Phân loại 2 chủng vi nấm phân lập tại Viện 69 và xác định khả năng phân giải một số cơ chất sinh học của chúng

3060(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Đặt vấn đề
Nghiên cứu về vi nấm, trước hết cần phân loại (định 
danh) các chủng thu thập được. Định danh vi nấm hiện nay 
có nhiều phương pháp, trong đó hình thái là phương pháp 
truyền thống, cơ bản và tới nay vẫn là phương pháp chính 
để phân loại vi nấm ở các labo trong và ngoài nước. Phương 
pháp này dựa vào các đặc điểm hình thái đại thể, vi thể, siêu 
vi thể và căn cứ vào các khóa phân loại để định danh tên chi, 
loài vi nấm. Phương pháp sinh học phân tử dựa vào các kỹ 
thuật PCR, giải trình tự gen... để định danh vi nấm. Trong 
giải trình tự gen rDNA, một số cặp mồi (ITS1, ITS2, NL1, 
NL4...) thường được sử dụng để có được trình tự gen đích 
cho phân tích, định danh loài. Hiện nay, việc kết hợp nhiều 
phương pháp trong định danh xác định loài vi nấm đang là 
hướng phát triển mạnh mẽ nhằm có được kết quả chẩn đoán 
chính xác và nhanh chóng [1, 2].
Vi nấm là các vi sinh vật có thành phần loài phong phú 
và đa dạng, có khả năng sản sinh hệ các enzyme protease, 
lipase, cellulase... giúp chúng tồn tại, phát triển trên nhiều 
loại cơ chất, sống được ở nhiều điều kiện môi trường khắc 
nghiệt [3]. Viện 69 có một số phòng thí nghiệm có điều kiện 
khô lạnh (nhiệt độ 160C, độ ẩm 70%) để bảo quản tiêu bản 
sinh học. Các thành phần trong các tiêu bản sinh học bảo 
quản ở Viện chính là các cơ chất sinh học giúp cho các vi 
nấm phát triển, có thể gây hư hỏng các tiêu bản. Khảo sát 
hệ vi nấm ở các phòng thí nghiệm này đã thu được nhiều 
chủng vi nấm, trong đó các loài thuộc chi Aspergillus chiếm 
tỷ lệ cao. 
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nội dung 
nghiên cứu với mục tiêu định danh 2 chủng vi nấm ĐTĐL-
207 và ĐTĐL-032 thuộc chi Aspergillus thu thập được bằng 
phương pháp hình thái kết hợp với giải trình tự gen và xác 
định khả năng phân giải một số cơ chất sinh học của các loài 
vi nấm này.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Hai chủng vi nấm ĐTĐL-207 và ĐTĐL-032 phân lập 
được tại Viện 69.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân loại vi nấm dựa vào hình thái: 
Tiến hành nuôi cấy chủng vi nấm thuần khiết, xác định 
đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường Czapek Dox 
Phân loại 2 chủng vi nấm phân lập tại Viện 69 
và xác định khả năng phân giải một số cơ chất 
sinh học của chúng
Phùng Công Thưởng*, Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Cao Vũ
Viện 69
Ngày nhận bài 11/10/2018; ngày chuyển phản biện 16/10/2018; ngày nhận phản biện 23/11/2018; ngày chấp nhận đăng 27/11/2018
Tóm tắt:
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu định danh 2 chủng vi nấm bằng phương pháp hình thái và giải trình tự gen đoạn 
ITS rDNA, đồng thời xác định khả năng phân giải các cơ chất collagen, gelatin, cellulo của chúng. Các phương pháp 
thực hiện bao gồm: nghiên cứu thực nghiệm, mô tả, so sánh các dữ liệu thu thập được với dữ liệu khóa phân loại và 
dữ liệu genbank. Nghiên cứu được tiến hành trên 2 chủng vi nấm phân lập được ở Viện 69. Kết quả cho thấy, chủng 
ĐTĐL-032 thuộc về loài Aspergillus versicolor và chủng ĐTĐL-207 thuộc về loài Aspergillus sydowi. Đây là 2 loài vi 
nấm cùng nhóm (Aspergillus versicolor group), chúng có các đặc điểm hình thái khá giống nhau và gần gũi nhau về 
mặt di truyền. Chủng vi nấm ĐTĐL-032 có khả năng phân hủy cơ chất collagen và gelatin, chủng ĐTĐL-207 có khả 
năng phân hủy 3 cơ chất collagen, gelatin, cellulo.
Từ khóa: cellulo, collagen, gelatin, hình thái, ITS, vi nấm.
Chỉ số phân loại: 3.5
*Tác giả liên hệ: Email: phungcongthuong@gmail.com
3160(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Agar (CZA) [4]. Làm tiêu bản, soi trên kính hiển vi quang 
học. Xác định các đặc điểm vi thể của sợi nấm và cơ quan 
sinh sản theo các tiêu chí trong hệ thống phân loại [4, 5]. 
Làm tiêu bản, quan sát đặc điểm vi nấm trên kính hiển vi 
điện tử quét (SEM): chuẩn bị mẫu, vi nấm, cố định mẫu 
bằng Osmic, mạ phủ mẫu bằng vàng. Soi mẫu trên kính 
hiển vi điện tử quét JSM-5410LV của hãng JEOL. Quan 
sát, chụp ảnh các đặc điểm siêu vi thể, nhất là đặc điểm của 
bào tử và cơ quan sinh sản [6]. Xác định vị trí chủng nấm 
trong hệ thống phân loại: căn cứ vào các khoá phân loại Chi 
Aspergillus của Raper, Fennell (1965) [7]; khóa phân loại 
của Katsuhiko Ando “Identification of fungi Imperfecti”, 2002, 
NITE [5]. Từ các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, vi thể, siêu 
vi thể, xác định và phân loại, viết tên các chủng nấm theo 
đúng danh pháp quốc tế.
Phương pháp phân loại vi nấm dựa vào các trình tự gen:
Nuôi cấy chủng nấm thuần khiết trong môi trường Malt 
Broth: đặt trong tủ nuôi cấy lắc, tốc độ 180 vòng/phút/250C 
trong 3-5 ngày. Thu sinh khối bằng giấy lọc. Tách chiết 
DNA tổng số bằng kit tách chiết của hãng GeneAll, Hàn 
Quốc. Kiểm tra nồng độ, độ sạch của DNA tổng số bằng 
máy đo quang (Nano photometer, IMPLEN). Điều chỉnh 
nồng độ DNA tổng số để đạt khoảng 50 đến 150 ng/μl.
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen vi nấm với 
cặp mồi ITS1 và ITS4. Trình tự của mồi ITS1: 
5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3’ (mồi xuôi), ITS4: 
5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 (mồi ngược). Chu 
trình nhiệt: 94oC/1’; (94oC/30’’- 560/30’’- 68oC/45’’) x 35 
chu kỳ; 68oC/7’. 
Tinh sạch sản phẩm DNA vi nấm sau PCR bằng kit tinh 
sạch của hãng GeneAll, Hàn Quốc. Kiểm tra nồng độ, độ 
tinh sạch DNA bằng máy đo quang. Điều chỉnh nồng độ 
DNA tổng số, đạt khoảng 20 ng/μl đến 30 ng/μl.
Giải trình tự gen trực tiếp sử dụng mồi ITS1 trên hệ 
thống ABI 3130. Phân tích trình tự gen, xây dựng cây phát 
sinh chủng loại sử dụng phần mềm Bioedit, DNASTAR, 
công cụ Blast và các dữ liệu trên genbank [1, 2, 8].
Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt 
tính các enzyme vi nấm:
Xác định hoạt tính các enzyme collagenase, gelatinase, 
cellulase theo phương pháp thạch đĩa: môi trường cơ chất 
collagen 0,1% (nutrient agar 20 g, collagen 1 g), cơ chất 
gelatin 0,4% (nutrient agar 20 g, gelatin 4 g), cơ chất cellulo 
1% (CZA 48 g, carboxymethyl cellulose-CMC 10 g). Môi 
trường cơ chất pha trong 1000 ml nước cất, hấp vô trùng ở 
1210C/15 phút, để nguội khoảng 450C, phân phối vào các 
đĩa petri. Cấy các chủng vi nấm lên đĩa môi trường thành 3 
điểm, đặt trong tủ ấm ở 250C trong 5 ngày. Dùng thuốc thử 
HgCl
2 
đổ láng trên bề mặt đĩa thạch có cơ chất collagen hoặc 
gelatin, thuốc thử KI với đĩa thạch có CMC. Đo bán kính 
khuẩn lạc và bán kính vòng phân giải (vòng trong suốt xung 
quanh khuẩn lạc), xác định hệ số phân giải cơ chất (I) theo 
công thức: I = R
2
2/R
1
2. Trong đó: R
2
 là bán kính vòng phân 
giải, R
1 
là bán kính khuẩn lạc. Hệ số phân giải I càng lớn thì 
hoạt tính enzyme càng cao [4].
Kết quả nghiên cứu
Kết quả phân loại chủng vi nấm ĐTĐL-032
Phân loại chủng ĐTĐL-032 bằng phương pháp hình 
thái: hình ảnh khuẩn lạc và các hình ảnh vi thể, siêu vi thể 
của chủng được trình bày ở hình 1.
Classification of two fungal strains
isolated at the Institute 69 
and determining their ability 
to dissolve some biological substrates
Cong Thuong Phung*, Van Bac Nguyen, 
Cao Vu Nguyen
Institute 69
Received 11 October 2018; accepted 27 November 2018
Abstract:
The study aims at the identification of two fungal strains 
by the morphological method and the sequencing of the 
ITS rDNA region, and the determination of their ability 
to dissolve collagen, gelatin, and cellulose. Methods: 
Experimental study, description, and comparison of 
the collected data with the key classification data and 
database of GenBank. The study was conducted with two 
strains of fungi at the Institute 69. Results showed that 
the strain DTDL-032 belonged to Aspergillus versicolor 
and DTDL-207 belonged to Aspergillus sydowi. These 
are two species of the Aspergillus versicolor group, which 
are quite homogenous in morphological and genetic 
characteristics. DTDL-032 is capable of decomposing 
collagen and gelatin substrates; the strain DTDL-207 is 
capable of decomposing collagen, gelatin, and cellulose.
Keywords: cellulose, collagen, fungi, gelatin, IST, 
morphology.
Classification number: 3.5
3260(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Mô tả chủng: 
Đặc điểm khuẩn lạc: khuẩn lạc trên môi trường CZA 
phát triển khá chậm, đạt 2,5-3 cm trong 10 ngày ở nhiệt độ 
phòng, phân vùng, có khía đồng tâm tỏa ra xung quanh. Mặt 
khuẩn lạc dạng nhung, mịn, lúc đầu có màu trắng nhạt, sau 
chuyển sang màu vàng, vàng cam tới lục vàng; giọt tiết ít, 
không màu đến vàng nhạt; mặt trái màu vàng đến vàng da 
cam hoặc đỏ tía.
Đặc điểm vi thể, siêu vi thể: cuống sinh bào tử đa số 
ngắn (200-300 mm), nhưng có thể dài tới 500-700 mm, 
đường kính 5-10 mm, nhẵn, không màu đến nâu nhạt. Bọng 
hình clavat đến gần cầu, kích thước (KT) 13-18 mm. Thể 
bình 2 tầng; cuống thể bình KT 5,5-8,0 mm x 3,0 mm; thể 
bình KT 5,0-7,5 mm x 2,0-2,5 mm. Bào tử hình cầu, hầu hết 
KT 2,5-3,0 mm, có thể đến 3,5 mm, gai ráp.
Kết luận tên loài: Aspergillus versicolor (Vuill.) 
Tiraboschi [7].
Phân loại chủng ĐTĐL-032 dựa vào trình tự gen ITS 
rDNA:
Giải trình tự gen với mồi ITS1, có trình tự sau sửa lỗi bằng 
phần mềm Bioedit như sau:
>032_ITS_ITS1:
Sau khi Blast (Blast/NCBI) thu được kết quả tương 
đồng với các trình tự dữ liệu trên genbank thể hiện tóm tắt 
ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả tóm tắt Blast search trình tự gen 032_ITS_ITS1. 
TT Ký hiệu chủng Tên loài trên genbank Tỷ lệ tương 
đồng (%)
1 MK027304.1 Aspergillus versicolor 100
2 LC105689.1 Aspergillus versicolor 100
3 NR_135443.1 Aspergillus austroafricanus 99
4 KF986424.1 Aspergillus carneus 99
5 LN898677.1 Aspergillus amoenus 99
6 NR_135361.1 Aspergillus tabacinus 99
7 NR_135353.1 Aspergillus protuberus 99
8 KP689176.1
Cladosporium 
cladosporioides
69
9 NR_077157.1 Penicillium sclerotiorum 72
Từ trình tự nghiên cứu và các trình tự tham khảo thu 
được, chúng tôi đã xây dựng cây phân loại và tính độ tương 
đồng di truyền bằng phần mềm DNASTAR, kết quả thu 
được ở hình 2 và hình 3.
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
15.7
2468101214
KF986424.1
KT119567.1
1.9
NR_135353.1
NA
NR_135361.1
12.0
LN898677.1
14.0
032_ITS_ITS1
MK027304.1
62.9
44.2
NR_077157.1
100.0
KP689176.1
Hình 2. Cây phân loại trình tự gen 032_ITS_ITS1 với các trình 
tự tham khảo trên genbank.
Qua bảng 1 và phân tích cây phân loại ở hình 2 cho thấy, 
chủng nghiên cứu có quan hệ gần gũi nhất với Asp. versicolor. 
Hình 3 cho thấy trình tự gen 032_ITS_ITS1 tương đồng trình 
tự 100% với 5 loài thuộc chi Aspergillus, khác biệt rõ ràng với 
hai chủng thuộc chi Penicillium và Cladosporium. Như vậy, 
Hình 1. Chủng ĐTĐL-032. (A-B) Khuẩn lạc và mặt trái khuẩn lạc 
(CZA), nuôi cấy 10 ngày, 250C; (C-D) Cơ quan sinh bào tử và bào 
tử trần X 1000; (E) Cơ quan sinh bào tử trần (SEM) X 3500; (F) 
Bào tử trần (SEM) X 10000.
3 
Nuôi cấy chủng nấm thuần khiết trong môi trường Malt Broth: đặt trong tủ nuôi cấy 
lắc, tốc độ 180 vòng/phút/250C trong 3-5 ngày. Thu sinh khối bằng giấy l ọc. Tách chi ết 
DNA t ổng số bằng kít tách chiết của hãng GeneAll, Hàn Quốc. Ki ểm tra nồng độ, độ sạch 
của DNA t ổng số bằng máy đo quang (Nano photometer, IMPLEN). Điều chỉnh nồng độ 
DNA t ổng số để đạt khoảng 50 ng/μl đến 150 ng/μl. 
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen vi nấm với cặp mồi ITS1 và ITS4. Trình t ự của 
mồi ITS1: 5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCG GG -3’ (m ồi xuôi), ITS4: 5'-
TCCTCCGCTTATTGATATGC -3 (mồi ngược). Chu trình nhiệt: 94oC/1’; (94oC/30’’ - 
560/30’’ - 68oC/45’’) x 35 chu k ỳ; 68oC/7’. 
Tinh sạch sản phẩm DNA vi n ấm sau PCR b ằng kít tinh sạch của hãng GeneAll, 
Hàn Quốc. Ki ểm tra nồng độ, độ tinh sạch DNA b ằng máy đo quang. Điều chỉnh nồng độ 
DNA t ổng số, đạt khoảng 20 ng/μl đến 30 ng/μl. 
Gi ải trình tự gen trực tiếp sử dụng mồi ITS1 trên h ệ thống ABI 3130. Phân tích trình 
tự gen, xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng phần mềm Bioedit, DNASTAR, công 
cụ Blast và các dữ liệu trên genbank [1, 2, 8]. 
Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính các enzyme vi nấm: 
Xác định hoạt tính các enzyme collagenase, gelatinase, cellulase theo phương pháp 
thạch đĩa: môi trường cơ chất collagen 0,1% (nutrient agar 20 g, collagen 1 g), cơ chất 
gelatin 0,4% (nutrient agar 20 g, gelatin 4 g), cơ chất cellulo 1% (CZA 48 g, 
carboxymethyl cellulose-CMC 10 g). Môi trư ờng cơ chất pha trong 1.000 ml nước cất, 
hấp vô trùng ở 1210C/15 phút, để nguội khoảng 450C, phân phối vào các đĩa petri. Cấy 
các chủng vi nấm lên đĩa môi trường thành 3 điểm, đặt trong tủ ấm ở 250C trong 5 ngày. 
Dùng thuốc thử HgCl 2 đổ láng trên bề mặt đĩa thạch có cơ chất collagen hoặc gelatin, 
thuốc thử KI v ới đĩa thạch có CMC. Đo bán kính khu ẩn lạc và bán kính vòng phân giải 
(vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc), xác định hệ số phân giải cơ chất (I) theo công 
thức: I = R 2
2/R1
2. Trong đó: R 2 là bán kính vòng phân giải, R 1 là bán kính khuẩn lạc. H ệ 
số phân giải I càng l ớn thì hoạt tính enzyme càng cao [4]. 
K ết quả nghiên cứu 
ẩn lạc và các 
 D
C
B
A 
F
E
Hình 3. Tương đồng di truyền trình tự gen 032_ITS_ITS1 với các 
trình tự tham khảo trên genbank.
3360(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
qua phân tích trình tự gen với mồi ITS1, chủng ĐTĐL-032 có 
quan hệ gần gũi nhất với loài Asp. versicolor. Kết quả này là 
phù hợp và bổ sung cho phân loại dựa vào các đặc điểm 
hình thái.
Kết quả phân loại chủng vi nấm ĐTĐL-207
Phân loại chủng ĐTĐL-207 bằng phương pháp hình 
thái: hình ảnh khuẩn lạc và các hình ảnh vi thể, siêu vi thể 
của chủng được trình bày ở hình 4.
Hình 4. Chủng ĐTĐL-207. (A-B) Khuẩn lạc và mặt trái khuẩn lạc 
(CZA), nuôi cấy 10 ngày, 250C; (C) Cơ quan sinh bào tử và bào 
tử trần X1000; (D) Đầu sinh bào tử nhỏ X1000, (E) Cơ quan sinh 
bào tử trần (SEM) X3500; (F) Đầu sinh bào tử nhỏ (SEM) X3500.
Mô tả chủng: 
Đặc điểm khuẩn lạc: khuẩn lạc trên môi trường CZA đạt 
3-3,5 cm trong 14 ngày ở nhiệt độ phòng, có khía phân vùng 
đồng tâm. Mặt khuẩn lạc dạng len, xốp nhẹ, tạo thành các 
đám bào tử vùng trung tâm, có màu lục nhạt, sau chuyển 
sang màu lục xám; giọt tiết thường nhiều, màu vàng rơm 
đến đỏ cam; mặt trái màu đỏ san hô đến đỏ sẫm.
Đặc điểm vi thể, siêu vi thể: cuống sinh bào tử dài khoảng 
500 mm, đường kính 5-8 mm, thành dày, nhẵn, không màu; 
bọng hình gần cầu, KT 15-20 mm. Thể bình 2 tầng, bao phủ 
hầu khắp bề mặt bọng; cuống thể bình thường KT 6,0-7,0 
mm x 2,0-3,0 mm; thể bình KT 7,0-9,5 mm x 2,0-2,5 mm. 
Bào tử hình gần cầu đến cầu, hầu hết KT 2,5-3,0 mm, có thể 
đến 3,5 mm, gai ráp. Có các đầu sinh bào tử nhỏ được sinh 
ra từ các sợi nấm khí sinh, có KT nhỏ (dạng Penicillium - 
hình 4D, F), có thể có bọng hoặc không.
 Kết luận tên loài: Aspergillus sydowi (Bain. and Sart.) 
Thom and Church [7].
Phân loại chủng ĐTĐL-207 dựa vào trình tự gen ITS 
rDNA:
Giải trình tự gen với mồi ITS1, có trình tự sau sửa lỗi bằng 
phần mềm Bioedit như sau:
>207_ITS_ITS1:
C C A A C C T C C C A C C C G T G A ATA C C TA A C A C T G T T G C T T C G G
C G G G G A A C C C C C T C G G G G G C G A G C C G C C G G G G A C TA C T G A
A C T T C AT G C C T G A G A G T G AT G C A G T C T G A G T C T G A ATATA A A
AT C A G T C A A A A C T T T C A A C A AT G G AT C T C T T G G T T C C G G C AT
C G AT G A A G A A C G C A G C G A A C T G C G ATA A G TA AT G T G A AT T G C
AGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCC
CCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGC
CCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGG
GGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCG
AGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGG
CGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGA
TCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGA
Kết quả Blast thu được tỷ lệ tương đồng với các trình tự 
dữ liệu trên genbank được thể hiện tóm tắt ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả tóm tắt Blast search trình tự gen 207_ITS_ITS1. 
TT Ký hiệu chủng Tên loài trên genbank Tỷ lệ tương 
đồng (%)
1 LC105687.1 Aspergillus versicolor 100
2 LC105684.1 Aspergillus versicolor 100
3 MH712250.1 Aspergillus sydowi 99
4 LC105694.1 Aspergillus versicolor 99
5 KP942951.1 Aspergillus sydowi 100
6 KF313094.1 Aspergillus sydowi 100
7 KP117277.1 Aspergillus nidulan 99
8 KP689176.1
Cladosporium 
cladosporioides
87
9 NR_077157.1 Penicillium sclerotiorum 73
Từ trình tự nghiên cứu và các trình tự tham khảo thu 
được, chúng tôi đã xây dựng cây phân loại và tính độ tương 
đồng di truyền bằng phần mềm DNASTAR, kết quả thu 
được ở hình 5 và hình 6.
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
16.8
246810121416
207_ITS_ITS1
LC105694.1
29.3
LC105684.1
23.0
LC105687.1
18.2
MH712250.1
NA
KP117277.1
64.4
KP942951.1
KF313094.1
46.4
32.5
NR_077157.1
100.0
KP689176.1
5 
Nucleotide Substitutions (x100)
Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
15.7
2468101214
KF986424.1
KT119567.1
1.9
NR_135353.1
NA
NR_135361.1
12.0
LN898677.1
14.0
032_ITS_ITS1
MK027304.1
62.9
44.2
NR_077157.1
100.0
KP689176.1
Hình 2 . Cây phân lo ại trình t ự gen 032_ITS_ITS1 v ới các trình t ự tham kh ảo trên genbank. 
Hình 3: T ương đồng di truy ền trình t ự gen 032_ITS_ITS1 v ới các trình t ự tham kh ảo trên genbank. 
Qua bảng 1 và phân tích cây phân loại ở hình 2 cho thấy, chủng nghiên cứu có quan hệ gần 
gũi nhất với Asp. versicolor. Hình 3 cho thấy trình tự gen 032_ITS_ITS1 tương đ ồng trình tự 
100% với 5 loài thuộc chi Aspergillus, khác biệt rõ ràng với hai chủng thuộc chi Penicillium và 
Cladosporium. Như vậy, qua tích trình tự gen với mồi ITS1, ch ủng ĐTĐL -032 có quan 
hệ gần gũi nhất với loài Asp. versicolor. K ết quả này là phù hợp và bổ sung cho phân loại 
CA E
6 
nhiệt độ phòng, có khía phân vùng đồng tâm. Mặt khuẩn lạc dạng len, xốp nhẹ, tạo thành 
các đám bào tử vùng trung tâm, có màu lục nhạt, sau chuyển sang màu lục xám; giọt tiết 
thường nhiều, màu vàng rơm đến đỏ cam; mặt trái màu đỏ san hô đến đỏ xẫm. 
Đặc điểm vi thể, siêu vi thể: cuống sinh bào tử dài khoảng 500 m, đường kính 5-8 
m, thành dày, nhẵn, không màu; bọng hình gần cầu, KT 15 -20 m. Thể bình 2 tầng, bao 
phủ hầu khắp bề mặt bọng; cuố thể bình thường KT 6,0 -7,0 m x 2,0-3,0 m; thể bình 
KT 7,0 -9,5 m x 2,0-2,5 m. Bào tử hình gần cầu đến cầu, hầu hết K T 2,5 -3,0 m, có thể 
đến 3,5 m, gai ráp. Có các đầu sinh bào tử nhỏ được si h ra từ các sợi nấm khí sinh, có 
KT nhỏ (dạng Penicillium - hình 4D, F) , có thể có bọng hoặc không. 
 K ết luận tên loài: Aspergillus sydowi (Bain. and Sart.) Thom and Church [7]. 
Phân loại chủng ĐTĐL -207 dựa vào trình tự gen ITS rDNA : 
Giải trình tự gen với mồi ITS1, có trình t ự sau sửa lỗi bằng p ần mềm Bioedit như sau: 
>207_ITS_ITS1 : 
CCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGC
GAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGA TGCAGTCTGAGTCTGAATATAAA
ATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAC
TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCG
CCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTG
TGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGC GGCGGCACCGTGTCCG
GTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACG
TCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCA
TATCAATAAGCCGGA 
K ết quả Blast thu được tỷ lệ tương đồng với các trình tự dữ liệu trên genbank được thể 
hiện tóm tắt ở bảng 2. 
B ảng 2. K ết quả tóm tắt blast search trình t ự gen 207_ITS_ITS1 . 
TT Ký hi ệu chủng Tên loài trên genbank T ỷ lệ tương đồng (%) 
1 LC105687.1 Aspergillus versicolor 100 
2 LC105684.1 Aspergillus versicolor 100 
3 MH712250.1 Aspergillus sydowi 99 
4 LC105694.1 Aspergillus versicolor 99 
5 KP942951.1 Aspergillus sydowi 100 
6 KF313094.1 Aspergillus sydowi 100 
7 KP117277.1 Aspergillus nidulan 99 
8 KP689176.1 Cladosporium cladosporioides 87 
9 NR_077157.1 Penicillium sclerotiorum 73 
DB F
Hình 5. Cây phân loại trình tự gen 032_ITS_ITS1 với các trình tự 
tham khảo trên genbank phân tích bằng phần mềm DNASTAR 
V7.0.
3460(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Hình 6. Tương đồng di truyền trình tự gen 207_ITS_ITS1 với 
các trình tự tham khảo trên genbank phân tích bằng phần mềm 
DNASTAR V7.0.
Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính 
một số enzyme 
Xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính một số 
enzyme của 2 chủng vi nấm thông qua xác định hệ số phân 
giải cơ chất (I). Kết quả giá trị hệ số I thể hiện ở bảng 3; 
minh họa khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase 
ở hình 7.
Bảng 3. Khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính một số enzyme của 
2 chủng nấm.
TT Tên chủng
Hệ số phân giải cơ chất (I) trung bình (n=6)
Gelatin Collagen Cellulo
1 ĐTĐL-032 6,7 ± 0,5 11,4 ± 0,9 0,0
2 ĐTĐL-207 5,0 ± 0,9 4,6 ± 0,3 3,6 ± 0,2
Bàn luận 
Hai chủng vi nấm ĐTĐL-032 và ĐTĐL-207 khi nuôi 
cấy trên môi trường CZA ở nhiệt độ 250C trong 10 ngày, 
thấy tốc độ phát triển khuẩn lạc của chủng ĐTĐL-032 (3 
cm) kém hơn ĐTĐL-207 (3,5 cm) không đáng kể. Hình 
thái khuẩn lạc giữa hai chủng trong vòng 3 ngày đầu khá 
giống nhau; sau 10 ngày có sự khác nhau nhiều hơn, chủng 
ĐTĐL-207 có màu lục sẫm hơn, mặt trái có màu đỏ tía rõ 
hơn, giọt tiết to và thẫm màu hơn. Quan sát đặc điểm vi thể, 
siêu vi thể thấy cơ quan sinh bào tử và bào tử trần của hai 
chủng có KT và hình dạng giống nhau. Điểm khác biệt là 
chủng ĐTĐL-207 có xuất hiện thêm cơ quan sinh bào tử 
dạng nhỏ từ các sợi nấm khí sinh (hình 4D, F). Các đầu sinh 
bào tử này có đặc điểm là KT nhỏ hơn cơ quan sinh bào tử 
bình thường, có thể có bọng hoặc không; chúng được sinh 
ra từ các sợi nấm khí sinh và tồn tại song song cùng các cơ 
quan sinh bào tử bình thường (có đủ cuống, bọng, cuống 
thể bình và thể bình). Các đặc điểm này có thể quan sát 
thấy trên cả kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử 
quét. Đây là những đặc điểm khác nhau giúp phân biệt giữa 
Asp. sydowi (chủng ĐTĐL-207) và Asp. vesicolor (chủng 
ĐTĐL-032). Hai loài này đều thuộc Aspergillus vesicolor 
group trong chi Aspergillus [5, 7, 8]. 
Chủng ĐTĐL-032 trong phân loại bằng giải trình tự gen 
cho thấy có độ tương đồng 100% với các chủng thuộc loài 
Asp. vesicolor khi blast. Khi phân tích cây phân loại thấy 
chủng này có quan hệ gần gũi nhất với Asp. vesicolor, có độ 
tương đồng di truyền 100% với 5 trình tự tham khảo trong 
đó có Asp. vesicolor. Chủng ĐTĐL-207 trong phân loại 
bằng giải trình tự gen cho thấy có độ tương đồng 100% với 
các chủng thuộc loài Asp. vesicolor và cả Asp. sydowi khi 
blast. Khi phân tích cây phân loại thấy chủng này có quan hệ 
gần gũi nhất với Asp. vesicolor, có độ tương đồng di truyền 
100% với 5 trình tự tham khảo, trong đó có cả Asp. vesicolor 
và Asp. sydowi. Như vậy, phân loại bằng trình tự gen đoạn 
ITS với cặp mồi ITS1-ITS4 chưa thể phân loại xác định 
chủng ĐTĐL-207 thuộc về loài nào. Z. Jurjevic và cộng sự 
(2012) khi phân biệt 9 loài thuộc nhóm Asp. vesicolor ngoài 
trình tự gen vùng ITS, phải dùng tới nhiều vùng khác thuộc 
rDNA hoặc các gen chức năng như camodulin, β-tubulin 
[8]. Trong phân loại vi nấm hiện nay, phương pháp hình 
thái vẫn là phương pháp chính để phân loại. Các phương 
pháp khác như sinh hóa, sinh học phân tử giúp định loại 
bổ sung, làm rõ thêm cho phương pháp hình thái, bổ sung, 
làm rõ các mối quan hệ tiến hóa của các loài vi nấm [1, 8]. 
Như vậy, kết hợp 2 phương pháp phân loại, Viện 69 xác 
định chủng ĐTĐL-032 thuộc về loài Asp. vesicolor, chủng 
ĐTĐL-207 thuộc về loài Asp. sydowi. 
Hai chủng vi nấm phân lập được tại Viện 69 thuộc các 
loài vi nấm ưa khô, không bắt buộc phải sống trong điều 
kiện độ ẩm khô (<85%), có thể thích nghi phát triển ở điều 
kiện độ ẩm không khí cao hơn [7]. Khi nghiên cứu đặc điểm 
sinh tổng hợp và hoạt tính 3 enzyme, thấy cả 2 chủng đều có 
khả năng phân giải collagen và gelatin, chủng ĐTĐL-032 
không có khả năng phân giải cellulo. Đây là hai loài vi nấm 
có thể gây hư hỏng các tiêu bản đang bảo quản ở Viện 69. 
Hình 7. Các chủng vi nấm phân hủy cơ chất. (A) Chủng ĐTĐL-
032 phân giải collagen; (B) Chủng ĐTĐL-207 phân giải collagen; 
(C) Chủng ĐTĐL-032 phân giải gelatin; (D) Chủng ĐTĐL-207 
phân giải gelatin; (E) Chủng ĐTĐL-032 không phân giải cellulo; 
(F) Chủng ĐTĐL-207 phân giải cellulo.
8 
Bàn lu ận 
Hai chủng vi nấm ĐTĐL -032 và ĐTĐL -207 khi nuôi cấy trên môi trường CZA ở nhiệt 
độ 250C trong 10 ngày, thấy tốc độ phát triển khuẩn lạc của chủng ĐTĐL -032 (3 cm) kém 
hơn ĐTĐL -207 (3,5 cm) không đáng kể. Hình thái khuẩn lạc giữa hai chủng trong vòng 3 
ngày đầu khá giống nhau; sau 10 ngày có sự khác nhau nhiều hơn, chủng ĐTĐL -207 có 
màu lục sẫm hơn, mặt trái có màu đỏ tía rõ hơn, giọt tiết to và thẫm màu hơn. Quan sát 
đặc điểm vi thể, siêu vi thể thấy cơ quan sinh bào tử và bào tử trần của hai chủng có KT 
và hình dạng giống nhau. Điểm khác biệt là chủng ĐTĐL -207 có xuất hiện thêm cơ quan 
sinh bào tử dạng nhỏ từ các sợi nấm khí sinh (hình 4D, F) . Các đầu sinh bào tử này có đặc 
điểm là KT nhỏ hơn cơ quan sinh bào tử bình thường, có thể có bọng hoặc không; chúng 
được sinh ra từ các sợi nấm khí sinh và tồn tại song song cùng các cơ quan sinh bào tử 
bình thường (có đủ cuống, bọng, cuống thể bình và thể bình). Các đặc điểm này có thể 
quan sát thấy trên cả kính hiển quang học và kính hiển vi điện tử quét. Đây là những đặc 
điểm khác nhau giúp phân biệt giữa Asp. sydowi (chủng ĐTĐL -207) và Asp. vesicolor 
(chủng ĐTĐL -032). Hai loài này đều thuộc Aspergillus vesicolor group trong chi 
Aspergillus [5, 7, 8] . 
Chủng ĐTĐL -032 trong phân loại bằng giải trình tự gen cho thấy có độ tương đồng 
100% với các chủng thuộc loài Asp. vesicolor khi blast. Khi phân tích cây phân loại thấy 
chủng này có quan hệ gần gũi nhất với Asp. vesicolor, có độ tương đồng di truyền 100% 
với 5 trình tự tham khảo trong đó có Asp. vesicolor. Chủng ĐTĐL -207 trong phân loại 
bằng giải trình tự gen cho thấy có độ tương đồng 100% với các chủng thuộc loài Asp. 
vesicolor và cả Asp. sydowi khi blast. Khi phân tích cây phân loại thấy chủng này có quan 
hệ gần gũi nhất với Asp. vesicolor, có độ tương đồng di truyền 100% với 5 trình tự tham 
khảo trong đó có cả Asp. vesicolor và Asp. sydowi. Như vậy, phân loại bằng trình tự gen 
đoạn ITS v ới cặp mồi ITS1 -ITS4 chưa th ể phân loại xác định chủng ĐTĐL -207 thuộc về 
loài nào. Z. Jurjevic và cộng sự (2012) khi phân biệt 9 loài thuộc nhóm Asp. vesicolor 
A 
B 
C 
D 
E 
F 
3560(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Việc nghiên cứu khả năng phân hủy các cơ chất sinh học 
của vi nấm được nhiều tác giả quan tấm do có ý nghĩa trong 
nhiều ngành, nhiều lĩnh vực đời sống, công nghiệp, thương 
mại, khoa học như da giày, chế biến, bảo quản lương thực 
thực phẩm, bảo tồn bảo tàng [3].
Kết luận
Nghiên cứu về hai chủng vi nấm phân lập được ở Viện 
69, chúng tôi rút ra những kết luận sau:
1. Hai chủng vi nấm thuộc về chi Aspergillus, chủng 
ĐTĐL-032 thuộc về loài Asp. vesicolor, chủng ĐTĐL-207 
thuộc về loài Asp. sydowi. 
Kết quả phân loại loài vi nấm dựa vào hình thái vi nấm 
có ý nghĩa quyết định, phân loại bằng giải trình tự đoạn gen 
ITS rDNA chỉ giúp bổ sung, làm rõ phân loại cho 1 trong 2 
chủng nghiên cứu.
2. Chủng vi nấm ĐTĐL-032 có khả năng phân hủy 2 cơ 
chất (collagen và gelatin), chủng ĐTĐL-207 có khả năng 
phân hủy 3 cơ chất (collagen, gelatin, cellulo).
LỜI CẢM ƠN
Nhóm thực hiện đề tài xin trân trọng cảm ơn các Thủ 
trưởng, đồng nghiệp ở Viện 69, Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng 
Chủ tịch Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và cùng phối hợp 
thực hiện nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu này thuộc 
đề tài nghiên cứu khoa học độc lập cấp quốc gia mã số 
ĐTĐLCN.31/15, thực hiện trong giai đoạn 2015-2018.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] A.J. Chen, V. Hubka, et al. (2017), “Polyphasic taxonomy 
of Aspergillus section Aspergillus (formerly Eurotium), and its 
occurrence in indoor environments and food”, Studies in Mycolgy, 
88, pp.37-135.
[2] A.R. Huzefa, et al. (2017), “Fungal identification using molecular 
tools: a primer for the natural products research community”, Journal of 
Natural Products, 80, pp.756-770.
[3] A.W. Maria Carolina, et al. (2017), “Collagenolytic enzymes 
produced by fungi: a systematic review”, Brazilian Journal of 
Microbiology, 48, pp.13-24.
[4] Nguyễn Lân Dũng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi 
sinh vật học, 3, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.25-45.
[5] K. Ando (2002), “Identification of Fungi inperfecti”, NITE, 
Japan, pp.38-55.
[6] Nguyễn Kim Giao (2004), Hiển vi điện tử trong khoa học sự 
sống, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.43-58.
[7] B. Raper & D. Fennell (1965), The genus Aspergillus, Baltimo 
Wiliam & Wilkin, USA, pp.442-490.
[8] Z. Jurjevic, et al. (2012), “Aspergillus section Versicolores: 
nine new species and multilocus DNA sequence based phylogeny”, 
International Mycological Association Fungus, 3(1), pp.59-79.