Phát hiện các gene blaoxa ở acinetobacter baumannii bằng phương pháp multiplex pcr ‐ Elisa

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 458 
PHÁT HIỆN CÁC GENE BLAOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII 
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR‐ELISA 
Nguyễn Sĩ Tuấn*, Lưu Trần Linh Đa*, Lê Duy Nhất*, Hứa Mỹ Ngọc*, Nguyễn Ngọc Thanh*,  
Phạm Thị Thanh Thủy*, Phạm Văn Dũng*, Nguyễn Thúy Hương** 
TÓM TẮT 
Đặt vấn  đề: Acinetobacter baumannii (AB) kháng đa kháng sinh bằng nhiều cơ chế, bao gồm giảm tính 
thấm qua màng, biểu hiện quá mức bơm  thải kháng  sinh và  sản xuất carbapenemase. Năm 2013, AB kháng 
carbapenem bùng phát mạnh ở nhiều bệnh viện. Tính kháng này có thể do sự sản xuất các carbapenemase, trong 
đó các oxacillinase thủy phân carbapenem thuộc lớp D (OXA‐23, OXA‐40, OXA‐58 và OXA‐51) được công bố 
phổ biến nhất ở Châu Á – Thái Bình Dương.  
Mục tiêu: Phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng 
Nai năm 2013. 
Phương pháp nghiên cứu: Multiplex PCR – ELISA được tiến hành để phát hiện các blaOXA mã hoá các 
oxacillinase thuỷ phân carbapenem ở AB và sau đó, kết quả được kiểm tra bằng multiplex PCR truyền thống. 
Kết quả: Trong 66 chủng AB thử nghiệm, có 83,3% kiểu gene kháng carbapenem là blaOXA‐23 và 16,67% 
blaOXA‐58. Có tới 97% các chủng AB mang gene blaOXA‐51. 
Kết luận: Cần tiến hành cách ly các bệnh nhân nhiễm trùng do AB có lưu hành các blaOXA, đặc biệt là các 
gene nằm trên plasmid, nhằm ngăn ngừa sự phát tán gene kháng thuốc. 
Từ khóa: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58. 
ABSTRACT 
DETECT BlaOXA GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII BY MULTIPLEX PCR – ELISA 
METHOD 
Nguyen Si Tuan, Luu Tran Linh Da, Le Duy Nhat, Hua My Ngoc, Nguyen Ngoc Thanh,  
Pham Thi Thanh Thuy, Pham Van Dung, Nguyen Thuy Huong 
 * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 458 – 462 
Background:  Acinetobacter  baumannii  (AB)  multiple  antibiotic  resistance  by  various  mechanisms, 
including decreased membrane permeability, antibiotic pump overexpression and carbapenemase production. In 
2013, outbreak of carbapenem which are resistant to AB occured in many hospitals. This resistance may be due to 
the production of carbapenemase, in which the hydrolysis oxacillinase carbapenem class D (OXA ‐ 23, OXA ‐ 40, 
OXA ‐ 58 and OXA ‐ 51) was documented most in Asian Pacific Ocean. 
Objectives: To detect the gene blaOXA in AB strains accuired at Thong Nha‐ Dong Nai General Hospital in 2013. 
Methods: Multiplex PCR ‐ ELISA was performed to detect blaOXA encoded oxacillinase in AB and then, the 
results were confirmed by multiplex PCR. 
Result: In 66 AB strains tested, 83.3% genotypes resisted to carbapenem was blaOXA‐23 and 16.67% blaOXA‐58. 
Up to 97% of the AB strain was carrying blaOXA‐51 gene. 
Conclusion: It is necessary to isolate patients infected AB carrying the blaOXA, especially the genes located on 
plasmid in order to prevent the spread of resistance genes. 
*Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai   **ĐH Bách Khoa TP.HCM – Đại học Quốc gia TP.HCM 
Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Sĩ Tuấn   ĐT: 0919563 323  Email: nsituan@gmail.com 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  459
Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Trong suốt thế kỷ trước, sự bùng phát các vụ 
dịch Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc gây 
nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở những bệnh 
nhân suy giảm miễn dịch  trong các đơn vị Hồi 
sức Cấp cứu (ICU), đã được ghi nhận ở khắp các 
vùng  địa  lý  khác  nhau  trên  toàn  thế  giới(1,10). 
Những nhiễm  trùng này bao gồm nhiễm  trùng 
huyết, nhiễm trùng vết mổ, viêm màng não thứ 
cấp, nhiễm trùng đường niệu và viêm phổi liên 
quan  thở máy(1,10). Tuy nhiên, sự phát  triển gần 
đây  của  các  chủng  Acinetobacter  baumannii  sản 
xuất  Carbapenemase  lớp  D  (chủ  yếu  là 
oxacillinase),  là mối quan  tâm  lớn nhất  đối với 
cộng  đồng  khoa  học  quốc  tế,  kể  từ  khi 
Carbapenem  được  sử  dụng  thường  xuyên  để 
điều trị nhiễm các chủng Acinetobacter baumannii 
đa kháng kháng sinh(2,8). Vì những lý do này, đề 
nghị cần thiết phải có một chương trình giám sát 
trong đó bao gồm theo dõi sự kháng kháng sinh 
và các nhiễm trùng mắc phải tại ICU (là gì?), với 
việc  sử  dụng  các  phương  pháp  nhanh  chóng, 
hiệu  quả  và  đáng  tin  cậy.  Multiplex  PCR  – 
ELISA  là một phương pháp chẩn đoán mới để 
trực  tiếp  phát  hiện  các  gene  mã  hóa  OXA  – 
carbapenemase trong các bệnh phẩm lâm sàng.  
Mục tiêu nghiên cứu 
Xác định tỷ lệ các nhóm gene blaOXA lưu hành 
ở Acinetobacter baumannii  tại bệnh viện Đa khoa 
Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013 bằng multiplex 
PCR‐ELISA. 
Xác  định  lại  kết  quả  bằng  phương  pháp 
multiplex PCR. 
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Bệnh phẩm lâm sàng và chủng vi khuẩn 
66 mẫu bệnh phẩm, bao gồm: 4 ca cấy máu 
dương  tính,  6  ca  cấy mủ  vết  thương,  2  ca  cấy 
nước tiểu và 54 ca cấy đàm, được thu thập trong 
năm  2013  tại Bệnh  viện  Đa  khoa Thống Nhất, 
Đồng Nai. Các bệnh phẩm được phân  lập  trên 
môi trường MacConkey (MC). Định danh được 
tiến  hành  bằng  bộ  định  danh  API  20NE, 
Biomerieux, Pháp. 
Kiểm tra nhạy cảm kháng sinh 
Các  chủng  Acinetobacter  baumannii  thuần 
được  thử  nghiệm  nhạy  cảm  kháng  sinh  bằng 
phương  pháp Kirby‐Bauer  với  đĩa  kháng  sinh 
của  4  nhóm:  aminoglycoside,  β‐lactam 
(Imipenem  và  Meropenem),  quinolon,  và 
polymycine  (colistin)  của  hãng  Biomerieux, 
Pháp. Các  chủng kháng  carbapenem  được  tiến 
hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 
của  imipenem  và  meropenem  bằng  phương 
pháp E‐TEST, Biomerieux, Pháp. 
Tách chiết DNA và blaOXA PCR 
Các khuẩn lạc đơn – thuần khiết (một khuẩn 
lạc) được huyền phù trong 500 μl multiplex lysis 
buffer.  Lysis  buffer  được  ủ  10  phút  trong 
thermoblock ở 990C.Sau đó  ly tâm 1000 vòng/ 2 
phút, hút 5  μl dịch nổi  để  tiến hành PCR. Các 
gene mã  hóa  oxacillinase  được  xác  định  bằng 
cách  sử  dụng  kỹ  thuật multiplex  PCR  với  các 
mồi đặc hiệu cho blaOXA‐23, blaOXA‐40, blaOXA‐51, blaOXA‐
58  (OXA‐23F: 
5’GATCGGATTGGAGAACCAGA3’; OXA‐23R: 
5’–ATTTCTGACCGCATTTCCAT–3’;  OXA‐40F: 
5’–
GGAATTCCATGAAAAAATTTATACTTCC–3’; 
OXA‐40R:  5’–
CIIIATCCCGTTAAATGATTCCAAGAIIIICTA
GCG  –  3’;  OXA‐51F:  5’  – 
TAATGCTTTGATCGGCCTTG–3’;  OXA‐51R: 
5’–TGGATTGCACTTCATCTTGG–3’; OXA‐58F: 
5’–AAGTATTGGGGCTTGTGCTG–3’;  OXA‐
58R: 5’–CCCCTCTGCGCTCTACATAC–3’). Mỗi 
phản ứng multiplex PCR gồm 5 μl dịch nổi/5 μl 
chứng âm, 1 μl dung dịch Nucleotide, 2 μl dung 
dịch  mồi,  5  μl  PCR  buffer  10x,  0.2  μl  DNA 
polymerase 1U, thêm H2O cất 2 lần cho đủ 50 μl. 
PCR – ELISA 
Sản  phẩm  PCR  được  lai  đặc  hiệu  với  các 
oligonucleotide trong hệ thống ELISA. 
Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 460 
Hình 1. Lưu đồ PCR‐ELISA phát hiện oxacillinase ở Acinetobacter baumannii 
Thống kê, phân tích số liệu 
Nghiên  cứu  được  tiến  hành  theo  phương 
pháp  cắt ngang mô  tả, mẫu không xác  suất và 
thuận tiện. Số liệu được nhập bằng Epi‐data 3.1 
và xử lý bằng phần mềm Stata 11.0. 
KẾT QUẢ  
Trong nghiên cứu trước trong năm 2013, 369 
chủng  Acinetobacter  baumannii  (16,13%)  được 
phân  lập  từ  các bệnh phẩm  đàm, mủ, máu và 
nước  tiểu  trong  số  2.288 mẫu  cấy dương  tính. 
Chọn  ngẫu  nhiên  66  chủng  để  tiến  hành  thử 
nghiệm, bao gồm: 4 chủng từ cấy máu, 2 chủng 
từ  cấy  catheter  thông  tiểu,  6  chủng  từ mủ  vết 
thương hậu phẫu và 54 chủng từ đàm. 
Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 66 chủng A. Baumannii thử nghiệm 
Nhóm Kháng sinh Kháng (%) Nhạy (%) Trung gian (%)
Amino glycoside 
Amikacine 81,13 11,32 7,55 
Gentamycine 10µg 95 5 0 
Netilmycine 80,39 19,61 0 
Fluroquinolon Ciprofloxacine 94,12 5,88 0 
Tetracycline Doxycyline 48,72 51,28 0 
Cephem 
Cefatadizime 89,89 10,11 0 
Cefotaxime 100 0 0 
Cefpodoxim 100 0 0 
Cefuroxim 98,04 1,96 0 
Cefepime 88,89 11,11 0 
β-lactam/ức chế β-lactamase 
Ampicillin/Sulbactam 42,86 42,86 14,29 
Cephaperazone/Sulbactam 48,28 31,03 20,69 
Piperacillin/ tazobactam 92,59 7,41 0 
Ticarcillin/ clavulanic acid 89,19 5,41 5,41 
Carbapenem 
Imipenem 90,2 9,8 0 
Meropenem 92,73 5,45 0 
Lipopeptide Colistin 0 100 0 
Ức chế biến dưỡng Folate Bactrim 86,36 9,09 4,55 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  461
Từ  bảng  1  thấy,  đa  số  A.  baumannii  thử 
nghiệm kháng  cao với hầu hết  các kháng  sinh, 
kháng  trung  bình  với  tetracycline  và  β‐
lactam/sulbactam  và  nhạy  100%  lipopeptide 
(colistin). 
Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát 
hiện Oxacillinase ở A. baumannii. 
Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66 
Acinetobacter baumannii thử nghiệm 
Số chủng 
A. baumannii 
MIC 
của Meropenem 
MIC 
của Imipenem 
2 0,125 0,25 
1 0,38 0,38 
1 0,75 0,5 
1 4 0,19 
1 14 2 
60 >32 >32 
Từ bảng 2 cho thấy, đa số các chủng trong lô 
thử  nghiệm  (>  92%)  có MIC  (carbapenem)  >14 
μg/ml. Đây  là các chủng Acinetobacter baumannii 
có kiểu hình kháng carbapenem bằng E‐TEST. 
Bảng 3: Các nhóm gene blaOXA trong số 66 chủng A. 
baumannii nghiên cứu 
PCR-ELISA 
BỆNH PHẨM 
MÁU 
NƯỚC 
TIỂU MỦ ĐÀM 
A. baumannii 4 2 6 54 
blaOXA-23 4 0 6 45 
blaOXA-40 0 0 0 0 
blaOXA-51 4 2 6 50 
blaOXA-58 0 2 0 9 
Từ hình 3 và bảng 3 cho thấy, các nhóm gene 
blaOXA‐23(kích  thước 501 bp), blaOXA‐58  (kích  thước 
599 bp) và blaOXA‐51 (kích thước 353 bp) được phát 
hiện  khi  tiến  hành  điện  di  sản  phẩm  DNA 
khuếch  đại  trên  agarose  gel.  Nhóm  đầu  tiên 
trong các chủng  thử nghiệm dương  tính với cả 
OXA‐51  và  OXA‐23  (83,3%).  Nhóm  thứ  hai 
dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐58 (16,67%). 
Nhóm thứ ba, chỉ dương tính với OXA‐58 (2 ca, 
chiếm 0,03%). 
Hình 3: Kết quả được thiết lập sau khi multiplex PCR 
được tiến hành, sử dụng agarose gel 2% để phát hiện 
các gene blaOXA trong các Acinetobacter baumannii. 
BlaOXA‐51  là  một  gene  nội  tại  của  A. 
Baumannii(6). Đây là gene nằm trên nhiễm sắc thể, 
cần  thiết  để  điều  hoà  vùng  thượng  nguồn  bởi 
ISAba1 để kích thích tính kháng carbapenem. Tỷ lệ 
blaOXA‐51  trong  các  chủng Acinetobacter baumannii 
phân  lập  từ  lâm sàng  trong  thử nghiệm này  là 
gần  97%.  Số  liệu  này  thấp  hơn  các  phát  hiện 
trong  nghiên  cứu  được  tiến  hành  ở  Iran  bởi 
Feizabadi  và  cộng  sự  (2008),  theo  đó  có  100% 
chủng có gene blaOXA‐51 (3). 
Tỷ lệ blaOXA‐23 ở các chủng AB phân lập từ lâm 
sàng  trong  nghiên  cứu  này  là  83,3%.  Phát  hiện 
này cao hơn nhiều so tỷ lệ blaOXA‐23 chung là 66,5% 
phát  hiện  ở  các  quốc  gia  Châu  Á‐Thái  Bình 
Dương  (Ấn  Độ,  Trung  Quốc,  Thái  Lan, 
Singapore, Hồng Kông và Hàn Quốc; không  có 
Việt  Nam)(5).  Tuy  nhiên,  dựa  trên  nghiên  cứu 
khác  được  tiến  hành  bởi  Feizabadi  và  cộng  sự 
(2008), cho thấy có 36,5% các chủng Acinetobacter 
baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  có  tỷ  lệ mang 
gene  blaOXA‐23  khác  biệt  nhau  ở  trên  thế  giới(3). 
BlaOXA‐23  là một gene  đề kháng  carbapenem mắc 
phải  nằm  trên  plasmid  của  Acinetobacter 
baumannii,  vì  thế  có một  tỷ  lệ  khác  nhau  được 
Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 462 
phát  hiện  so  với  gene  blaOXA‐51  là  gene  kháng 
carbapenem xuất hiện  tự nhiên nằm  trên nhiễm 
sắc thể của AB(6,7). Tỷ lệ blaOXA‐58 trong các AB phân 
lập  từ  lâm  sàng  trong  nghiên  cứu  này  chiếm 
16,67%. Số  liệu này cao hơn  tỷ  lệ 15% blaOXA‐58 ở 
AB trong nghiên cứu của Feizabadi và cộng sự tại 
Iran  năm  2008(3). BlaOXA‐58  là  gene  vừa  nằm  trên 
nhiễm sắc thể, vừa nằm trên plasmid nên các tỷ lệ 
phân lập trên thế giới có sự khác biệt(7).  
Các kết quả này cũng phù hợp với các tổng 
kết gần đây của Tada và cộng sự công bố năm 
2013 tại chính 2 bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy, 
theo đó trong cơ chế tiết enzyme phá hủy kháng 
sinh  carbapenem,  các OXA‐carbapenemase  lớp 
D (Ambler carbapenemase lớp D) phổ biến trên 
toàn  thế  giới  và  khu  vực Châu  á  –  Thái  Bình 
Dương lưu hành chủ yếu các chủng Acinetobacter 
baumannii mang gene mã hóa nhóm OXA‐23(9). 
KẾT LUẬN 
Acinetobacter  baumannii  kháng  cao  với  hầu 
hết  các  kháng  sinh,  kháng  trung  bình  với 
tetracycline  và  β‐lactam/sulbactam  và  nhạy 
100% lipopeptide.  
Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, có bằng 
chứng  rõ  ràng  rằng  các  nhóm  gene  blaOXA 
(carbapenemase  lớp D)  là một vấn đề trong các 
chủng Acinetobacter  baumannii  phân  lập  từ  lâm 
sàng  tại bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng 
Nai. Các nhóm blaOXA nằm trên plasmid (OXA‐23 
và có thể là OXA‐58) có tỷ lệ khác biệt so với các 
nghiên cứu khác trên thế giới. 
Kỹ thuật multiplex PCR‐ELISA được chứng 
minh là kỹ thuật nhanh và chính xác để kiểm tra 
nhạy cảm kháng sinh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều 
việc  phải  cải  tiến  để  có  thể  áp  dụng  kỹ  thuật 
multiplex PCR như  là  1  chọn  lựa  thay  thế  cho 
các xét nghiệm nhạy cảm kháng sinh hiện nay. 
KIẾN NGHỊ 
Khả năng Acinetobacter baumannii tăng trưởng 
trong màng biofilms đặt ra một mối đe doạ  liên 
quan  tới  khả  năng  lây  lan  của  chủng  vi  khuẩn 
này, theo đó phát tán các gene kháng thuốc, cần 
được điều tra nghiên cứu trong tương lai. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bergogne‐Berezin  E.,  Towner KJ.  (1996). Acinetobacter  spp.  as 
nosocomial  pathogens:  microbiological,  clinical,  and 
epidemiological features. Clinical microbiology Reviews. 9(2) 148. 
2. Brown S, Amyes SGB (2005). The sequences of seven class D 
β‐lactamases  isolated  from  carbapenem‐resistant 
Acinetobacter  baumannii  from  four  continents.  Clinical 
Microbiology And Infection. 11(4), 326‐329. 
3. Feizabadi  MM,  Fathollahzadeh  B,  Taherikalani  M  (2008). 
Antimicrobial  susceptibility  patterns  and  distribution  of 
blaOXA  genes  among  Acinetobacter  spp.  isolated  from 
patients at Tehran hospitals. J Infect Dis. 61(4). 274‐8. 
4. Lain  A.  Gustavo  MC.  Saruar  B.  Anton  YP.  (2013). 
Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii.  Expert 
Rev Anti Infect Ther. 11(4). 395 – 409. 
5. Mendes RE, Bell JM, Turnidge JD, Castanheira M, Jones RN 
(2009). Emergence and widespread dissemination of OXA‐23. 
‐24/40 and –58 carbapenemases among Acinetobacter spp  in 
Asia‐Pacific  nations:  report  from  the  SENTRY  Surveillance 
Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 63. 55‐59. 
6. Merkier AK, Centrón D (2006). Bla‐OXA‐51‐type β‐lactamase 
genes  are  ubiquitous  and  vary  within  a  strain  in 
Acinetobacter baumannii. International Journal Of Antimicrobial 
Agents. 28(2). 110‐113. 
7. Perez  F,  Hujer  AM,  Hujer  KM,  Decker  BK,  Rather  PN, 
Bonomo RA,  (2007). Global  challenge of multidrug‐resistant 
Acinetobacter  baumannii.  Antimicrobial  agents  and 
chemotherapy. 51(10). 3471‐3484. 
8. Poirel  L,  Nordmann  P  (2006).  Carbapenem  resistance  in 
Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology. 
Clinical microbiology and infection. 12(9). 826‐836. 
9. Tada T, Miyoshi‐Akiyama T, Kato Y (2013). Emergence of 16S 
rRNA  methylase‐producing  Acinetobacter  baumannii  and 
Pseudomonas  aeruginosa  isolates  in  hospitals  in  Vietnam. 
BMC infectious diseases. 13(1). 251. 
10. Villegas MV, Hartstein AI  (2003). Acinetobacter Outbreaks. 
1977‐2000. Infection control and hospital epidemiology. 24(4). 284‐
295. 
Ngày nhận bài báo:       10/5/2014 
Ngày phản biện nhận xét bài báo:   16/6/2014 
Ngày bài báo được đăng:     14/11/2014