Tách dòng gen ltp (lipid transfer protein) của cây đậu xanh

52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 
1 
TÁCH DÒNG GEN LTP (Lipid transfer protein) CỦA CÂY ĐẬU XANH 
(Vigna radiata L. Wilczek) 
Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên), 
Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trần Thúy Liên, Nguyễn Thị Mai Lan 
(Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên) 
I. Mở đầu 
Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilcrek) là cây 
trồng cạn có vai trò quan trọng bởi hạt đậu xanh là 
thực phẩm giàu protein và trồng đậu xanh có tác 
dụng cải tạo đất. Với các điều kiện khí hậu khắc 
nghiệt như hạn hán, nóng nắng kéo dài làm cho 
cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng suy 
giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và có thể 
cây bị chết, dẫn đến giảm năng suất, chất lượng 
hạt đậu xanh. Chính vì vậy, vấn đề tìm kiếm các 
chỉ thị phân tử của tính chống hạn và nghiên cứu 
ứng dụng công nghệ gen nhằm tạo cây chuyển gen 
chịu hạn là rất cần thiết. 
Các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn 
có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm 
lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit 
hữu cơ,... giảm phức hợp CO2, protein và các axit 
nucleic [1], [2]. Sự tổng hợp và tích luỹ các chất 
trên diễn ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước, với 
hai chức năng là (i) sự điều chỉnh áp suất thẩm 
thấu nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tế 
bào và (ii) ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ của 
các chất đó. Chúng có thể thay thế vị trí nước nơi 
xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipid 
hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy 
màng và các phức protein trong màng. Như vậy khả 
năng giữ nước của tế bào liên quan đến sự tăng áp 
suất thẩm thấu và độ bền vững của màng tế bào. 
LTP (Lipid transfer proteins) thuộc họ gen 
pathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp protein 
thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới 
màng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp 
biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng 
lại những thay đổi của môi trường [5], [10]. 
Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro 
các hợp tử cellulose xyloglucan của thành tế bào 
thực vật có thể được gây ra do các LTP; Mặc dù 
chưa có bằng chứng in vivo song khám phá này 
chắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chế 
mở rộng thành tế bào thực vật [7]. 
Những phân tử protein do gen LTP tổng hợp 
thường có nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng 
điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa, và 
với sự có mặt của 8 phân tử cysteine làm nhiệm vụ 
tạo ra 4 cầu nối disulfide [11]. Khi gặp những điều 
kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như 
hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường 
truyền tín hiệu  sẽ điều khiển gen LTP hoạt 
động và tăng tổng hợp nên các sản phẩm protein 
tăng cường vận chuyển phospholipid tới màng, 
tăng khả năng giữ nước của màng tế bào nhằm 
giúp cho cây tăng khả năng chống stress hạn. 
Trong những năm gần đây, đã có một số công 
trình nghiên cứu về gen LTP ở các đối tượng thực 
vật, như Solanales lycopersicum L. [11], Zea mays 
L. [8], Papper [4], Triticum L. [6], Daucus carota 
L. [9], và Oryza satyva L. [12]. Trong bài báo này, 
chúng tôi công bố kết quả tách dòng gen LTP 
khuếch đại từ ADN hệ gen của một số giống đậu 
xanh có khả năng chịu hạn khác nhau. 
II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 
Vật liệu nghiên cứu 
Bảy giống đậu xanh do Trung tâm Nghiên cứu 
và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và 
Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt 
Nam cung cấp được sử dụng làm vật liệu nghiên 
cứu (Bảng 1). 
Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái của 7 giống đậu 
xanh nghiên cứu 
S 
TT 
Tên 
giống 
Màu 
thân 
mầm 
Màu 
vỏ hạt 
Khối lượng 
1000 hạt (g) 
1 DX208 Xanh Xanh bóng 75,30±0,015 
2 Đỗ Quế Xanh Xanh mốc 44,20±0,025 
3 DX14 Xanh Xanh mốc 65,86±0,040 
4 DX04 Xanh Xanh bóng 66,31±0,015 
5 V123 Xanh Xanh bóng 63,95±0,020 
6 T135 Xanh Xanh mốc 50,54±0,032 
7 PAEC3 Tím Vàng bóng 60,75±0,010 
52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 
95 
Cặp mồi nhân gen LTP được chúng tôi thiết kế 
và đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự 
trình bày ở bảng 2. 
Bảng 2. Trình từ cặp mồi nhân gen LTP 
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) 
LTPF ATGGCTAGCCTGAAGGTTGC 
LTPR TTACTTGATGTTAGCGCAGTT 
Phương pháp nghiên cứu 
- ADN tổng số được tách chiết theo phương 
pháp Gawel và Jarnet (1991) [3]. 
- Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm 
PCR nhân gen LTP được kiểm tra bằng điện di 
trên gel agarose 1% trong TAE 1X. 
- Sản phẩm PCR của gen LTP được kiểm tra 
bằng điện di trên gel agarose 1%. Gen được làm 
sạch bằng bộ Kit của hãng Bioneer và gắn trực tiếp 
vào vector pBT, sau đó được biến nạp vào tế bào 
khả biến E. coli chủng DH5 . Tách plasmid mang 
gen LTP phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ Kit 
AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. 
III. Kết quả và thảo luận 
1. Kết quả nhân gen LTP từ các giống đậu xanh 
Các giống đậu xanh trên đã được đánh giá khả 
năng chịu hạn kết quả cho thấy chỉ số chịu hạn 
tương đối giảm dần ở các giống như sau: DX208 > 
DX04 > T135> V123 > DX14 > Đỗ Quế > PaEC3. 
Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên, 
chúng tôi tiếp tục nhân gen để kiểm tra sự có mặt 
của gen LTP ở các giống đậu xanh này và đọc 
trình tự cũng như so sánh để tìm chỉ thị phân tử 
gen LTP cho đăc tính chịu hạn của cây đậu xanh. 
Do chưa có trình tự nucleotide của gen LTP 
phân lập từ DNA tổng số nên chúng tôi dựa vào 
cơ sở dữ liệu khai thác từ ngân hàng gen quốc tế 
(NCBI) với mã số AY300807 để thiết kế cặp 
mồi đặc hiệu cho việc nhân và phát hiện sự có 
mặt của gen LTP ở các giống đậu xanh phục vụ 
cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống đậu 
xanh có khả năng chống chịu với điều kiện bất 
lợi của môi trường. 
Để nhân được đoạn gen này, chúng tôi đã tiến 
hành tách chiết DNA tổng số. Tối ưu nhiệt độ và 
thành phần của phản ứng PCR (Bảng 3). Nhiệt độ 
gắn mồi thích hợp nhất cho nhân gen LTP là 560C. 
Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen LTP 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 H2O khử ion 12,5 
2 Buffer PCR (10X) 2,5 
3 Mg+2 (25 mM) 2,5 
4 dNTP (25 mM) 2,0 
5 Mồi xuôi (10 pMol) 2,0 
6 Mồi ngược (10 pMol) 2,0 
7 Taq polymerase (5 U/l) 0,5 
8 DNA mẫu (50 ng) 1,0 
 Tổng 25,0 
Đoạn gen LTP của 7 giống đậu xanh được nhân 
từ DNA tổng số bằng phương pháp PCR. Sản phẩm 
PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 
(Hình 1). Hình 1 cho thấy, mỗi giống nhận được 
một đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 350 
bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện 
cho các nghiên cứu tiếp theo. 
Hình 1. Hình ảnh điện di kết qủa nhân gen LTP của 7 
giống đậu xanh Ký hiệu: M. Marker 1kb 
1.DX208; 2. Đỗ Quế; 3. DX14; 4. DX04; 5. V123; 6. 
T135; 7. PAEC3 
Từ kết quả nhân gen ở trên chúng tôi lựa chọn 
2 giống đậu xanh có chỉ số chịu hạn cao (DX208 
và DX04) và hai giống đậu xanh có chỉ số chịu 
hạn thấp nhất (Đỗ Quế và PaEC3) để tiếp tục tách 
dòng gen. 
 M 1 2 3 4 5 6 7 
250 bp 
350bp 
52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 
96 
2. Kết quả tách dòng gen LTP 
Quá trình tách dòng được thực hiện theo các 
bước: (1) Gắn sản phẩm PCR sau khi được tinh 
sạch vào vector tách dòng pBT (Hình 2); (2) Biến 
nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α. 
Sau khi biến nạp chủng E. coli DH5α được cấy 
 trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm 
men, NaCl và agar) có kháng sinh ampixilin 
(100mg/ml), IPTG (0,1 mM) và X - gal 
(40mg/ml), ủ hộp lồng petri ở 370C trong 16 h. Kết 
quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu 
trắng (Hình 3). Chọn khuẩn lạc có màu trắng 
chuyển sang nuôi ở môi trường có LB lỏng (có bổ 
sung ampixilin 100mg/ml) qua đêm. Lấy dịch nuôi 
chứa vi khuẩn đem kiểm tra sản phảm chọn dòng 
bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi pUC18, để xác 
định khuẩn lạc chứa mang gen mong muốn. 
Hình 2. Cấu trúc của vector tách dòng pBT 
52(4): 3 - 12 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 
4 
Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc mang gen LTP 
Sản phẩm colony - PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm 
gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 4). 
Mồi pUC được thiết kế chung cho các vector tách dòng, nên khi kiểm tra sản phẩm PCR vừa 
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR 
M. Marker 1 Kb 
dòng hóa thì kích thước của đoạn gen sẽ cao hơn 124 bp. 
Điều này có nghĩa là kích thước của đoạn gen vừa nhân khoảng 474 bp. Kết quả điện di ở hình 4 
cho thấy, sản phẩm colony - PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dương tính với cả 4 
băng và đều đúng kích thước dự đoán. Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiếp tục ti ến 
hành tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 % trong 
đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 
5). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lượng và số lượng phục vụ 
cho việc xác định trình tự nucleotit. 
Hình 5. Kết quả điện di tách plasmid mang gen LTP 
IV. Kết luận 
52(4): 3 - 12 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 
5 
- Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhân gen LTP, tối ưu hóa thành phần của phản ứng PCR và nhiệt độ 
gắn mồi nhân đoạn gen LTP. 
- Đã khuếch đại thành công gen LTP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên cơ sở 
dữ liệu khai thác tại Ngân hàng gen Quốc tế. Sản phẩm PCR được dòng hoá nhờ vector pBT. 
 - Chọn được dòng vi khuẩn E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp và tách được plasmid mang đoạn gen 
LTP phục vụ việc xác định trình tự nucleotit. 
Tài liệu tham khảo 
[1]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại 
học Quốc gia, Hà Nội. 
[2]. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương 
quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr. 85-95 
[3]. Gawel T.J, Jarret R.L. (1991), Geneomic DNA isolation, 
[4]. Jung H.W., Hwang B.K. (2000), Isolation partial sequencing, and expression of pathogensis-related cDNA 
genes from pepper leaves infected by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Molecular Plant-Microbe 
Interactions 13, pp. 136-214. 
[5].Kader J.C. (1996), Lipid trans protein in plants, Annual Review of Plant Molercular Biology 47, pp. 627-654. 
[6]. Monia A., Garcia O.F. (1993), Developmetal and pathogen induced expression of three barley genes encoding 
lipid transfer protein, The Plant Journal, 4: 983-991. 
[7]. Nieuwland J., Feron R., Huisman BA., Fasolino A., Hilbers CW., Derksen J., Mariani C. (2005), Lipid transfer 
proteins enhance cell wall extension in tobacco. Plant Cell. ;17(7):2009-2019. 
[8] Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Aroundel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac 
E., Delseny M. (1991), Spatial and temporal expression of a maize lipid transfer protein gene. The Plant Cell, 3, pp. 
923-933. 
[9]. Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A, De Vries S.C. (1991), Cell-speciffic expession of the 
carrot EP2 lipid transfer protein gene, The Plant Cell , 3: 907-921. 
[10]. Tassin S., Broekaert W.F., Marion D., Acland D.P., Ptak M., Vovelle F., Sonado P. (1998), Solution structure 
of Ace AMP1, a potent anti-microbial protein extraction from onion seeds. Structural analogies with plant 
nonspeciffic lipid transfer protein, Biochemistry, 37, pp. 3623-3637. 
[11]. Terres Schumann S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), A probable lipid transfer protein is induced by NaCl 
in stems of tomato plants, Plant Molecular Biology, 105, pp.749-757. 
[12]. Vignols F., Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M. 
(1994), Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein, Gene, 142, pp. 420-426.