Phát hiện các loài colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 12: 1025-1038 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(12): 1025-1038 
www.vnua.edu.vn 
1025 
PHÁT HIỆN CÁC LOÀI Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT 
BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE 
Nguyễn Duy Hưng1*, Hà Viết Cường2, Hoàng Chúng Lằm1 
1
Viện nghiên cứu Rau quả, 2Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 
*Tác giả liên hệ: duyhungfavri@gmail.com 
Ngày nhận bài: 21.01.2019 Ngày chấp nhận đăng: 19.02.2019 
TÓM TẮT 
Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là một trong các bệnh nguy hiểm nhất trên ớt tại Việt Nam và thế 
giới. Định danh loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trên các đặc điểm hình thái thường gây ra sự nhầm lẫn. 
Mục tiêu của nghiên cứu là thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán nhanh, chính xác loài nấm 
Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR. Trong nghiên cứu này dựa trên trình tự 
vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) và vùng liên gen của 2 gen apn2 và MAT1-2-1 genes (ApMat) đã thiết kế 
được 4 cặp mồi đặc hiệu. Các cặp mồi thiết kế đã phát hiện đặc hiệu 4 loài C. truncatum, C. fructicola, C. 
gloeosporioides sensu stricto và C. siamense gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh. Nghiên 
cứu cũng chứng tỏ phương pháp chiết nhanh DNA bằng NaOH có hiệu quả cao nhằm chuẩn bị mẫu DNA từ nấm 
Colletotrichum cho phản ứng PCR. Phân tích PCR dùng các mồi đặc hiệu trên 52 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh 
thán thư ớt thu tại 9 tỉnh đồng bằng Sông Hồng, 3 tỉnh trung du và miền núi phía Bắc và 1 tỉnh đồng bằng Sông Cửu 
Long đã xác định được loài phổ biến nhất là C. siamense (chiếm 51,9% tổng số mẫu), tiếp theo là C. fructicola 
(21,2%), C. truncatum (15,4%), và C. gloeosporioides sensu stricto (9,6%). 
Từ khóa: Bệnh thán thư ớt, Colletotrichum, chẩn đoán, mồi đặc hiệu, PCR. 
Detection of Colletotrichum Species Causing Anthracnose of Chili 
by Polymerase Chain reaction 
ABSTRACT 
Anthracnose caused by Colletotrichum spp. is one of the most destructive diseases of chili in Vietnam and 
worldwide. Identifying Colletotrichum species that cause anthracnose based on morphological characteristics often 
causes confusion. The objective of the study was to design specific primer pairs for rapid and accurate diagnosis of 
Colletotrichum fungus causing anthracnose by PCR (polymerase chain reaction). In the study, based on the Internal 
Transcribed Spacer (ITS) region and the intergenic region of apn2 and MAT1-2-1 genes (ApMat) four specific primer 
pairs were designed. Four species,i.e. C. truncatum, C. fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto and C. siamense 
that cause chili anthracnose in the Red River Delta and some other provinces were detected. The study also showed 
that a modified rapid extraction protocol using NaOH was highly effective to prepare DNA samples from 
Colletotrichum cultures for PCR reaction. PCR analyses using the newly designed specific primers on 52 chili 
Colletotrichum isolates collected from 13 provinces, mainly the Red River Delta, revealed C. siamense as the most 
abundant species (51.9% of total isolates), followed by C. fructicola (21.2%), C. truncatum (15.4%), and C. 
gloeosporioides sensu stricto (9.6%). 
Keywords: Colletotrichum, chili, specific primer design, diagnosis, PCR. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Trong sø các bệnh häi ĉt, bệnh thán thā do 
nçm Colletotrichum spp. gåy ra đāČc xem là 
nguy hiểm nhçt. Cho tĉi nëm 2008, thành phæn 
loài Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt công 
bø trên thế giĉi khá đa däng, bao g÷m ít nhçt 7 
loài C. gloeosporioides, C. capsici, C. acutatum, 
C. coccodes, C. dematium, C. nigrum và 
C. atramentarium (Than et al., 2008). Täi Việt 
Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase 
1026 
Nam, ít nhçt 4 loài là C. acutatum, 
C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum đã đāČc 
công bø gây bệnh thán thā ĉt (Don et al., 2007; 
Ngô Bích Hâo, 1992). 
Đðnh danh nçm Colletotrichum dĆa vào các 
đặc điểm hình thái thāĈng khöng đþ để phân 
loäi tĉi măc loài nên đã cò quá nhiều nhæm lén 
trong phân loäi chi nçm này (Hyde et al., 2009). 
Gæn đåy, đðnh danh nçm Colletotrichum dĆa 
trên phân tích phân tĄ ngày càng phù biến và 
dén tĉi nhiều thay đùi trong phân loäi các loài 
thuûc chi này (Cannon et al., 2012). 
Đøi vĉi nçm Colletotrichum gây bệnh thán 
thā trên ĉt, các nghiên cău phân loäi mĉi gæn 
đåy cho thçy có sĆ thay đùi lĉn về thành phæn 
loài so vĉi các công bø trāĉc đåy. Täi Ấn Đû, 
đðnh danh läi 52 méu nçm C. gloeosporioides 
sensu lato cho thçy chúng thuûc 2 loài là 
C. fructicola vàC. siamense (Sharma & Shenoy, 
2013). Tāćng tĆ, 2 loài C. acutatum và 
C. capsici, vøn đāČc coi là 2 loài chính gây häi 
trên ĉt täi Thái Lan nay đāČc đðnh danh läi læn 
lāČt là C. simmondsii và C. truncatum (Ko et 
al., 2011). Cÿng täi Thái Lan, gæn đåy hćn 4 loài 
Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt đã đāČc 
xác đðnh là C. gloeosporioides sensu stricto, 
C. siamense, C. acutatum và C. truncatum 
(Suwannarat et al., 2017). Täi Trung Quøc, 
phân tích trình tĆ cþa 1285 méu nçm 
Colletotrichum thu täi 29 tînh đã xác đðnh đāČc 
15 loài trong đò cò 5 loài phù biến là 
C. fioriniae, C. fructicola, C. gloeosporioides 
sensu stricto , C. scovillei, and C. truncatum 
(Diao et al., 2017). Täi Úc, phân tích 45 méu 
nçm Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt đã xác 
đðnh đāČc 5 loài C. siamense, C. simmondsii, 
C. queenslandicum, C. truncatum và 
C. cairnsense (De Silva et al., 2017). 
Trong nëm 2017, dĆa trên đặc điểm hình 
thái và giâi trình tĆ vùng Internal Transcribed 
Spacer (ITS) và vùng liên gen cþa 2 gen apn2 và 
MAT1-2-1 (ApMat) cþa các méu Colletotrichum 
gây bệnh thán thā ĉt thu täi đ÷ng bìng sông 
H÷ng, ít nhçt 5 loài là C. truncatum, 
C. fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto, 
C. aeschynomenes, C. siamense đã đāČc xác 
đðnh (Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017). 
Xác đðnh chính xác thành phæn cÿng nhā 
đðnh danh đýng nçm Colletotrichum có vai trò 
quan trõng không nhąng về mặt khoa hõc mà 
còn trong thĆc tiễn quân lý bệnh vì quan hệ 
giąa nçm vĉi cây ký chþ cÿng nhā tính mén 
câm vĉi thuøc hóa hõc khác nhau theo loài 
(Mongkolporn et al., 2010; Peres et al., 2004). 
Do xác đðnh các loài Colletotrichum dĆa 
trên các đặc điểm hình thái thāĈng mçt thĈi 
gian nên kỹ thuêt PCR đã đāČc áp dĀng. Nhiều 
cặp m÷i PCR đã đāČc thiết kế để phát hiện các 
loài Colletotrichum gây häi trên ĉt (Imjit et al., 
2012; Srinivasan et al., 2014) cÿng nhā các các 
cây tr÷ng khác (Kamle et al., 2013; Torres-
Calzada et al., 2011; Shi et al., 2008; Yao et al., 
2018). Tuy nhiên, các cặp m÷i này đều đāČc 
thiết kế trên vùng ITS vøn bâo thþ cao nên khó 
có thể phân biệt đāČc các loài, đặc biệt trong các 
phăc hČp loài nhā C. gloeosporioides sensu lato. 
MĀc tiêu cþa nghiên cău này là thiết kế các 
cặp m÷i đặc hiệu cho múi loài Colletotrichum 
phát hiện đāČc trên ĉt täi Việt Nam, chþ yếu täi 
đ÷ng bìng sông H÷ng, và ăng dĀng chýng để 
phát hiện và đánh giá măc đû phù biến cþa các 
loài Colletotrichum gây bệnh thán thā trên ĉt. 
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1. Mẫu nấm 
Các méu nçm Colletotrichum đāČc phân lêp 
tĂ vết bệnh thán thā trên quâ ĉt thu thêp tĂ 
nëm 2015-2017. Bào tĄ trên vết bệnh đāČc hòa 
trong nāĉc cât vô trùng và cçy ria 3 chiều trên 
möi trāĈng WA (Water Agar) chăa 
Streptomycin (100 ppm). Méu nçm thuæn đāČc 
täo ra bìng cách cçy truyền tân nçm đćn (tĂ 1 
bào tĄ) tĂ möi trāĈng WA sang möi trāĈng PDA 
(Potato Dextrose Agar). 
2.2. Thiết kế mồi PCR 
Để thiết kế m÷i đặc hiệu, trình tĆ các méu 
đäi diện cho các loài Colletotrichum (Type 
species) đāČc tâi tĂ Genbank và đāČc cën trình 
tĆ đa chuúi bìng phæn mềm CLUSTAL X 
version 2.1 (Larkin et al., 2007). DĆa trên các 
trình tĆ đāČc cën trình tĆ đa chuúi, các m÷i đāČc 
lĆa chõn tĂ các trình tĆ đặc hiệu cho múi loài. 
Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm 
1027 
Đøi vĉi loài C. truncatum, m÷i đặc hiệu 
đāČc thiết kế trên vùng ITS vì vùng này chăa 
nhiều vð trí khác biệt đặc trāng cho loài này 
(Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017). Vùng ITS cþa 
loài này đã đāČc cën trình tĆ đa chuúi vĉi 7 loài 
Colletotrichum đã đāČc công bø gây bệnh thán 
thā ĉt (Than et al., 2008). 
Đøi vĉi 3 loài C. gloeosporioides sensu 
stricto, C. siamense và C. fructicola cþa phăc 
hČp loài C. gloeosporioides sensu lato, do trình 
tĆ ITS cþa chúng quá bâo thþ, nên trình tĆ 
vùng ApMat (Silva et al., 2012) đã đāČc sĄ dĀng 
để thiết kế m÷i đặc hiệu. Trình tĆ ApMat cþa 28 
loài thuûc phăc hČp loài C. gloeosporioides 
sensu lato (Liu et al., 2015) đã đāČc lĆa chõn để 
cën trình tĆ đa chuúi. 
 Các méu Colletotrichum düng để tøi āu 
hóa các m÷i thiết kế trong phân ăng PCR là các 
méu nçm phân lêp tĂ ĉt và đã xác đðnh danh 
tính (Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017) bao g÷m 
C. truncatum (méu C25 và C30), C. fructicola 
(méu C1 và C14), C. siamense (méu C4 và C33), 
C. gloeosporioides (sensu stricto) (méu C9 và 
C44), C. aeschynomenes (méu C29). 
2.3. Chiết DNA nấm 
DNA tùng sø cþa các méu nçm đāČc chiết 
bìng 2 phāćng pháp. 
Phāćng pháp 1 (CTAB) sĄ dĀng đệm CTAB 
(cetyltrimethylammonium bromide) theo qui 
trình cþa Doyle & Doyle (1987). Khoâng 50 mg 
tân nçm thuæn nuôi cçy trên möi trāĈng PDA 
đāČc nghiền bìng chày nhĆa chuyên dĀng 
(Kontes™ Pellet Pestle) vĉi 0,5 mL đệm CTAB 
trong øng Eppendorf loäi 1,5 mL. DNA đāČc 
chiết mût læn vĉi Chloroform: isoamyl alcohol 
(24:1). Cặn DNA đāČc rĄa hai læn bìng ethanol 
70% và hña trong 30 uL nāĉc cçt 2 læn vô trùng. 
Méu DNA đāČc bâo quân Ċ -20°C. 
Phāćng pháp 2 (NaOH) là phāćng pháp 
chiết nhanh bìng NaOH đāČc câi tiến theo 
phāćng pháp cþa Wang et al. (1993). Tân nçm 
thuæn (khoâng 50 mg) trên möi trāĈng PDA đāČc 
cho vào øng Eppendorf 1,5 mL chăa 50 µL NaOH 
0,5 M và đāČc nghiền bìng đæu tip loäi 100-200 
µL. Dðch nghiền, 5 µL, đāČc chuyển sang øng 
Eppendorf 1,5 mL chăa 50 µL đệm Tris 0,1M, pH 
8. Méu DNA đāČc bâo quân Ċ -20°C. 
2.4. Phản ứng PCR 
Các phân ăng PCR đāČc thĆc hiện bìng kít 
GoTaq Green Master Mix (Promega) hoặc kít 2X 
i-Taq PCR Master Mix (iNtRON Biotechnology). 
Phân ăng PCR đāČc thĆc hiện vĉi điều kiện sau: 
khĊi đæu biến tính Ċ 94C trong 2 phút; tiếp 
theo là 35 chu trình phân ăng g÷m biến tính Ċ 
94C trong 30 giây, gín m÷i Ċ 54-62C trong 30 
giåy (thay đùi theo thí nghiệm và m÷i), tùng hČp 
sČi Ċ 72C trong 1 phút. Phân ăng đāČc kết thúc 
vĉi 5 phút Ċ 72C. 
Sân phèm PCR đāČc điện di trên gel 
agarose 1% đã chuèn bð bìng đệm TAE (Tris 
Acetic acid EDTA) và chăa 0,5 mg/mL ethidium 
bromide. Gel đāČc chäy trên thiết bð điện di 
Mupid-exU Mini System (Helixxtec) vĉi đệm 
TAE Ċ điện thế 100 V trong 30-40 phút. 
3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN 
3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu loài 
Colletotrichum 
DĆa trên so sánh trình tĆ, bøn cặp m÷i đặc 
hiệu cho 4 loài C. truncatum, C. gloeosporioides 
sensu stricto, C. siamense và C. fructicola đã 
đāČc thiết kế. Mût loät các tham sø liên quan 
đến chçt lāČng cþa m÷i cÿng đã đāČc xác đðnh 
dĆa theo các hāĉng dén về thiết kế m÷i PCR 
(Dieffenbach et al., 1993; Rychlik, 1993; 
Judelson, 2006) (Bâng 1). 
Đû dài m÷i: Các m÷i cò kích thāĉc 17-22 
nucleotit. Các kích thāĉc này nìm trong phäm 
vi phù hČp cþa m÷i: đþ dài để đâm bâo tính đặc 
hiệu và đþ ngín để m÷i gín đễ dàng vào khuôn. 
Nhiệt đû tách sČi (Tm): Hai cặp m÷i C.sia-
F1/-R1 và C.glo-F/-R có nhiệt đû tách chuúi tĂ 
51,6-53,8C, nìm trong phäm vi phù hČp 50-
60C. Hai cặp m÷i còn läi, C-tru-F-/R và C.fru-
F1/-R1 có nhiệt đû tách sČi thçp hćn tĂ 41,2-
49C (Bâng 1). 
Nhiệt đû gín m÷i (Ta): Nhiệt đû gín m÷i là 
mût trong các tiêu chí quan trõng, đāČc tính dĆa 
trên nhiệt đû tách sČi. Nhiệt đû gín m÷i quá cao 
làm m÷i khó gín vào khuôn dén tĉi nëng suçt 
PCR thçp. Nhiệt đû gín m÷i quá thçp làm m÷i 
dễ gín khöng đặc hiệu vào khuôn dén tĉi täo các 
sân phèm khöng đặc hiệu. Mût trong các công 
Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase 
1028 
thăc phù biến nhçt nhìm xác đðnh nhiệt đû gín 
m÷i tøi āu cþa cặp m÷i là: Ta = 0,3 × Tm (cþa 
m÷i có nhiệt đû tách sČi thçp hćn) + 0,7 Tm (cþa 
sân phèm) -14,9 (Rychlik et al., 1990). SĄ dĀng 
công thăc này trong phæn mền PrimerSelect 
(DNASTAR Inc.), nhiệt đû gín m÷i tøi āu cþa 4 
cặp m÷i thiết kế đāČc xác đðnh là tĂ 53-55,9C 
(Bâng 1), nìm trong phäm vi phù hČp 50-60C. 
Hàm lāČng GC: Hàm lāČng các gøc 
G và C cþa các m÷i thiết kế tĂ 42,9-57,9% (Bâng 
1) nìm trong phäm vi phù hČp 40-60%. 
Mçu GC đæu 3’: Tçt câ 7 m÷i thiết kế ngoäi 
trĂ m÷i C.sia-R1 đều có Ċ đæu 3’ là G hoặc C 
hoặc GC hoặc CG hoặc GG (Bâng 1). Mçu GC 
cho phép m÷i bám đặc hiệu vào khuôn. 
Đû ùn đðnh đæu 3’: Khoâng 5 nucleotit 
(pentamer) đæu 3’ cæn cò đû ùn đðnh phù hČp để 
gín đặc hiệu vào khuôn. Giá trð G cþa 5 
nucleotit đæu 3’ cþa tçt câ các m÷i thiết kế có 
giá trð tĂ -10,5 kcal/mol đến -7,1 kcal/mol 
(Bâng 1), nìm trong ngāċng giĉi hän tøi đa 
≥-12 kcal/mol. 
Cçu trúc thă cçp: Cçu trúc thă cçp có thể 
hình thành trong cùng mût m÷i hoặc giąa 2 m÷i. 
M÷i chăa cçu trúc thă cçp xçu thāĈng dén tĉi 
nëng suçt PCR bð giâm, thêm chí không có sân 
phèm. Tính ùn đðnh cþa cçu trúc thă cçp đāČc 
đo bìng nëng lāČng tĆ do Gibbs  G (nëng lāČng 
cæn để phá vċ cçu trúc thă cçp). Các loäi cçu 
trúc thă cçp là: 
+ Cçu trúc kẹp tóc (Hairpins). Là cçu trúc 
thă cçp hình thành trong nûi bû m÷i. Tçt câ các 
m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -3 
kcal/mol đến 2 kcal/mol (Bâng 1), nìm trong 
ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-5 kcal/mol. 
+ TĆ m÷i (Self Dimer). Là cçu trúc hình 
thành giąa các phân tĄ cþa cùng loäi m÷i. Tçt 
câ các m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -
5,9 kcal/mol đến 0,3 kcal/mol (Bâng 1), nìm 
trong ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-6 kcal/mol. 
+ TĆ m÷i chéo (Cross Dimer). Là cçu trúc 
hình thành giąa các phân tĄ cþa 2 m÷i khác 
nhau (cặp m÷i trong phân ăng PCR). Tçt câ các 
m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -0,4 
kcal/mol đến -0,2 kcal/mol (Bâng 1), nìm trong 
ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-6 kcal/mol. 
3.2. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 
bốn cặp mồi thiết kế 
Mût trong các yếu tø quan trõng ânh hāĊng 
đến tính đặc hiệu và hiệu suçt cþa m÷i là nhiệt 
đû gín m÷i. Mặc dù nhiệt đû gín m÷i tøi āu cho 
4 cặp m÷i đã đāČc xác đðnh bìng phæn mềm 
(Bâng 1) nhāng chýng cæn phâi đāČc xác đðnh 
bìng thĆc nghiệm. SĄ dĀng DNA đāČc chiết tĂ 
các méu nçm đã đāČc xác đðnh danh tính, phân 
ăng PCR đã đāČc thĆc hiện Ċ 3 ngāċng nhiệt đû 
là 54, 58 và 62C nhìm xác đðnh nhiệt đû gín 
m÷i phù hČp cho 4 cặp m÷i thiết kế. Kết quâ 
kiểm tra PCR (Bâng 2, Hình 1) cho thçy: 
Cặp m÷i C.tru-F và C.tru-R (đặc hiệu loài 
C. truncatum) có khâ nëng phát hiện đặc hiệu 
loài này Ċ phäm vi nhiệt đû rçt rûng. Ở câ 3 
ngāċng nhiệt đû, cặp m÷i này chî täo bëng sân 
phèm mong muøn 321 bp đøi vĉi 2 méu C30 và 
C25 (C. truncatum). 
Tāćng tĆ, cặp m÷i C.glo-F và C.glo-R (đặc 
hiệu loài C. gl ... Bắc Ninh 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C13 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 - 0 0 + C. truncatum 
C14 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 - + 0 0 C. fructicola 
C15 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 - 0 + 0 C. gloeosporioides s.s 
C16 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C17 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C18 Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C19 Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C20 Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình 2015 0 - 0 + C. truncatum 
C22 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C23 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C24 Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C25 Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội 2015 - 0 - + C. truncatum 
C26 Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên 2015 - 0 + 0 C. gloeosporioides s.s 
Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase 
1034 
C27 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C28 Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C29 Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên 2015 - - - - C. aeschynomenes 
C30 Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội 2015 - - 0 + C. truncatum 
C31 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam 2015 + 0 - 0 C. siamense 
C32 Thị trấn Nông trường, Mộc Châu, Sơn La 2015 - + - 0 C. fructicola 
C33 Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La 2015 + 0 0 0 C. siamense 
C34 Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La 2015 - + - 0 C. fructicola 
C35 Long Thành, Long Định, Tiền Giang 2016 - 0 0 + C. truncatum 
C36 Long Thành, Long Định, Tiền Giang 2016 + 0 0 0 C. siamense 
C37 Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam 2016 + 0 - 0 C. siamense 
C38 Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định 2016 + 0 0 0 C. siamense 
C39 Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định 2016 - 0 + 0 C. gloeosporioides s.s 
C40 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang 2016 + 0 0 0 C. siamense 
C41 Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang 2016 + 0 0 0 C. siamense 
C42 Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang 2016 + 0 0 0 C. siamense 
C43 Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang 2016 - + - 0 C. fructicola 
C44 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội 2016 - - + - C. gloeosporioides s.s 
C45 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội 2016 - + - 0 C. fructicola 
C46 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình 2017 - + - 0 C. fructicola 
C47 Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình 2017 + 0 0 0 C. siamense 
C48 Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội 2017 0 0 0 + C. truncatum 
C50 Việt Hồng, Thanh Hà, Hải Dương 2017 + 0 0 0 C. siamense 
C51 Thanh Hải, Thanh Hà, Hải Dương 2017 + - - 0 C. siamense 
C52 Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương 2017 - + - 0 C. fructicola 
C53 Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương 2017 - 0 0 + C. truncatum 
C54 Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương 2017 + 0 0 0 C. siamense 
Chú thích: +: phân ứng PCR dương tính; -: phân ứng PCR âm tính; 0: Không kiểm tra 
Mẫu nấm C29 đã được xác định là loài C. aeschynomenes dựa trên giâi trình tự vùng liên gen ApMat (Nguyễn Duy Hưng và cs., 2017) 
Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm 
1035 
Bảng 5. Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 
thu tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh khác 
Tỉnh 
Số mẫu 
nấm 
Số lượng mẫu nấm theo loài 
C. siamense C. fructicola 
C. gloeosporioides 
 sensu stricto 
C. truncatum C. aeschynomenes 
Bắc Ninh 4 2 1 1 0 0 
Hà Nam 5 5 0 0 0 0 
Hà Nội 7 1 2 1 3 0 
Hải Dương 5 3 1 0 1 0 
Hải Phòng 6 3 1 1 1 0 
Hưng Yên 6 3 1 1 1 0 
Nam Định 2 1 0 1 0 0 
Ninh Bình 2 1 1 0 0 0 
Thái Bình 4 2 1 0 1 0 
Đồng bằng sông Hồng 41 21 8 5 7 0 
Bắc Giang 4 3 1 0 0 0 
Thái Nguyên 2 1 0 0 0 1 
Sơn La 3 1 2 0 0 0 
Tiền Giang 2 1 0 0 1 0 
Tổng 52 27 11 5 8 1 
 A B 
Hình 3. Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 
từ tất cả các tỉnh (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B) 
3.4.2. Phân bố của C. fructicola 
C. fructicola là loài nçm phù biến thă hai, 
đāČc phát hiện Ċ 9/13 tînh thu thêp méu g÷m 7 
tînh đ÷ng bìng sông H÷ng và 2 tînh trung du 
miền núi phía Bíc (Thái Nguyên, Sćn La) (Bâng 
5). Sø lāČng loài này đāČc phát hiện nhiều thă 
hai, chiếm 21,2% tùng sø méu thu thêp täi 13 
tînh và 19,5% tùng sø méu thu thêp täi đ÷ng 
bìng sông H÷ng (Hình 3). 
C. fructicola cÿng là loài đāČc phát hiện đæu 
tiên trên cà phê täi Thái Lan nëm 2009 
(Prihastuti et al., 2009) và cÿng cò phù ký chþ 
và phân bø đða lý rçt rûng (Weir et al., 2012). 
Giøng nhā täi Việt Nam, loài này cÿng phù biến 
trên ĉt täi Ấn Đû (Sharma & Shenoy, 2013) và 
Trung Quøc (Diao et al., 2017). 
3.4.3. Phân bố của C. truncatum 
C. truncatum là loài nçm phù biến thă ba, 
đāČc phát hiện Ċ 6/13 tînh thu thêp méu g÷m 5 
tînh đ÷ng bìng sông H÷ng và Tiền Giang (Bâng 
5). Sø lāČng loài này đāČc phát hiện nhiều thă 
Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase 
1036 
ba, chiếm 15,4% tùng sø méu thu thêp täi 13 
tînh và 17,1% tùng sø méu thu thêp täi đ÷ng 
bìng sông H÷ng (Hình 3). 
C. truncatum, trāĉc kia đāČc gõi là 
C. capsici, là mût trong các loài Colletotrichum 
cò Ď nghïa kinh tế vĉi phù ký chþ và tính gây 
bệnh rçt đa däng (Ranathunge et al., 2012). 
Loài này cÿng là loài phù biến trên ĉt täi Ấn Đû 
(Sharma & Shenoy, 2013), Thái Lan (Ko et al., 
2011; Suwannarat et al., 2017), Úc (Da Silva et 
al., 2017) và là loài phù biến nhçt trên ĉt täi 
Trung Quøc (Diao et al., 2017). 
3.4.4. Phân bố của C. gloeosporioides 
sensu stricto 
C. gloeosporioides sensu stricto là loài phù 
biến thă tā, đāČc phát hiện Ċ 5 tînh đ÷ng bìng 
sông H÷ng là Hà Nûi, Bíc Ninh, Hâi Phòng, 
Hāng Yên và Nam Đðnh (Bâng 5). Sø lāČng loài 
này đāČc phát hiện là 5 méu, chiếm 9,6% tùng sø 
méu thu thêp täi 13 tînh và 12,2% tùng sø méu 
thu thêp täi đ÷ng bìng sông H÷ng (Hình 3). 
C. gloeosporioides sensu stricto ban đæu 
đāČc biết có phù ký chþ khá hẹp, nhiễm chþ yếu 
trên cây có múi. Tuy nhiên gæn đåy, loài này 
cÿng đāČc phát hiện thçy trên xoài, nho, Ficus, 
Pueraria, chè (Weir et al., 2012; Udayanga et 
al., 2013; Liu et al., 2015). Đáng chý Ď, loài này 
đã đāČc xác đðnh phù biến hàng thă hai trên ĉt 
täi Trung Quøc (Diao et al., 2017). 
3.4.5. Phân bố của C. aeschynomenes 
Riêng loài C. aeschynomenes chî phát hiện 
đāČc 1 méu thu täi Thái Nguyên. 
C. aeschynomenes là loài đāČc đðnh danh läi tĂ 
C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes” Loài 
này có phù ký chþ và phân bø rçt hẹp, mĉi chî 
đāČc công bø gây bệnh trên cåy đêu däi 
(Aeschynomene virginica) täi Mỹ (Weir et al., 
2012). Cho tĉi nay vén chāa cò cöng bø thêm về 
sĆ xuçt hiện cþa loài này trên thế giĉi. 
3.4.6. Mức độ đa dạng các loài 
Colletotrichum tại các tỉnh 
Nhìn chung, các tînh đ÷ng bìng sông H÷ng 
có măc đû đa däng loài khá cao (Bâng 5). Trong 
sø các tînh thu thêp méu, Hà Nûi, Hāng Yên và 
Hâi Phòng là 3 tînh có thành phæn loài đa däng 
nhçt khi có sĆ xuçt hiện cþa 4 loài nçm là 
C. gloeosporioides, C. siamense, C. fructicola và 
C. truncatum täi múi tînh. Hai tînh Hâi Dāćng 
và Thái Bình cÿng ghi nhên sĆ xuçt hiện cþa 3 
loài nçm là C. siamense, C. fructicola và C. 
truncatum. Tînh Bíc Ninh xuçt hiện 3 loài nçm 
C. siamense, C. fructicola và C. gloeosporioides. 
Các tînh Ninh Bình, Bíc Giang và Sćn La ghi 
nhên sĆ xuçt hiện chî 2 loài là C. siamense và 
C. fructicola. Duy nhçt, tînh Hà Nam có 100% 
sø méu thu thêp là loài C. siamense. 
5. KẾT LUẬN 
Bøn cặp m÷i đāČc thiết kế mĉi đã phát 
hiện đặc hiệu 4 loài nçm phù biến gây bệnh 
thán thā ĉt là C. truncatum, C. fructicola, 
C. gloeosporioides sensu stricto và C. siamense. 
Phāćng pháp chiết nhanh DNA bìng NaOH 
có hiệu quâ cao để chuèn bð méu DNA tĂ nçm 
Colletotrichum cho phân ăng PCR. 
Bìng phân tích PCR vĉi m÷i đặc hiệu trên 
52 méu nçm Colletotrichum gây bệnh thán thā 
ĉt thu täi 9 tînh đ÷ng bìng sông H÷ng, 3 tînh 
trung du miền núi phía Bíc và 1 tînh đ÷ng bìng 
sông CĄu Long xác đðnh đāČc măc đû phù 
biến cþa các loài Colletotrichum læn lāČt là 
C. siamense (51,9%), C. fructicola (21,2%), 
C. truncatum (15,4%), C. gloeosporioides sensu 
stricto (9,6%). Chî phát hiện thçy 1 méu là loài 
C. aeschynomenes. 
TÀI LIỆU THAM KHÂO 
Cannon P.F., Damm U., Johnston P.R. & Weir B.S. 
(2012). Colletotrichum - current status and future 
directions. Studies in Mycology, 73: 181-213. 
De Silva D.D., Ades P.K., Crous P.W. & Taylor P.W.J. 
(2017). Colletotrichum species associated with 
chili anthracnose in Australia. Plant pathology, 
66(2): 254-267. 
Diao Y.Z., Zhang C., Liu F., Wang W.Z., Liu L., Cai L. 
& Liu X.L. (2017). Colletotrichum species causing 
anthracnose disease of chili in China. Persoonia: 
Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 
38: 20. 
Dieffenbach C.W., Lowe T.M., & Dveksler G.S. 
(1993). General concepts for PCR primer design. 
PCR Methods Appl, 3(3): S30-S37. 
Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm 
1037 
Don L.D., Van T.T., Phuong Vy T.T. & Kieu P.T.M. 
(2007). Colletotrichum spp. Attacking on Chilli 
Pepper Growing in Vietnam. Country Report In: Oh 
D.G., Kim K.T. (Eds.), Abstracts of the First 
International Symposium on Chilli Anthracnose 
National Horticultural Research Institute, Rural 
Development of Administration, Republic of 
Korea, p. 24. 
Doyle J.J. & Doyle J.L. (1987). A rapid DNA isolation 
procedure for small quantities of fresh leaf tissue. 
Phytochemical Bulletin, 19: 11-15. 
Hyde K., Cai L., McKenzie E., Yang Y., Zhang J. & 
Prihastuti H. (2009). Colletotrichum: a catalogue 
of confusion. Fungal Diversity, 39: 1-12. 
Imjit N., Rattanakreetakul C. & Pongpisutta R. (2012). 
Polymerase chain reaction based detection of Chilli 
anthracnose disease. In I International Conference 
on Postharvest Pest and Disease Management in 
Exporting Horticultural Crops-PPDM2012 973, 
pp. 199-206 
Judelson H. (2006). Guidelines For Designing Primers. 
Primer Guidelines, 10(6): 1-5. 
Kamle M., Pandey B.K., Kumar P. & Kumar M. 
(2013). A Species-Specific PCR based Assay for 
rapid detection of mango anthracnose pathogen 
Colletotrichum gloeosporioides Penz and Sacc. J. 
Plant Pathol. Microbiol., 4(184): 10-4172. 
Ko T.W.K., McKenzie E.H.C., Bahkali A.H., To-anun 
C., Chukeatirote E., Promputtha I., Ahmed K., 
Wikee S., Chamyuang S. & Hyde K.D. (2011). 
The need for re-inventory of Thai phytopathogens. 
Chiang Mai Journal of Science, 38: 625-637. 
Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., 
McGettigan P.A., McWilliam H. & Thompson J.D. 
(2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. 
bioinformatics, 23(21): 2947-2948. 
Liu F., Wang M., Damm U., Crous P.W., & Cai L. 
(2016). Species boundaries in plant pathogenic 
fungi: a Colletotrichum case study. BMC 
evolutionary biology, 16(1): 81. 
Liu F., Weir B.S., Damm U., Crous P.W., Wang Y., 
Liu B. & Cai L. (2015). Unravelling 
Colletotrichum species associated with Camellia: 
employing ApMat and GS loci to resolve species 
in the C. gloeosporioides complex. Persoonia: 
Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 
35: 63. 
Mongkolporn O., Montri P., Supakaew T. & Taylor P. 
W. (2010). Differential Reactions on Mature Green 
and Ripe Chili Fruit Infected by Three 
Colletotrichum spp. Plant Disease, 94: 306-310. 
Ngô Bích Hảo (1992). Bệnh thán thư hại ớt, Tạp chí 
Bảo vệ thực vật, 124(4): 15-17. 
Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng 
Lằm, Nguyễn Đức Huy (2017). Xác định nấm 
Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ở đồng bằng 
sông Hồng. Tạp chí khoa học công nghệ nông 
nghiệp Việt Nam, 12(85): 87-93. 
Osmundson T.W., Eyre C.A., Hayden K.M., Dhillon J. 
& Garbelotto M.M. (2013). Back to basics: an 
evaluation of NaOH and alternative rapid DNA 
extraction protocols for DNA barcoding, 
genotyping, and disease diagnostics from fungal 
and oomycete samples. Molecular ecology 
resources, 13(1): 66-74. 
Peres N., Souza N., Peever T. & Timmer L. (2004). 
Benomyl sensitivity of isolates of Colletotrichum 
acutatum and C. gloeosporioides from citrus. Plant 
Disease, 88: 125-130. 
Prihastuti H., Cai L., Chen H., McKenzie E.H.C. & 
Hyde K.D. (2009). Characterization of 
Colletotrichum species associated with coffee 
berries in northern Thailand. Fungal Diversity, 
39(1): 89-109. 
Ranathunge N.P., Mongkolporn O., Ford R. & Taylor 
P.W.J. (2012). Colletotrichum truncatum 
Pathosystem on Capsicum spp: infection, 
colonization and defence mechanisms. 
Australasian Plant Pathology, 41(5): 463-473. 
Rychlik W. (1993). Selection of primers for 
polymerase chain reaction. In PCR Protocols. 
Humana Press, Totowa, NJ., pp. 31-40. 
Rychlik W.J.S.W., Spencer W.J. & Rhoads R.E. 
(1990). Optimization of the annealing temperature 
for DNA amplification in vitro. Nucleic acids 
research, 18(21): 6409-6412. 
Sharma G. & Shenoy B.D. (2013). Colletotrichum 
fructicola and C. siamense are involved in chilli 
anthracnose in India. Archives Of Phytopathology 
And Plant Protection, 47: 1179-1194. 
Shi A., Kantartzi S.K., Mmbaga M.T., Chen P., Mrema F. 
& Nnodu E. (2008). PCR-based markers for detection 
of Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides in 
flowering dogwood (Cornus florida). Australasian 
Plant Pathology, 37(1): 65-68. 
Silva D.N., Talhinhas P., Várzea V., Cai L., Paulo O.S. 
& Batista D. (2012). Application of the 
Apn2/MAT locus to improve the systematics of the 
Colletotrichum gloeosporioides complex: an 
example from coffee (Coffea spp.) 
hosts. Mycologia, 104(2): 396-409. 
Srinivasan M., Kothandaraman S.V., Vaikuntavasan P. 
& Rethinasamy V. (2014). Development of 
conventional and real-time PCR protocols for 
specific and sensitive detection of Colletotrichum 
capsici in chilli (Capsicum annuum L.). 
Phytoparasitica, 42(4): 437-444. 
Suwannarat S., Steinkellner S., Songkumarn P. & 
Sangchote S. (2017). Diversity of Colletotrichum 
spp. isolated from chili pepper fruit exhibiting 
Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase 
1038 
symptoms of anthracnose in Thailand. Mycological 
Progress, 16(7): 677-686. 
Than P.P., Prihastuti H., Phoulivong S., Taylor P.W. & 
Hyde K.D. (2008). Chilli anthracnose disease 
caused by Colletotrichum species. Journal of 
Zhejiang University Science B, 9: 764-778. 
Torres-Calzada C., Tapia-Tussell R., Quijano-Ramayo 
A., Martin-Mex R., Rojas-Herrera R., Higuera-
Ciapara I. & Perez-Brito D. (2011). A species-
specific polymerase chain reaction assay for rapid 
and sensitive detection of Colletotrichum capsici. 
Molecular biotechnology, 49(1): 48-55. 
Udayanga D., Manamgoda D.S., Liu X., Chukeatirote 
E. & Hyde K.D. (2013). What are the common 
anthracnose pathogens of tropical fruits? Fungal 
Diversity, 61(1): 165-179. 
Wang H., Qi M. & Cutler A.J. (1993). A simple 
method of preparing plant samples for PCR. 
Nucleic acids research, 21(17): 4153. 
Weir B.S., Johnston P.R. & Damm U. (2012). The 
Colletotrichum gloeosporioides species complex. 
Studies in Mycology 73: 115-180 
Yao J., Lan C., Huang P. & Yu D. (2018). PCR 
detection of Colletotrichum gloeosporioides in 
Psidium guajava. Australasian Plant Pathology, 
47(1): 95-100.