp lưu hành của vi khuẩn H. parasuis 
phân lập từ lợn thuộc địa bàn tỉnh Thanh Hóa, Hưng Yên, Hà Nam 
Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Huyên 
1077 
Mặc dù trong nghiên cứu này lượng mẫu 
được thu thập dùng để chẩn đoán phân lập mầm 
bệnh chưa đủ lớn, kết quả thực tế cho thấy tỷ lệ 
nhiễm rất cao đối với vi khuẩn H. parasuis ở các 
địa phương thu thập mẫu bệnh phẩm. Yếu tố 
dịch tễ bệnh, đặc biệt sự lưu hành của các 
serotyp khác nhau của vi khuẩn H. parasuis 
phụ thuộc vào vùng địa lý, khí hậu khác nhau, 
mỗi địa phương khác nhau dẫn đến tỷ lệ phân 
lập vi khuẩn này cũng cao thấp khác nhau 
(Oliveira et al., 2004; Nedbalcov et al., 2006). 
Cần nhiều hơn nữa các nghiên cứu chuyên sâu 
tiếp theo về sự lưu hành của các serotyp gây 
bệnh chính trên diện rộng cả nước để từ đó có 
thể xác định được các serotyp gây bệnh chính tại 
thực địa, lựa chọn được các serotyp đại diện của 
vi khuẩn H. parasuis phục vụ nghiên cứu nhằm 
chế tạo các chủng giống gốc để sản xuất vacxin 
phòng bệnh hiệu quả tại Việt Nam. 
4. KẾT LUẬN 
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy môi trường 
thạch máu thỏ có khả năng thay thế môi trường 
thạch máu cừu được sử dụng rộng rãi tại các 
phòng thí nghiệm trên thế giới trong nghiên cứu 
phân lập vi khuẩn H. parasuis. Nghiên cứu cũng 
chỉ ra rằng các kỹ thuật phân lập, vị trí lấy mẫu 
như dịch ngoáy khí quản và phổi cho kết quả 
phân lập cao đối với vi khuẩn H. parasuis. Các 
chủng phân lập tại các tỉnh Thanh Hóa, Hưng 
Yên, Hà Nam trong nghiên cứu này đều mang 
đầy đủ các đặc tính sinh hóa học của loài. Đáng 
chú ý, kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng serotyp 
1, 4, 5 là các serotyp lưu hành phổ biến nhất tại 
các địa bàn nghiên cứu. Kết quả này sẽ là tiền đề 
triển khai các nghiên cứu diện rộng tiếp theo về 
sự lưu hành của các serotyp mới, các serotyp gây 
bệnh chính, tính mẫn cảm kháng sinh cũng như 
nghiên cứu lựa chọn các serotyp đại diện quốc gia 
phục vụ nghiên cứu, chế tạo các chủng gốc để sản 
xuất vacxin phòng bệnh có hiệu quả nhằm giảm 
thiệt hại do vi khuẩn H. parasuis gây ra trên đàn 
lợn tại Việt Nam. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Aarestrup F.M., Seyfarth A.M., Angen O. (2004). 
Antimicrobial susceptibility of Haemophilus 
parasuis and Histophilus somni from pigs and 
cattle in Denmark. Veterinary Microbiology, 
101: 143-146. 
Aiqing J., Ruyue Z., Huiying F., Kaijie Y., Jianmin Z., 
Yindi X., Guiping W., Ming L. (2017). 
Development of Serotyp-Specific PCR Assays for 
Typing of Haemophilus parasuis Isolates 
Circulating in Southern China. J. Clin Microbiol., 
55(11): 3249-3257. 
Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, 
Nguyễn Văn Long, Nguyễn Ngọc Tiến, (2008). 
Hội chứng rốn loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 
(PRRS). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, tr. 7-21. 
Cai X., Chen H., Blackall P. J., Yin Z., Wang L., Liu 
Z., Jin M. (2005). Serological characterization of 
Haemophilus parasuis isolates from China. Vet 
Microbiol., 111: 231-6. 
Cù Hữu Phú (2011). Nghiên cứu mối liên quan giữa 
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn với vi 
khuẩn gây bệnh kế phát và xác định biện pháp 
phòng, trị bệnh. Báo cáo khoa học, Viện Thú y 
Quốc gia. 
Howell K. J., Peters S. E., Wang J., Hernandez-Garcia 
J., Weinert L. A., Luan S. L., Chaudhuri R. R., 
Aragon V., Williamson S. M., Langford P. R., 
Rycroft A. N., Tucker A. W. (2015). Development 
of a multiplex PCR assay for rapid molecular 
serotyping of Haemophilus parasuis. J Clin 
Microbiol., 53(12): 3812-3821. 
Keilstein P., Wuthe H.H., Angen O., Mutters R., 
Ahrens P. (2001). Phenotypic and gentic 
characterization of NAD-dependent 
Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs 
and their possible pathogenetic importance. Vet 
Microbiol., 81: 243-255. 
Kielstein P., Schimmel D., Hass R. (1985). Serological 
typing of Haemophilus parasuis. Arch Exp 
Veterinarmed., 39: 944-7. 
Kilian M. (1976). A taxonomic study of the genus 
Haemophilus with the proposal of a new species. J. 
Gen Microbiol., 93: 9-62. 
Little T.W.A. (1970). Haemophilus parasuis infection 
in pigs. Veterinary Record, 87: 399-402 
Møller K., Andersen L. V., Christensen G., Kilian M. 
(1993). Optimalization of the detection of NAD 
dependent Pasteurellaceae from the respiratory 
tract of slaughterhouse pigs. Vet Microbiol., 
36: 261-71. 
Nedbalcov K., Satran P., Jaglic Z., Ondriasova R., 
Kucerova Z. (2006). Haemophilus parasuis and 
Glässer’s disease in pigs: A review. Veterinarni 
Medicina, 51(5): 168-179. 
Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013). Bệnh 
truyền nhiễm của động vật nuôi và biện pháp 
Phân lập và xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Haemophilus parasuis phân lập từ lợn tại tỉnh Thanh Hóa, 
Hưng Yên và Hà Nam 
1078 
khống chế. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, 
tr. 260-264. 
Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007). Hội chứng 
rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Hội thảo khoa 
học về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và 
bệnh liên cầu gây ra ở lợn 10/2007. Trường đại học 
Nông nghiệp, Hà Nội. 
Oliveira S. (2004). Improving rate of success in 
isolating Haemophilus parasuis from clinical 
samples. J Swine Health Prod., 12(6): 308-309. 
Oliveira S., Galina L., Pijoan C. (2001). Development 
of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis 
infections. J Vet. Diagn Invest., 13(6): 495-501. 
Palzer A., Kolb K., Strutzberg-Minder K., Zoels S., 
Eddicks M., Heinritzi K., Ritzmann M. (2015). 
Serological course investigations of Haemophilus 
parasuis and Mycoplasma hyorhinis in three pig 
farms. Schweiz Arch Tierheilkd., 157: 97-103. 
Pereira D.A., Dalla Costa F.A., Ferroni L.B., Moraes 
C.N., Schocken-Iturrino R.P., Oliveira L.G. 
(2017). The challenges with Glässer’s disease in 
technified pig production. Austral J. Vet. Sci., 
49(2): 63-69. 
San Millan A., Escudero J.A., Catalan A., Nieto S., 
Farelo F., Gibert M., Moreno M.A., Dominguez L., 
Gonzalez-Zorn B. (2007). Beta- Lactam resistance 
in Haemophilus parasuis is mediated by plamid pB 
1000 Bearing blaROB-1. Antimicrob Agents 
Chemother., 51: 2260-4. 
Solano G.I., Segalés J., Collins J.E., Molitor T.W., 
Pijoan C. (1997). Porcine reproductive and 
respiratory syndrome virus (PRRSv) in teraction 
with Haemophilus parasuis. Vet Microbiol., 
55: 247-57. 
Turni C., Blackall P. (2007). Comparison of sampling 
sites and detection methods for Haemophilus 
parasuis. Aust Vet. J., 85(5): 177-184. 
Vilalta, C., Schneider, M., López-Jiménez, R., 
Caballero, J.M., Gottschalk, M. & Fraile, L. 
(2011). Marbofloxacin reaches high concentration 
in pig tonsils in a dose - dependent fashion. Journal 
of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 34: 
95-97. 
Wang Z., Zhao Q., Wei H., Wen X., Cao S., Huang X., 
Wu R., Yan Q., Huang Y., Wen Y. (2017). 
Prevalence and seroepidemiology of Haemophilus 
parasuis in Sichuan province, China. PeerJ, DOI 
10.7717/peerj.3379. 
Wissing A., Nicolet J., Boerlin P. (2001). The current 
antimicrobial resistance situation in Swiss 
veterinary medicine. Schweiz arch Tierheilkd., 
143: 503-10.