Tách chiết và xác định conotoxin từ một số loài ốc cối thu thập ở vùng biển Nha trang, Việt Nam

 74 
33(3): 74-80 Tạp chí Sinh học 9-2011 
TáCH CHIếT Và XáC ĐịNH CONOTOXIN Từ MộT Số LOàI ốC CốI 
THU THậP ở VùNG BIểN NHA TRANG, Việt Nam 
Lê Thị Bích Thảo, Đoàn Việt Bình, 
Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi 
Viện Công nghệ sinh học 
Môi tr−ờng biển là một nguồn cung cấp các 
sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học lớn và 
hiếm trong đó nhiều sản phẩm có các đặc tính 
cấu trúc mà các sản phẩm tự nhiên ở trên cạn 
không có. Nghiên cứu về đặc điểm d−ợc học của 
các sản phẩm này cũng đA kéo theo các phát 
hiện về nhiều tác nhân có hoạt tính tiềm tàng có 
thể ứng dụng trong y học lâm sàng [13]. ốc cối 
(Conidae) là một trong những họ động vật thân 
mềm lớn ở biển (đặc biệt vùng biển nhiệt đới) 
với khoảng hơn 700 loài, có nọc độc, bao gồm 
cả các loài ăn thịt động vật, ăn các loài ốc khác, 
ăn sâu và thậm chí cả cá [12, 13]. Chúng không 
chỉ đ−ợc biết đến bởi vẻ đẹp của vỏ (có thể mua 
đ−ợc ở nhiều của hàng bán đồ l−u niệm ở khắp 
nơi trên thế giới) mà chúng còn đ−ợc quan tâm 
bởi các đặc tính sinh học của các chất có trong 
nọc độc của chúng. Việc tách chiết cũng nh− 
làm sáng tỏ cấu trúc của mỗi thành phần từ nọc 
của chúng đA đ−ợc bắt đầu từ đầu những năm 
1980 và chúng không chỉ giúp ích cho con 
ng−ời trong việc khai thác nguồn d−ợc liệu tự 
nhiên mà còn đóng góp rất đáng kể cho ngành 
khoa học thần kinh [1]. 
Conotoxin là loại độc tố có trong nọc độc 
của loài ốc cối. Chúng là hỗn hợp các độc tố 
protein/peptide, enzyme hoặc các phân tử có 
khối l−ợng thấp mà loài ốc dùng để bắt mồi, 
cạnh tranh và tự vệ. Đặc tính của conotoxin là 
chúng có tác dụng khóa chọn lọc điện áp hoặc 
phối tử của các kênh ion trong quá trình dẫn 
truyền tín hiệu của tế bào thần kinh nh− ω-
MVIIA từ Conus magus bao vây các kênh Ca++ 
type N; àO-conotoxin, δ-PVIA ức chế sự bất 
hoạt các kênh Na+, κ-PVIIA t−ơng tác với các 
kênh K+... nên chúng không chỉ có vai trò quan 
trọng trong săn bắt con mồi mà còn là công cụ 
hữu ích trong khoa học thần kinh để xác định 
đ−ợc các thụ thể nhờ ái lực cao và đặc hiệu của 
mình [1, 3, 9]. Trong các họ conotoxin, ω-
conotoxin là nhóm đ−ợc sử dụng nhiều trong 
ngành khoa học thần kinh và những lĩnh vực 
nghiên cứu về chức năng của các dạng kênh 
Ca++ nh− ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus 
đA phát triển thành thuốc cho điều trị các bệnh 
giảm đau [1, 4]. Ngoài tác dụng giảm đau, 
conotoxin còn rất hữu ích cho chỉ định khác 
trong lâm sàng. Thí dụ κ-conotoxin PVIIA đA 
đ−ợc chứng minh là làm giảm mức độ nhồi máu 
cơ tim trong bệnh thiếu máu cục bộ thử nghiệm 
trên mô hình chuột, thỏ và chó in vivo. Trong 
thành phần nọc độc của mỗi loài ốc cối có thể 
chứa đến hơn 200 loại conopeptide do đó −ớc 
tính sẽ có khoảng từ 50.000 đến 100.000 
conopeptide khác nhau có hoạt tính d−ợc học 
đ−ợc tìm thấy từ tất cả các loài Conus này [1]. 
Chính vì vậy mà các conopeptide phải rất khác 
nhau về trình tự amino acid cũng nh− đặc tính 
d−ợc học. Dựa vào trình tự amino acid, 
conotoxin có thể đ−ợc phân nhóm thành hai loại 
lớn là các protein/peptide giàu liên kết disulfide 
và không giàu disulfide. Trong nhóm peptide 
giàu disulfide cũng đ−ợc phân loại thành các 
siêu họ phụ thuộc vào liên kết disulfide. Hầu hết 
các conopeptide có cấu trúc gồm từ 12 đến 30 
amino acid và có từ 2 đến 4 cầu disulfide. Trong 
siêu họ đó, mỗi conotoxin khác nhau sẽ có đích 
tác dụng khác nhau bởi vậy mà ng−ời ta tiếp tục 
phân nhỏ thành các họ phụ thuộc vào đặc tính 
sinh d−ợc. 
Với sự phong phú đa dạng nh− vậy nh−ng 
cho đến nay chỉ một ít trong số đó đA xác định 
đ−ợc đặc tính cụ thể. Vì vậy, nghiên cứu về 
conotoxin ngày càng đ−ợc chú trọng quan tâm 
nhiều hơn. Tại Việt Nam, những nghiên cứu về 
nọc độc của loài ốc cối mới chỉ đ−ợc tiến hành 
trong hai năm qua và đây là những nghiên cứu 
b−ớc đầu về khảo sát và xác định các 
 75
protein/pepdide độc có trong nọc của 8 loài ốc 
cối đ−ợc thu thập tại vùng biển Nha Trang. 
I. PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 
1. Vật liệu 
Tám loài ốc cối đA đ−ợc thu thập tại vùng 
biển Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam và định 
loài tại Viện Hải d−ơng học gồm: Conus 
betulinus, Conus caracteristicus, Conus 
litteratus, Conus marmoreus, Conus quericus, 
Conus striatus, Conus textile và Conus vexillum. 
Các hóa chất dùng trong giải phẫu, tách chiết 
và phân tích protein: acetonitrile (ACN, J.T 
Baker), Tris-HCl, Trifluoro acetic acid (TFA, 
Fluka), formic acid (FA), methanol (Merck), cột 
sắc ký Vydac C18 (4,6 ì 250 mm và 75 àm ì 
150 mm), hóa chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad), 
Trypsin (Sigma-Aldrich). 
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng dòng 
Swiss, tất cả đều là chuột đực, trọng l−ợng 25-
30 g mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng. 
Các thức ăn, n−ớc uống đều dùng theo chỉ dẫn 
của nơi cung cấp. 
2. Ph−ơng pháp 
a. Thu nhận cơ quan chứa nọc độc 
Đập vỡ vỏ ốc bằng búa và rửa sạch phần thịt 
ốc. Giải phẫu để bộc lộ phần bầu độc và ống độc 
theo ph−ơng pháp của Cruz và nnk. (1976) [6]. 
b. Tách chiết các protein từ nọc độc 
Bầu độc và ống độc đ−ợc cắt nhỏ, nghiền 
mịn trong nitơ lỏng và chiết trong đệm 30% 
ACN và 0,1% TFA theo tỉ lệ 3: 1 (đệm: mẫu), 
lắc 16 h ở 4oC. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 
30 phút ở 4oC, thu dịch nổi. Mẫu đ−ợc chiết 2 
lần. Các protein từ phần dịch nổi đ−ợc đông khô 
chân không và cất giữ ở -25oC cho các thí 
nghiệm sau. 
c. Hoạt tính sinh học 
Xác định hoạt tính giảm đau của dịch chiết 
từ nọc độc theo ph−ơng pháp của Zhang đ−ợc 
thử nghiệm trên chuột nhắt trắng [16]. Mỗi con 
chuột đ−ợc tiêm vào xoang bụng 30 àl dịch 
chiết protein hoặc là dung dịch muối sinh lý. 
Sau 15 phút tiêm dịch chiết protein, chuột đ−ợc 
gây đau bằng formalin (3,7%) với liều tiêm 
15 àl vào một chân sau. Bắt đầu đếm số lần 
chuột liếm chân ngay sau khi gây đau và ghi 
theo chu kỳ 5 phút/lần. Giai đoạn s−ng tấy đ−ợc 
xác định từ phút thứ 20 đến 30. Mỗi loại peptide 
đ−ợc thử nghiệm trên 3 con chuột (n = 3). 
d. Tinh sạch protein bằng sắc ký ng−ợc pha 
trên hệ HPLC và phân tích SDS-PAGE 
Nọc độc trong dịch chiết thô đ−ợc phân tách 
trên cột phân tích Vydac C18 (4,6 mm ì 250 
mm). Dịch chiết sau khi thu đ−ợc hòa trong đệm 
30% CAN và 0,1 % TFA. 100 àl dịch chiết thô 
(khoảng 1 mg) đ−ợc đ−a lên cột và đ−ợc thôi ra 
với tốc độ dòng 0,5 ml/phút, gradient tuyến tính 
từ 0-90% ACN/0,1% TFA trong 60 phút, thu 
mỗi phân đoạn protein 1ml và giữ ở 4oC. Kiểm 
tra SDS-PAGE các phân đoạn protein theo 
ph−ơng pháp của Laemmli (1970) [10]. 
e. Nhận diện protein bằng sắc ký kết nối khối 
phổ nanoLC/MS 
Dịch chiết sau đó đ−ợc làm khô chân không 
và phân tích phổ khối trên hệ thống sắc ký lỏng 
kết nối khối phổ nanoLC/MS. LC/MS các mẫu 
đ−ợc tiến hành trên cột Vydac C18 (75 àm ì 
150 mm) với dung môi A (0,1% FA) và dung 
môi B (0,1% FA, 85% ACN), tốc độ dòng 30 
(l/phút. Mẫu đ−ợc thôi ra khỏi cột sắc ký sau đó 
đ−ợc ion hóa bằng nguồn ESI của máy khối phổ 
QSTAR XL xác định phổ khối. Phổ TOF-MS 
thu đ−ợc đ−ợc phân tích bằng phần mềm 
Analyst QS. Sau đó, giá trị phổ khối (Da) đ−ợc 
tìm kiếm theo ph−ơng pháp tiêu chuẩn mass 
fingerprinting trên Expasy của Thuỵ Sĩ 
[ tools/tagident.html] với 
ứng dụng TagIdent để xác định peptide. 
II. KếT QUả Và THảO LUậN 
1. Tách chiết protein/peptide từ nọc độc của 
các loài ốc cối (Conus) 
Tám loài ốc cối sau khi loại bỏ vỏ và phần 
thịt, bầu độc và ống độc đ−ợc tách riêng, nghiền 
nhỏ và chiết với đệm chiết 3 lần. Phần dịch nổi 
đ−ợc cất giữ ở -25oC cho tinh sạch và xác định 
hoạt tính. Các thành phần protein trong cơ quan 
độc (bầu độc và ống độc) của các loài ốc cối sau 
khi tách chiết thô đ−ợc kiểm tra SDS-PAGE. 
Cơ quan độc gồm bầu độc và ống độc của 
loài ốc cối C. vexillium (hình 1A) là nơi chứa nọc 
độc của ốc cối với nhiều loại protein/peptide có 
hoạt tính sinh d−ợc học. Hình 1B là kết quả phân 
tích các protein/peptide có trong dịch chiết nọc 
độc bằng SDS-PAGE của 8 loài ốc cối: 
 76 
C. striatus, C. textile, C. quericus, C. vexillum, 
C. caracteristicus, C. betulinus, C. litteratus và 
C. marmoreus. Thành phần protein trong nọc độc 
ở tất cả các mẫu ốc khá đa dạng, khác nhau cả về 
số l−ợng, thành phần trong đó các protein/peptide 
có khối l−ợng thấp hơn 14 kDa chiếm chủ yếu. 
Kết quả này rất phù hợp bởi các độc tố trong nọc 
độc của ốc là độc tố thần kinh và th−ờng có khối 
l−ợng phân tử nhỏ. Hoạt tính giảm đau của dịch 
chiết từ nọc độc đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp 
của Zhang đ−ợc thử nghiệm trên chuột nhắt trắng 
và kết quả cho thấy nọc từ 8 loài ốc cối đều có 
tác dụng giảm đau ở chuột đ−ợc gây viêm và làm 
đau bằng formalin. Sau khi gây viêm bằng 
formalin, chuột phản ứng với các cảm giác đau 
rát bằng cách liếm gan bàn chân, chỗ trực tiếp 
đâm mũi kim tiêm và bơm formalin vào. Thời 
gian chuột (đ−ợc tiêm nọc của các loài ốc khác 
nhau, tiêm dung dịch muối sinh lý và tiêm thuốc 
gây tê thông dụng) liếm chân đ−ợc ghi lại theo 
chu kỳ 5 phút một lần (hình 2). 
Hình 1. Điện di đồ protein từ nọc độc của ốc cối 
A. Phần bầu độc và ống độc của loài ốc cối C. vexillum; B. SDS-PAGE của các protein/peptidee tách 
chiết từ cơ quan độc của 8 loài ốc cối C. striatus, C. textile, C. quericus, C. vexillum, 
 C. caracteristicus, C. litteratus, C. betulinus và C. marmoreus theo thứ tự từ đ−ờng 1-8 
Hình 2. Hoạt tính giảm đau của nọc ốc cối 
Trong tất cả các loài đA thử nghiệm (ngoại 
trừ nọc của ốc cối C. litteratus), chúng đều có 
tác dụng giảm đau nh− lidocain (một loại thuốc 
gây tê đ−ợc sử dụng rộng rAi trên thị tr−ờng). So 
sánh giữa nọc độc của các loài thì tác dụng giảm 
đau của 3 loài C. betulinus, C. vexillum và 
C. striatus xuất hiện sớm hơn các loài còn lại và 
đ−ợc duy trì t−ơng đối tốt trong thời gian thí 
nghiệm. Sự khác biệt này có thể là do đặc tính 
của các loài bởi trong nọc độc của mỗi loài có 
thể có từ 50-200 loại protein/peptide độc khác 
nhau và hàm l−ợng của mỗi loại cũng khác nhau 
B A 
ống độc 
Bầu độc 
kDa 1 2 M 3 4 5 6 7 8 
25 
18 
14,4 
35 
45 
NaCl 
Lidocain 
C. betulinus 
C. litteratus 
C. quericus 
C. vexillum 
C. caracteristicus 
C. textile 
C. striatus 
C. marmoreus T
hờ
i g
ia
n 
ch
uộ
t 
li
ếm
 c
hâ
n 
(s
) 70 
60 
50 
40 
30 
20 
10 
0 
Thời gian sau khi tiêm formalin (phút) 
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 
 77
[13]. Vì vậy, việc phân tách và xác định thành 
phần các loại protein/peptide có trong nọc của 
mỗi loài ốc cối là rất cần thiết để có thể khai 
thác chúng một cách có hiệu quả. 
2. Tinh sạch và xác định độc tố 
Dịch chiết thô từ cơ quan độc của các loài 
ốc cối đ−ợc tiến hành sắc ký ng−ợc pha trên hệ 
HPLC qua cột Vydac C18. Các phân đoạn 
protein thu đ−ợc đ−ợc đông khô chân không và 
đo khối trên hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối 
phổ nanoLC/MS. Phổ TOF-MS thu đ−ợc đ−ợc 
phân tích bằng phần mềm Analyst QS. Sau đó, 
giá trị phổ khối (Da) đ−ợc tìm kiếm theo ph−ơng 
pháp tiêu chuẩn mass fingerprinting trên Expasy 
(Thuỵ Sĩ) với ứng dụng TagIdent để xác định 
peptide. Đây là ph−ơng pháp xác định peptide 
theo dấu hiệu về khối l−ợng và pI của các 
peptide và đặc biệt vẫn có thể dễ dàng nhận diện 
đ−ợc protein từ chỉ riêng thông tin này. Một đặc 
điểm nữa là chúng th−ờng chỉ nhận diện đ−ợc 
các peptide có khối l−ợng nhỏ d−ới 3500 Da nên 
rất phù hợp với việc xác định các conopeptide 
của ốc cối. 
Kết quả thu đ−ợc khi phân tích hệ 
protein/peptide trong nọc độc của 8 loài ốc cối 
đều đA nhận diện đ−ợc một số conotoxin đA 
đ−ợc công bố bởi các tác giả khác trên thế giới 
[17]. Cụ thể là trong nọc độc của loài C. 
litteratus đA xác định đ−ợc omega-conotoxin 
MVIIA (khối l−ợng 2639 Da), omega-conotoxin 
MVIIC (khối l−ợng 2749 Da) là các conotoxin 
đặc hiệu với các kệnh Ca++ type N, thuộc siêu họ 
O với 3 cầu disulfide và với 26 amino acid. Một 
sản phẩm peptide đ−ợc tổng hợp phiên bản của 
CTX-MVIIA (ziconotide) đA đ−ợc cơ quan quản 
lý d−ợc phẩm và thực phẩm (FDA) của Mỹ chấp 
thuận cho thử nghiệm các loại đau mAn và đau 
cấp. Ngoài ra trong nọc của C. litteratus còn 
phát hiện có delta-conotoxin TxVIA (3034.2 
Da) thuộc siêu họ O, họ delta, còn conotoxin Y-
PIIIE thuộc siêu họ M, họ ϕ và cấu trúc peptide 
gồm 3 liên kết disulfide. 
Trong nọc độc của loài ốc cối C. textile đA 
phát hiện có omega-conotoxin TxVII, delta-
conotoxin TxVIA. Loài C. marmoreus cũng có 
omega-conotoxin SVIA (SVIA), SVIB, delta-
conotoxin SVIE (SVIE) t−ơng tự nh− các 
peptide đA phát hiện đ−ợc ở loài C. striatus và 
delta - CTxVIA giống nh− ở loài C. textile đồng 
thời cũng phát hiện cả độc tố àO-MrVIB (độc tố 
đA đ−ợc tổng hợp hóa học và có hoạt tính giảm 
đau kéo dài hơn Lidocain 7-8 lần). Các loài còn 
lại nh− C. caracteristicus đA nhận diện đ−ợc 
conotoxin Ca 1.1 thuộc siêu họ A với khối l−ợng 
phân tử là 1875 Da và có 2 cầu disulfide. Loài 
C. quercinus có độc tố Qc 1.1c (kích th−ớc 2333 
Da) và Qc 1.2 đều thuộc siêu họ A. ở loài 
C. betulinus đA phát hiện đ−ợc Be 1.1 (2140 
Da), Be 1.2 (1694 Da) cũng thuộc siêu họ A với 
2 liên kết disulfide. Còn ở loài C. vexillum đA 
phát hiện đ−ợc VxVIA (2778 Da) và VxVIB 
(3821 Da) đều thuộc siêu họ O1 với 3 liên kết 
disulfide [10]. Riêng loài C. striatus đA nhận 
diện đ−ợc nhiều nhất và hình ảnh phân tách, 
nhận diện phổ khối của một số peptide đ−ợc thể 
hiện trên hình 3 và bảng 1. 
Bảng 1 
Dữ liệu về các protein/peptide xác định đ−ợc trong nọc của ốc cối C. striatus 
Đỉnh, 
KL/ĐT (m/z) 
Điện 
tích (z) 
KLPT 
đo đ−ợc 
KLPT 
tính toán 
Cầu 
S-S 
Tên protein 
Dạng đ−ợc 
cải biến 
477,78 3 1431,3 1432 2 Alpha-conotoxin S1.1; -NH2 
483,68 3 1448,1 1448 2 Alpha-conotoxin S1.1. -NH2; hyP 
725,09 2 1448,2 1448 2 Alpha-conotoxin S1.1. -NH2; hyP 
728,66 2 1457,3 1457 2 Alpha-conotoxin S1A -NH2 
738,11 2 1475,2 1475 2 Alpha-conotoxin S1A -NH2; hyP 
492,69 3 1475,1 1475 2 Alpha-conotoxin S1A -NH2; hyP 
832,34 3 2495,01 2495 3 Omega-conotoxin SVIA -NH2; hyP 
907,13 3 2718,4 2718 3 Omega-conotoxin SO-3 -NH2 
912,78 3 2735,3 2735 3 Omega-conotoxin SO-3 -NH2; hyP 
1105,6 3 3313,8 3314 3 Delta-conotoxin SVIE 
Ghi chú: KL/ĐT. Khối l−ợng/điện tích; KLPT. Khối l−ợng phân tử. 
 78 
Hình 3. Sắc ký đồ conotoxin từ Conus striatus 
Alpha-conotoxin S1.1 (S1.1); Omega-conotoxin (SVIA); Đơn vị khối (Da); A. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết 
thô từ nọc ốc cối C. striatus qua cột Vydac C18 (4,6 mm ì 250 mm, kích th−ớc hạt 5 àm); B, C. Phổ khối của 
peptide Alpha-conotoxin S1.A và S1.1 thu đ−ợc sau khi phân tích phân đoạn có đỉnh với đơn vi khối 1475 và 
1482 ở trên hình A qua cột Vydac C18 (75 àm ì 150 mm) và đo phổ TOF-MS. 
Hình 3 và bảng 1 là kết quả minh họa xác 
định đ−ợc một số protein/peptide có trong dịch 
chiết từ nọc độc của loài ốc cối C. striatus. Bằng 
ph−ơng pháp sắc ký ng−ợc pha trên hệ HPLC 
lần 1 và lần 2 là sắc ký ng−ợc pha trên hệ 
nanoLC kết hợp đo phổ TOF-MS, đA xác định 
đ−ợc một số conopeptide có khối l−ợng t−ơng tự 
nh− các protein/peptide đA đ−ợc xác định là α-
conotoxin S1.1 (S1.1); àomega-conotoxin SO-3 
(MrSO-3); delta-conotoxin SVIE (SVIE); alpha-
conotoxin S1A (S1A); à-omega-conotoxin 
SVIA (MrSVIA). à-omega thuộc siêu họ O 
cũng đ−ợc biết đến nh− là à-conotoxin của siêu 
họ M làm ức chế các kênh Na+. Các conotoxin 
đ−ợc nhận diện trong nọc của loài ốc C. striatus 
này cũng chính là các protein/peptide đA đ−ợc 
nhiều nhà khoa học trên thế giới công bố [5, 6]. 
Ngoài ra, trong số các trình tự protein/peptide 
thu đ−ợc ở phần ống độc cũng nhận dạng đ−ợc 
rất nhiều trình tự peptide khá giống với trình tự 
các peptide độc từ nọc của một số loài khác nh− 
rắn châu Phi, rắn hổ mang bành, bọ cạp, cấu 
trúc của các kênh Na, K, cấu trúc của protein 
gắn kết với acetylcholine [9]. Đây chính là sự đa 
dạng phức tạp của nọc độc ốc cối không chỉ về 
số l−ợng mà còn cả các thành phần độc tố. 
Mặc dù các số liệu thu đ−ợc còn hạn chế 
nh−ng chúng cũng chứng tỏ thành phần độc tố 
của mỗi loài ốc cối rất đa dạng và phong phú. 
Hầu hết các độc tố phát hiện đ−ợc đều đặc tr−ng 
bởi các liên kết giàu cysteine. Với các protein có 
kích th−ớc nhỏ hơn 2 kDa đặc tr−ng có 4 cystein 
với 2 cầu disulfide (alpha-conotoxin S1.1, alpha-
conotoxin S1A) còn protein lớn hơn 2 kDa có 
Thời gian thôi protein (phút) 
A
21
4 
(m
A
U
) 
100% 
%
C
H
3C
N
A B 
C 
 79
thể có 3 (omega-conotoxin SVIA, delta-
conotoxin SVIE) hay 4 cầu disulfide. Chức năng 
sinh học của các peptide giàu cysteine liên quan 
mật thiết đến các cầu nối disulfide [6]. Hơn nữa, 
cầu này còn đại diện cho bộ khung cấu trúc của 
peptide đó và vì thế chúng t−ơng đối ổn định. 
Mặc dù vậy, để có thể khẳng định chính xác 
trình tự và cấu trúc của các conotoxin này, các 
protein cần đ−ợc phân tích phổ bằng các ph−ơng 
pháp phổ khối MS/MS kết hợp với xác định 
trình tự cDNA, giải trình tự theo ph−ơng pháp 
Edman hoặc kết hợp các ph−ơng pháp này. 
Ngoài các conotoxin đA nhận diện đ−ợc ở 
trên, còn rất nhiều protein khác có kích th−ớc nhỏ 
t−ơng tự nh− kích th−ớc chung của conotoxin 
nh−ng vẫn ch−a nhận diện đ−ợc là do sự phức tạp 
của thành phận nọc độc, sự thiếu hụt các dữ liệu 
về DNA. Một trở ngại nữa đối với việc làm sáng 
tỏ cấu trúc của các độc tố peptide là do chúng có 
kích th−ớc quá nhỏ chỉ với khoảng từ 10 đến 80 
amino acid, liên kết disulfide có thể lên đến 5 và 
một số loại có sự cải biến sau phiên mA cao độ 
[15]. Tuy nhiên, với các kết quả thu đ−ợc bằng 
ph−ơng pháp nghiên cứu này cũng mở ra h−ớng 
nghiên cứu khả quan về sự đa dạng của các độc 
tố thần kinh có nguồn gốc từ tự nhiên cũng nh− 
chủ động tạo ra các nguồn d−ợc liệu bằng công 
nghệ DNA tái tổ hợp. 
III. KếT LUậN 
ĐA thu thập và tách chiết đ−ợc cơ quan độc 
(bầu độc và ống độc) của 8 loài ốc cối của 
Việt Nam: Conus betulinus, Conus 
caracteristicus, Conus litteratus, Conus 
marmoreus, Conus quericus, Conus striatus, 
Conus textile, Conus vexillum và xác định đ−ợc 
cả 8 loài đều có độc tính và có tác dụng giảm 
đau trên chuột. 
ĐA tinh sạch và nhận dạng đ−ợc một số 
conotoxin đặc tr−ng có trong nọc độc của các 
loài ốc cối và các protein/peptide này đều có cấu 
trúc giàu cystein với 2 hoặc 3 liên kết disulfide 
nh− omega-conotoxin MVIIA, delta-Conotoxin 
TxVIA, omega-conotoxin SVIA, SVIB, Alpha-
conotoxin S1.1, (Omega-conotoxin SO-3, Delta-
conotoxin SVIE. 
Lời cảm ơn: Công trình đ−ợc hỗ trợ kinh phí 
của đề tài “Nghiên cứu tạo conotoxin tái tổ hợp 
và thử nghiệm hoạt tính giảm đau” cấp Viện 
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2011-2012. 
TàI LIệU THAM KHảO 
1. Becker S. and Terlau H., 2008: Toxins 
from cone snails: properties, applications 
and biotechnological production. Appl 
Microbiol Biotechnol, 79: 1-9. 
2. Benjamin V. J., 2005: Inferring the mode 
of speciation in Indo-West Pacific Conus 
(Gastropoda: Conidae). J. Biogeogr, 32: 
1429-1439. 
3. Bruce G. L., David W. S., David K., 
John D., Ken R. G., Narmatha S., Zeinab 
K., 2006: Therapeutic applications of 
conotoxins that target the neuronal nicotinic 
acetylcholine receptor. Toxicon, 48(7): 
810-829. 
4. Bulaj G., Olivera B. M., 2008: Folding of 
conotoxins: Formation of the native 
disulfide bridges during chemical synthesis 
and biosynthesis of Conus peptides. 
Antioxid Redox Signal, 10(1): 141-156. 
5. Corpuz G. P. et al., 2005: Definition of the 
M-conotoxin superfamily: Characterization 
of novel peptides from molluscivorous 
Conus venoms. Biochemistry, 44 (22): 
8176-8186. 
6. Daly N. L., Craik D. J., 2009: Structural 
Studies of Conotoxins IUBMB Life, 61: 144-
150. 
7. Daly N. L., Ekberg J. A., Thomas L., 
Adams D. J., Lewis R. J. and Craik D. J., 
2004: Structures of muO-conotoxins from 
Conus marmoreus. I nhibitors of 
tetrodotoxin (TTX)-sensitive and TTX-
resistant sodium channels in mammalian 
sensory neurons. J. Biol. Chem., 279(24): 
25774-25782. 
8. Han Y. H. et al., 2006: Characterization of 
novel M-superfamily conotoxins with new 
disulfide linkage. FEBS J., 273: 4972-4982. 
9. Heinemann S. H. and Leipold E., 2007: 
Conotoxins of the O-
superfamily affecting voltage-gated sodium 
channels. Cell Mol Life Sci, 64: 1329-1340. 
10. Laemmli U. K., 1970: Cleavage of 
Structural Proteins during the Assembly of 
the Head of Bacteriophage T4. Nature, 227: 
680-685. 
 80 
11. Loughnan M. et al., 2006: Novel alpha D-
conopeptides and their precursors identified 
by cDNA cloning define the D-conotoxin 
superfamily. J. Biol. Chem., 281: 24745-
24755. 
12. Milne T. J., 2008: PhD thesis (Australia). 
13. Pi C. et al., 2006: Diversity and evolution of 
conotoxins based on gene expression 
profiling of Conus litteratus. Genomics, 88: 
809-819. 
14. Saravanan R., Sambasivam S., 
Shanmugam A., Kumar D. S., Vanan 
T. T. and Nazeer R. A., 2009: Isolation, 
purification and biochemical 
characterization of conotoxin from Conus 
figulinus Linnaeus (1758). Indian 
J. Biotechnol, 8: 266-271. 
15. Ueberheide B. M., Fenyo D., Alewood P. 
F. and Chail B. T., 2009: Rapid sensitive 
analysis of cysteine rich peptide venom 
components. PNAS, 106(17): 6910-6915. 
16. Zhang M. M. et al., 2007: 
Structure/function characterization of micro-
conotoxin KIIIA, an analgesic, nearly 
irreversible blocker of mammalian neuronal 
sodium channels. J. Biol. Chem., 282(42): 
30699-30706. 
17.  
18.  
EXTRACTION AND IDENTIFICATION OF CONOTOXINS FROM SEVERAL 
CONUS COLLECTED IN NHA TRANG COAST, VIETNAM 
Le Thi Bich Thao, Doan Viet Binh, 
Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi 
SUMMARY 
Venoms of Conus contain a cocktail of peptides that mainly target different voltage- and ligand-gated ion 
channels (commonly known as conopeptides or conotoxins), therefore they are classified as neuropeptides. 
Due to their extraordinary pharmacological properties, conopeptides gained increasing interest in recent years. 
We extracted and identified some conotoxins from eight Cone snails collected in Nha Trang coast (Vietnam): 
C. betulinus, C. caracteristicus, C. litteratus, C. Marmoreus, C. quericus, C. striatus, C. Textile and C. 
vexillum. Venoms from eight conus species were dissected and extracted. The extracted crude venoms were 
tested for analgesic activity on mice. On the hand, these crude venoms were initially separated on a Vydac 
C18 columm. The fractions were then separated on nanoLC chromatography system combined with tandem 
mass spectrometry to identify conotoxins. The results showed that venoms of eight Cone snails were found to 
produce analgesic activity in the formalin test and among them. The extracted crude venoms were tested 
analgesic activity on mice. The venoms of C. betulinus, C. vexillum, C. caracteristicus, C. textile and C. 
quericus gained higher analgesic activity than that of remained species. In each species, several toxic 
proteins/peptides were identified and the sequences of that are similar to toxic components of Conus species. 
The identified conotoxins were disulfide- rich conopeptides containing 4 or 6 cysteines based on published 
data. 
Keywords: Conotoxin, Conus, venoms. 
Ngày nhận bài: 27-4-2011