Tóm tắt Luận án Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng kaviran

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NANG
CỨNG KAVIRAN
Chuyên ngành:
CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
Mã số: 62 72 04 02
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - NĂM 2017
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Nguyễn Thanh Hải
2. PGS. TS. Nguyễn Tùng Linh
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp
Trường họp tại Học viện Quân y
Vào hồi: giờ ngày tháng năm 20
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia;
- Thư viện Học viện Quân y
1ĐẶT VẤN ĐỀ
Suy giảm miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình
bệnh lý như: Suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng
các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do
tia xạ hoặc hoá chất điều trị ung thư, trong nhiễm HIV/AIDS. Các
trường hợp bệnh lý trên, ngoài điều trị tác nhân gây bệnh thì điều trị
nhằm nâng đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết. Tuy nhiên,
do chi phí điều trị cao, nhiều bệnh nhân không có cơ hội tiếp cận, thì
việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành
dễ chấp nhận là vấn đề cấp bách và có ý nghĩa thực tiễn cao.
Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) có tác dụng: tăng cường miễn
dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống
viêm...Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) có tác dụng: tăng lực, tăng
quá trình nhận thức, chống oxy hóa, bảo vệ gan... Tuy nhiên, hiện
nay chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu
này. Do vậy, để góp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc
mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK (Viên Kaviran) nhằm tăng
cường miễn dịch và chống oxy hóa theo hướng hiện đại, an toàn,
hiệu quả và ứng dụng được vào sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu bào
chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran”
được tiến hành nhằm các mục tiêu sau:
1. Bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả
nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối.
2. Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định
chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối.
3. Đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn dịch,
chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên thực
nghiệm.
2* Đóng góp mới của luận án
- Xây dựng được qui trình bào chế bột cao khô định chuẩn của
Cúc hoa vàng, quả Nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối, bao gồm: Nâng
cấp tiêu chuẩn cúc hoa vàng và quả nhàu dựa trên tiêu chuẩn của
DĐVN IV. Xây dựng được qui trình chiết xuất các hoạt chất chính
bằng phương pháp chiết siêu âm, qui trình bào chế bột cao khô bán
thành phẩm bằng phương pháp phun sấy. Xây dựng và thẩm định
được tiêu chuẩn cơ sở của bột cao khô bán thành phẩm.
- Xây dựng được công thức bào chế viên nang cứng Kaviran từ
bột cao khô định chuẩn quả nhàu, CHV và sâm NLSK trên cơ sở
phối hợp giữa thành phần có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống
oxy hóa trong cùng công thức nhằm tăng cường tác dụng cho chế
phẩm. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá độ ổn định
của chế phẩm.
- Đánh giá được tính an toàn và một số tác dụng sinh học của
chế phẩm: Chưa xác định được giá trị LD50 trên chuột và không thấy
biểu hiện độc tính bán trường diễn trên thỏ; chế phẩm có tác dụng
tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan khi thử trên
động vật thực nghiệm.
Luận án có tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn
cao. Kết quả của luận án có đóng góp mới cho nguyên ngành công
nghệ dược phẩm và bào chế thuốc, là tài liệu tham khảo hữu ích
trong lĩnh vực nghiên cứu bào chế các thuốc nguồn gốc dược liệu
theo hướng hiện đại.
* Nội dung và cấu trúc của luận án
Luận án gồm 149 trang: Đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 33 trang,
đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết quả nghiên cứu
56 trang, bàn luận 34 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, danh
mục bài báo 1 trang, có 158 tài liệu tham khảo (25 tài liệu tiếng Việt,
133 tài liệu tiếng Anh).
3Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan về các dược liệu dùng trong nghiên cứu, gồm: quả
nhàu, CHV và sâm NLSK. Mỗi dược liệu đề cập đến: Đặc điểm thực
vật và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học. Các thông tin
về kỹ thuật chiết xuất dược liệu: Khái niệm và một số thuật ngữ, một
số phương pháp chiết xuất hiện đại, mỗi phương pháp chiết xuất đề
cập đến nguyên lý và cơ chế, thiết bị, một số ứng dụng và nghiên cứu
điển hình. Các thông tin về kỹ thuật phun sấy: Khái niệm, thiết bị và
các giai đoạn phun sấy, các thông số quan trọng của qui trình, ưu
nhược điểm; ý nghĩa của phun sấy dịch chiết dược liệu, một số khó
khăn gặp phải, một số nghiên cứu phun sấy dịch chiết dược liệu.
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
- Quả Nhàu, CHV đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. Sâm NLSK đạt
TCCS; Chất chuẩn: Apigenin, luteolin, ginsenosid (Rb1, Rg1) của
hãng Sigma Aldrich. Scopoletin của hãng Shanghai Tauto Biotech;
Các tá dược và hóa chất phân tích đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
- Các thiết bị sử dụng đều đạt yêu cầu cho nghiên cứu chiết xuất, bào
chế, kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng dược lý.
- Thỏ chủng Orytolgus cuniculus, khỏe mạnh, cân nặng 2,0 ±
0,2kg. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khỏe mạnh, cân nặng 20,0 ±
2,0g. Động vật được nuôi dưỡng ở điều kiện phóng thí nghiệm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu bào chế bột cao khô tiêu chuẩn cúc hoa vàng,
quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối
2.2.1.1. Phương pháp định lượng hoạt chất trong nguyên liệu, các
phân đoạn dịch chiết và bột cao khô
Định lượng flavonoid toàn phần bằng UV-Vis; Định lượng
apigenin, luteolin trong CHV và scopoletin trong quả nhàu bằng
4HPLC: Xây dựng và thẩm định phương pháp; Định lượng ginsenosid
(Rg1, Rb1) trong sâm NLSK bằng HPLC: Theo phương pháp của Vũ
Bình Dương và cộng sự (2008).
2.2.1.2. Nghiên cứu điều chế dịch chiết cúc hoa vàng, quả nhàu và
sâm Ngọc linh sinh khối
- Điều chế cao CHV, cao quả nhàu: Khảo sát các thông số qui
trình chiết siêu âm: Loại dung môi, tỷ lệ dung môi/ dược liệu, số lần
chiết, thời gian và nhiệt độ chiết. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng
flavonoid chiết được trong CHV và quả nhàu; hàm lượng ginsenosid
(Rg1, Rb1) chiết được trong sâm NLSK; Nhóm hoạt chất bị kết tủa
trong EtOH (Noni-ppt) chiết từ quả nhàu. Dịch chiết được cô đặc và
loại tạp để thu được cao CHV (2:1) và cao quả nhàu (1:1).
- Điều chế cao sâm NLSK: Chiết siêu âm với EtOH 70%, nhiệt
độ chiết 600C, chiết hai lần với tỷ lệ DM/DL/lần là 10/1, thời gian
chiết là 60 phút/lần. Sau khi chiết xuất, cô thu hồi dung môi đến tỷ lệ
cao 1:1, loại bớt tạp rồi cô thu hồi dung môi để thu được cao 6:1.
2.2.1.3. Nghiên cứu bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và
sâm Ngọc linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy
Thông số khảo sát: Loại tá dược (Maltodextrin và aerosil); nhiệt
độ phun sấy và tốc độ cấp dịch; tỷ lệ tá dược/ chất rắn (TD/CR) trong
cao; tỷ lệ chất rắn trong dịch phun (CR/DP); Thông số đánh giá:
Theo chỉ tiêu chất lượng của bột cao khô (Mục 2.2.1.4).
2.2.1.4. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng bột cao khô
phun sấy
Hình thức cảm quan: Quan sát bằng cảm quan và chụp hiển vi
điện tử quyét; Khối lượng riêng và chỉ số nén CI: Theo USP 30; Mất
khối lượng do làm khô: PL 9.6 - DĐVN IV; Tính hút ẩm: Thử ở
250C, độ ẩm tương đối 75,29%, thời gian: 7 ngày; Hàm lượng hoạt
chất: Định lượng flavonoid toàn phần bằng UV-Vis, scopolein và
5ginsenosid (Rg1, Rb1) bằng HPLC; Hiệu suất thu hồi hoạt chất và
phun sấy: Là tỷ lệ % thực tế thu được so với lý thuyết.
2.2.1.5. Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa bột cao khô bán thành phẩm
Tính chất: Thử bằng cảm quan; Mất khối lượng do làm khô, độ
mịn, độ đồng nhất, tro toàn phần: Theo DĐVN IV; Định tính: bằng
sắc ký lớp mỏng và HPLC; Định lượng bằng HPLC: apigenin,
luteolin trong bột cao khô CHV, scopoletin trong bột cao khô quả
nhàu, ginsenosid (Rg1, Rb1) trong bột cao khô sâm NLSK.
2.2.2. Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa và đánh giá độ ổn định
của viên nang cứng Kaviran
- Xây dựng công thức bào chế: Xác định tỷ lệ phối hợp các bột
cao khô dựa trên đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro và tăng
cường miễn dịch in vivo; Lựa chọn các tá dược: Aerosil, magnesi
stearat, natri laurylsulphat, manitol. Khảo sát tỷ lệ Avicel và natri
croscarmellose. Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng riêng, chỉ số nén CI
của bột đóng nang và độ rã của viên nang.
- Kiểm nghiệm về: Tính chất: Kiểm tra bằng cảm quan; Độ rã,
độ đồng đều khối lượng, hàm ẩm: Theo DĐVN IV; Định tính: Bằng
sắc ký lớp mỏng và HPLC; Định lượng: Apigenin, luteolin và
ginsenosid (Rg1, Rg1) bằng HPLC. Từ kết quả kiểm nghiệm xây
dựng tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) cho chế phẩm.
- Đánh giá độ ổn định: Theo hướng dẫn của ASIAN và WHO.
2.2.3. Nghiên cứu tính độc tính và tác dụng sinh học của viên nang
cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm
2.2.3.1. Đánh giá tính độc tính của viên nang cứng Kaviran
- Xác định độc tính cấp trên chuột nhắt: Tiến hành theo hướng
dẫn của Bộ Y tế, OECD và WHO.
- Xác định độc tính bán trường diễn: Tiến hành theo quy định
của WHO và Bộ Y tế: Thỏ gồm 3 lô, 12con/ lô: Lô chứng: Uống
NaCl 0,9%, liều 2,5ml/kg; (2) Lô Kaviran liều 240 và 1200mg/kg;
6Các chỉ tiêu đánh giá: Sinh lý - dược lý, huyết học, sinh hóa, mô
bệnh học. Thời gian thử 6 tuần.
2.2.3.2. Đánh giá tác dụng sinh học của viên Kaviran
a. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan bằng mô hình gây độc do
paracetamol liều cao:
Chuột nhắt trắng gồm 6 lô, mỗi lô ít nhất 10 con: Lô 1 (Đối
chứng): Uống nước cất 0,2 ml/10g; Lô 2 (Mô hình): Uống nước cất
0,2ml/10g + paracetamol; Lô 3 (Chứng dương): Uống silymarin
140mg/kg + paracetamol; Lô 4: Uống Kaviran liều 0,72g/kg (D1) +
paracetamol; Lô 5: Uống Kaviran liều 2,16g/kg (D2) + paracetamol;
Lô 6: Uống Kaviran liều 4,32 g/kg (D3) + paracetamol.
Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc thử 3 giờ, cho chuột từ lô 2
đến lô 6 uống paracetamol liều 400mg/kg. Sau 48 giờ, lấy máu để đo
hoạt độ enzym AST, ALT, xác định khối lượng gan và hàm lượng
MDA. Quan sát đại thể và vi thể gan.
b. Đánh giá tác dụng của Kaviran trên chuột thực nghiệm bị
suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ:
Chuột nhắt trắng gồm 5 lô, mỗi lô ít nhất 10 con: Lô 1: Không
bị tác động gì; Lô 2: Chiếu xạ, uống NaCl 0,9%; Lô 3: Chiếu xạ,
uống levamisol liều 50mg/kg; Lô 4: Chiếu xạ, uống Kaviran liều
0,72g/kg; Lô 5: Chiếu xạ, uống Kaviran liều 2,16g/kg. Chuột được
chiếu xạ toàn thân liều 1Gy/ngày trong 6 ngày. Cho chuột được uống
thuốc trong 6 ngày chiếu xạ và 7 ngày sau chiếu xạ. Ngày thứ 14,
tiến hành các xét nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng tuyến ức
và lách tương đối; Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu; Vi thể
lách, tuyến ức, hạch và đầu xương đùi.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Sự khác biệt giá trị trung bình giữa các mẫu sử dụng Duncan’s
Multiple Range Test bằng phần mềm SAS (α = 0,05), biểu diễn theo
7± SD. Giá trị trong cùng cột có cùng một trong các ký tự (biểu thị
theo a, b, c, d...) là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả bào chế bột cao khô tiêu chuẩn
3.1.1. Kết quả định tính, định lượng dược liệu
- Định tính: Trên sắc ký đồ mẫu thử có các píc có thời gian lưu
trùng với thời gian lưu dung dịch chuẩn của luteolin và apigenin
(24,6 và 34,5 phút) trong CHV, scopoletin (6,9 phút) trong quả nhàu,
ginsenosid (Rg1 12,8 phút và Rb1 34,5 phút) trong sâm NLSK.
- Định lượng: CHV chứa 1,3986mg/g luteolin và 0,2274mg/g
apigenin; Quả nhàu chứa 110,85µg/g scopoletin; sâm NLSK chứa
7,57mg/g ginsenosid (Rg1, Rb1).
3.1.2. Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng
3.1.2.1. Kết quả điều chế dịch chiết cúc hoa vàng
- Ảnh hưởng của dung môi: Chiết siêu âm CHV hai lần ở 600C,
tỷ lệ DM/DL là 10/1/lần, 60 phút/lần, nhưng với dung môi là: Nước
và EtOH 40, 50, 60, 70 và 80%. Kết quả: EtOH 50% có hiệu suất
chiết cao nhất (96,84%), sau đó giảm nhẹ khi chiết với EtOH 60 -
80%, nhưng cao hơn rõ rệt khi chiết với EtOH 40% và nước. Do vậy,
lựa chọn EtOH 50% để khảo sát tiếp.
- Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL và số lần chiết: Chiết siêu âm
CHV với EtOH 50% ở 600C, 60 phút/lần. Chiết 1 lần với tỷ lệ
DM/DL từ 10/1 - 50/1. Chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL lần 1 là 10/1, lần 2
lần lượt là 10/1, 7,5/1 và 5/1. Kết quả: Chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL
10/1/lần có hiệu suất chiết flavonoid (96,84%) tương đương chiết 1
lần với tỷ lệ DM/DL 30/1 - 50/1 và cao hơn 20/1. Do vậy, lựa chọn
chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần để khảo sát tiếp.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chiết siêu âm CHV hai lần với EtOH
50%, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần, 60 phút/lần, nhiệt độ 40-800C. Kết quả:
Lượng flavonoid chiết được ở 60-800C là tương đương, nhưng cao
8hơn rõ rệt ở 40-500C. Do vậy, nhiệt độ chiết thích hợp là 600C, vì khi
tăng nhiệt độ không làm tăng hiệu suất, nhưng tốn năng lượng.
- Ảnh hưởng của thời gian chiết: Chiết CHV hai lần với EtOH
50%, ở 600C, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần, nhưng thời gian chiết từ 30 - 90
phút/ lần. Kết quả: Thời gian thích hợp để chiết flavonoid từ CHV là
60 phút/lần x 2 lần, khi tăng hoặc giảm thời gian chiết đều làm giảm
lượng flavonoid chiết được.
* Tóm tắt thông số và kết quả điều chế dịch chiết CHV
Bảng 3.9. Thông số qui trình điều chế dịch chiết CHV
STT Tên phương pháp/ thông số Thiết bị/ thông số
1 Chiết siêu âm Thiết bị SM30-CEP, công suất 400W
2 Cúc hoa vàng Kích thước nhỏ hơn 1mm
3 Dung môi chiết Ethanol 50%
4 Nhiệt độ chiết 600C
5 Số lần chiết 2 lần
6 Tỷ lệ DM/ DL 10/1/ lần x 2 lần
7 Thời gian chiết 60phút/ lần x 2 lần
3.1.2.3. Kết quả chiết xuất, cô cao, loại tạp dịch chiết cúc hoa vàng
Bảng 3.11. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao CHV 2:1
Nội dung thử Bột CHV khôkiệt Dịch chiết CHV
Cao CHV 2:1
trước loại tạp
Cao CHV 2:1
sau loại tạp
Khối lượng, thể tích 9.740,3 g 200,0 lít 4.870,06g 4.870,14g
Flavonoid, n=3 12,95±0,40mg/g 0,588±0,015mg/ml 23,28±1,23mg/g 20,79±0,85mg/g
Hàm lượng chất rắn (%), n=3 70,24±0,95 38,90±0,63
Tỷ lệ chất rắn được loại ra (%) 44,62
Flavonoid mất khi loại tạp (%) 10,70
Hiệu suất chiết, cô cao (%) 89,88 -
Hiệu suất chiết, cô cao và loại tạp (%) 80,27
Flavonoid (mg/g) tính theo cao khô tuyệt đối 33,14 53,45
Tỷ lệ làm giàu flavonoid sau loại tạp (lần) 1,61
Chiết 4 mẻ CHV, mỗi mẻ khoảng 3kg. Lấy 200 lít dịch chiết, cô
thu hồi dung môi được 4870,06g cao CHV 2:1, hàm lượng flavonoid
là 23,28 ± 1,23mg/g. Sau khi loại tạp thu được 4.870,14g cao CHV
2:1, hàm lượng flavonoid là 20,79 ± 0,85mg/g.
3.1.2.3. Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng bằng phương pháp phun sấy
- Ảnh hưởng của loại tá dược: Phun sấy cao CHV ở 160°C, tốc
độ cấp dịch 45ml/phút, tỷ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR) trong cao 1/1,
9tỷ lệ chất rắn/dịch phun (CR/DP) 10%, nhưng với các tá dược là:
maltodextrin (MD), aerosil (AE), MD/AE 8/2, MD/AE 6/4, MD/AE
4/6, MD/AE 2/8. Kết quả: Khi tăng dần tỷ lệ AE, giảm dần tỷ lệ MD
làm tăng dần hàm ẩm, hiệu suất phun sấy, khả năng trơn chảy, nhưng
giảm dần tính hút ẩm, hàm lượng và hiệu suất thu hồ ... ,054 b 0,189 ± 0,078 b
Lô 3 2,538 ± 0,652 bc 1,982 ± 0,495 bc 0,375 ± 0,170 a 0,210 ± 0,073 b
Lô 4 2,900 ± 1,068 b 2,287 ± 0,917 b 0,278 ± 0,083 ab 0,196 ± 0,077 b
Lô 5 2,588 ± 0,579 bc 2,113 ± 0,455 b 0,275 ± 0,086 ab 0,230 ± 0,050 b
Giá trị trong cùng cột có cùng ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Bảng 3.59 cho thấy: Số lượng bạch cầu tổng và các bạch cầu
thành phần giảm mạnh ở lô chiếu xạ và tăng lên ở lô uống levamisol
và Kaviran 2 mức liều. Kết quả vi thể cho thấy, mật độ tế bào tại
hạch, lách, tuyến ức và tủy xương dày đặc hơn, ít bị tổn thương hơn
so với nhóm chuột bị chiếu xạ. Tuyến lách, hạch và ức ở nhóm uống
Kaviran liều 0,72g/kg và 2,16g/kg đều có sự tăng sinh tế bào võng
nội mô, tăng sinh tế bào lympho non. Tủy xương xuất hiện các mẫu
tiểu cầu và các tế bào dòng bạch cầu
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Chiết xuất, bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng,
quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối
4.1.1. Lựa chọn nguyên liệu và kiểm định các dược liệu đầu vào
Để nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng của CHV và quả nhàu, đề tài
định tính, định lượng các hoạt chất bằng HPLC. Kết quả kiểm
nghiệm sâm NLSK là phù hợp với TCCS của nguyên liệu. Ngoài ra,
nhóm flavonoid cũng được sử dụng làm chất đánh dấu trong nghiên
18
cứu chiết xuất, bào chế bột cao khô CHV và quả nhàu vì liên quan
đến tác dụng chống oxy hóa. Phần kết tủa trong EtOH (Noni-ppt)
giàu polysaccharid trong quả nhàu đã được chứng minh có tác dụng
tăng cường miễn dịch nên cũng được lựa chọn làm chỉ tiêu đánh giá
khi xây dựng qui trình chiết xuất.
4.1.2. Điều chế cao cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối
4.1.2.1. Ảnh hưởng của các thông số đến chiết xuất flavonoid từ cúc
hoa vàng và quả nhàu
- Ảnh hưởng của dung môi: Hàm lượng flavonoid chiết được
tăng dần khi tăng nồng độ EtOH và cao nhất ở EtOH là 50%, sau đó
giảm nhẹ khi tiếp tục tăng nồng độ EtOH. Vì flavonoid trong quả
nhàu và CHV ở cả dạng glycosid và aglycol, nên EtOH nồng độ
trung bình sẽ chiết flavonoid toàn phần tốt nhất.
- Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL: Khi tăng tỷ lệ DM/DL làm tăng
hiệu suất chiết, nhưng nếu tỷ lệ này cao quá sẽ tốn dung môi, dịch
chiết thu được loãng, nên khi cần cô đặc dịch chiết sẽ tốn thời gian
và năng lượng hơn. Từ khảo sát đã lựa chọn được tỷ lệ DM/DL thích
hợp: với CHV là 10/1 ở cả 2 lần chiết; với quả nhàu tỷ lệ DM/DL lần
1 và 2 lần lượt là 10/1 và 7,5/1.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết: Hàm lượng flavonoid chiết
được tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng nhiệt độ chiết trên 60ºC đối với
CHV và 70ºC đối với quả nhàu thì không làm tăng đáng kể lượng
flavonoid chiết được. Điều này có thể do nhiệt độ là vừa làm tăng
khối lượng chiết, nhưng cũng tăng nguy cơ phân hủy flavonoid.
- Ảnh hưởng thời gian chiết: Thời gian chiết flavonoid thích
hợp là 60 phút/lần cho cả hai lần chiết. Khi tăng thời gian chiết
không làm tăng lượng flavonoid chiết được (quả nhàu) hoặc giảm
nhẹ (CHV). Vì sóng siêu âm có thể tác động làm phá vỡ khung cấu
trúc của flavonoid, làm giảm lượng flavonoid.
4.1.2.2. Điều chế cao quả nhàu toàn phần
19
Thành phần có tác dụng chính trong quả nhàu gồm cả nhóm
chất kém tan trong nước (flavonoid, scopoletin) và tan trong nước
(polysacharid) nên bào chế cao quả nhàu toàn phần bằng cách chiết
riêng phân đoạn EtOH và nước là thích hợp nhất.
4.1.2.4. Điều chế cao Ngọc linh sinh khối
Điều kiện chiết xuất là: Chiết siêu âm 2 lần với EtOH 70%, tỷ
lệ DM/DL 10/1, ở 60ºC và 60 phút/lần. Hiệu suất điều chế cao sâm
1:1 là 92,61%. Theo tiêu chuẩn công nghiệp, hiệu suất chiết tối thiểu
là 70% và ở quy trình chiết riêng lẻ là 87% hoặc cao hơn khi định
lượng tất cả các ginsenosid. Do vậy, qui trình chiết xuất sâm NLSK
áp dụng là phù hợp.
4.1.3. Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc
linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy
4.1.3.1. Ảnh hưởng của tá dược hỗ trợ phun sấy
Vấn đề khó khăn nhất trong phun sấy dịch chiết dược liệu là
hiện tượng kết dính, làm cho tiểu phân bột không khô, vì vậy cần
thêm các tá dược hỗ trợ phun sấy Trong đề tài này, lựa chọn MD
và AE làm tá dược. Kết quả: MD làm giảm hàm ẩm, tăng khả năng
bảo vệ hoạt chất và hiệu suất phun sấy. AE làm giảm tính hút ẩm,
tăng khả năng trơn chảy. Khi kết hợp giữa MD và AE cho tiểu phân
bột có các đặc tính lý hóa, hiệu suất phun sấy tốt hơn khi dùng riêng
rẽ và tỷ lệ MD/AE thích hợp để bào chế bột cao khô CHV, quả nhàu
và sâm NLSK là 40/60, 25/75 và 50/50.
4.1.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược
Khi tăng tỷ lệ tá dược có xu hướng cải thiện các tính chất lý hóa
như hàm ẩm, tính hút ẩm, khối lượng riêng, khả năng trơn chảy và
hiệu suất phun sấy. Mặt khác, tá dược làm hạn chế tác động của nhiệt
độ và/hoặc oxy không khí, nên làm tăng độ ổn định cho hoạt chất.
Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ tá dược lại làm giảm hàm lượng hoạt chất
do hiện tượng pha loãng nồng độ. Do đó, với mỗi loại dịch chiết
20
dược liệu, cần lựa chọn tỷ lệ tá dược thích hợp nhất. Từ khảo sát đã
lựa chọn được tỷ lệ TD/CR thích hợp nhất để bào chế bột cao khô
CHV, quả nhàu và sâm NLSK lần lượt là 40, 20 và 30%.
4.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy
Ưu điểm của phương pháp phun sấy là các giọt lỏng được sấy
khô ở nhiệt độ cao trong quá trình liên tục với thời gian rất ngắn (vài
giây), nên giảm thiểu được sự tác động của nhiệt độ đến độ ổn định
hoạt chất. Hàm lượng flavonoid, scopoletin và ginsenosid (Rg1,
Rb1) đều có xu hướng giảm khi tăng nhiệt độ phun sấy, nhưng mức
độ giảm này là tương đối thấp. Ngoài ra, nhiệt độ phun sấy cũng ảnh
hưởng đến các thông số hóa lý khác của sản phẩm. Từ khảo sát đã
lựa chọn được thông số thích hợp để phun sấy cao CHV và quả nhàu
là 120ºC, 30ml/phút, cao sâm NLSK là 1400C, 30ml/phút.
4.1.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn trong dịch phun sấy
Tỷ lệ CR/DP ít ảnh hưởng đến hàm ẩm, tính hút ẩm, hàm lượng
và hiệu suất thu hồi hoạt chất, nhưng lại ảnh hưởng rõ rệt đến khối
lượng riêng và hiệu suất phun sấy. Khi tăng tỷ lệ CR/DP làm tăng
mật độ chất rắn và giảm độ xốp bên trong tiểu phân giảm nên làm
tăng khối lượng riêng và khả năng trơn chảy của bột, nhưng khi tỷ lệ
này cao quá làm tăng độ nhớt dịch phun nên làm giảm hiệu suất phun
sấy. Tỷ lệ CR/DP 15% là thích hợp nhất để bào chế bột cao khô
CHV, quả nhàu và sâm NLSK bằng phương pháp phun sấy.
4.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô cúc hoa vàng, quả
nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối
Hiện nay, việc bào chế cao tiêu chuẩn hay cao định chuẩn có ý
nghĩa lớn đối với sản xuất thuốc từ dược liệu, nó cho phép kiểm soát
tốt chất lượng của sản phẩm trong quá trình sản xuất cũng như lưu
hành. Trong đề tài này, các bột cao khô bán thành phẩm đã được
chuẩn hóa bằng việc xây dựng TCCS. Trong đó, các chỉ tiêu, mức
21
chất lượng, phương pháp đánh giá là rõ ràng và phù hợp, đáp ứng
được yêu cầu nguyên liệu để bào chế viên nang cứng Kaviran.
4.2. Xây dựng công thức, tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định
của viên nang Kaviran
4.2.1. Xây dựng công thức bào chế
Viên nang Kaviran bào chế từ sâm NLSK, CHV và quả nhàu,
không xuất phát từ bài thuốc cổ phương. Do vậy, để xây dựng công
thức dược chất, tiến hành đánh giá tác dụng chống hóa in vitro và tác
dụng trên trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ
in vivo của các hỗn hợp cao, từ đó lựa chọn được thành phần dược
chất là: bột cao khô sâm NLSK 60mg, bột cao khô CHV 180mg, bột
cao khô quả nhàu 180mg. Căn cứ vào các chỉ tiêu về khối lượng
riêng, khả năng trơn chảy của hỗn hợp bột, độ rã và khối lượng viên
nang đã xây dựng được công thức bào chế viên cứng Kaviran.
4.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran
Căn cứ vào các yêu cầu chất lượng chung của viên nang cứng
theo DĐVN IV và hướng dẫn kiểm tra chất lượng thuốc từ dược liệu
của cơ quan thuốc Châu Âu (EMEA) để xây dựng TCCS cho viên
nang Kaviran. Trong đó, hàm lượng hoạt chất trong viên là tương
đương với các chế phẩm tương tự trên thị trường, hoặc liều khuyến
cáo của các dược liệu.
4.3. Đánh giá tính an toàn và tác dụng tăng cường miễn dịch,
chống oxy hóa, bảo vệ gan trên thực nghiệm
4.3.1. Đánh giá tính an toàn của viên nang cứng Kaviran
Việc đánh giá tính an toàn là điều kiện bắt buộc đối với chế
phẩm bào chế từ dược liệu, vì qua quá trình bào chế có thể gây biến
đổi các thành phần hóa học nên có thể thay đổi độc tính của sản
phẩm cuối cùng. Viên nang Kaviran uống với liều cao nhất (36g/kg),
sau 24 giờ và 7 ngày không thấy các bất thường và không có chuột
nào chết. Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn trên thỏ cho
22
thấy: Chế phẩm Kaviran uống liên tục trong 42 ngày với mức liều
240mg và 1200mg/kg/24h không thấy có những biến đổi bất thường
về sinh hóa, huyết học và mô bệnh học thỏ (gan, thận, lách).
4.3.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa trên động vật
thực nghiệm của viên nang Kaviran
Mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol được lựa chọn
do paracetamol liều cao gây tổn thương gan bằng cơ chế sinh ra gốc
tự do, làm cạn kiệt hệ thống chống oxy hoá của cơ thể, làm tăng hoạt
độ AST, ALT, MDA trong huyết tương và làm biến đổi cấu trúc gan.
Do vậy, luận án lựa chọn các chỉ số AST, ALT, MDA kết hợp với
quan sát đại thể, vi thể gan chuột là hoàn toàn phù hợp. Kết quả cho
thấy: Kaviran ở ba mức liều: liều D1 (0,72g/kg - tương đương liều
dự kiến lâm sàng), liều D2 (2,16 g/kg), liều D3 (4,32 g/kg), thì liều
D2 và D3 thể hiện rõ tác dụng. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan
của Kaviran cũng phù hợp với các nghiên cứu về nguyên liệu.
4.3.3. Đánh giá tác dụng của viên nang Kaviran trên chuột nhắt
trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ
Mô hình chiếu xạ được lựa chọn để nghiên cứu vì khi chiếu xạ
bởi tia γ gây biến đổi về chức năng và cấu trúc cơ quan tạo máu, cơ
quan miễn dịch, đặc biệt là các mô tủy xương, lách, tuyến ức, hạch,
máu ngoại vi, vì đây là các cơ quan có nhiều tế bào non đang trong
quá trình biệt hóa nên rất nhạy cảm với tia xạ.
Viên nang Kaviran được bào chế từ CHV, quả nhàu và sâm
NLSK. Công thức bào chế được thiết lập trên cơ sở chiết xuất, bào
chế để tạo nên sự phối hợp giữa nhóm flavonoid - polysaccharid -
ginsenosid với tác dụng chính là tăng cường miễn dịch, chống oxy
hóa. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, sự kết hợp giữa
polysacharid với flavonoid, hoặc giữa polysacharid với ginsenosid
đều làm tăng cường miễn dịch khi thử nghiệm trên động vật thực
nghiệm.
23
KẾT LUẬN
1. Đã bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa
vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối:
- Đã kiểm nghiệm bổ sung về định tính, định lượng các hoạt
chất chính trong CHV và quả nhàu; định lượng ginsenosid (Rb1,
Rg1) trong sâm NLSK bằng HPLC, từ đó tiêu chuẩn hóa được các
dược liệu đầu vào.
- Đã đánh giá được ảnh hưởng của các thông số qui trình chiết
siêu âm và phun sấy đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm. Từ đó đã
xây dựng được qui trình chiết xuất và bào chế bột cao khô CHV, quả
nhàu và sâm NLSK bằng phương pháp phun sấy.
- Đã đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của bột cao khô CHV,
quả nhàu và sâm NLSK, từ đó xây dựng và thẩm định được TCCS
cho từng nguyên liệu.
2. Đã bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô
định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối:
Đã xây dựng được thành phần dược chất cho viên cứng Kaviran
gồm: Bột cao khô sâm NLSK 60mg, bột cao khô CHV 180mg, bột
cao khô quả nhàu 180mg. Từ khảo sát thành phần tá dược đã xây
dựng được công thức và qui trình bào chế viên nang cứng Kaviran;
Đã xây dựng và thẩm định được TCCS của chế phẩm. Chế phẩm ổn
định khi thử nghiệm ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong 6 tháng và
điều kiện dài hạn trong12 tháng.
3. Đã đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn
dịch, chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran
trên thực nghiệm:
- Kaviran dùng liều cao nhất có thể cho chuột nhắt uống
(36g/kg, sau 24 giờ và 7 ngày không thấy chuột nào chết ở tất cả các
lô nghiên cứu, nghĩa là không xác định được LD50 của chế phẩm.
24
- Kaviran liều 240 và 1200mg/kg/24 giờ, uống liên tục trong 42
ngày không ảnh hưởng đến sự phát triển cân nặng thỏ, không biến
đổi điện tim thỏ và các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu
cầu, hemoglobin). Các chỉ số đánh giá chức năng gan và thận trong
giới hạn bình thường. Hình ảnh đại thể và vi thể của gan, thận và
lách thỏ bình thường.
- Kaviran có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa trên mô hình
gây độc bằng paracetamol ở chuột nhắt trắng: Làm giảm khối lượng
gan, giảm hoạt độ AST và ALT huyết thanh, giảm tổn thương mô
bệnh học của gan so với lô mô hình. Kaviran liều 4,32 g/kg tác dụng
tốt hơn silymarin 140 mg/kg (p < 0,05); Kaviran có tác dụng chống
oxy hóa do làm giảm hàm lượng MDA dịch đồng thể gan.
- Kaviran có tác dụng tăng cường miễn dịch trên mô hình gây
suy giảm miễn dịch chuột nhắt trắng do chiếu tia xạ: Làm tăng khối
lượng lách và ức tương đối, tăng số lượng bạch cầu chung, bạch cầu
lympho và bạch cầu đơn nhân so với nhóm chứng chiếu xạ. Trên mô
bệnh học, Kaviran có tác dụng làm tăng sự phục hồi các tế bào trong
hạch, lách, tuyến ức và tủy xương so với nhóm chiếu xạ đơn thuần.
Tác dụng của Kaviran liều 0,72 và 2,16g/kg tương đương với
levamisol liều 50mg/kg (p > 0,05).
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang
cứng Kaviran ở quy mô lớn hơn và đánh giá độ ổn định của chế
phẩm với thời gian dài hơn.
- Đánh giá thêm một số tác dụng sinh học của chế phẩm trên
thực nghiệm và lâm sàng nhằm xác định rõ hơn liều dùng và tác
dụng điều trị của chế phẩm.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG
BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Tùng
Linh, Nguyễn Thanh Hải (2013), Nghiên cứu chiết xuất flavonoid
toàn phần từ Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.), Tạp chí Y
Dược học Quân sự, 38(9), tr. 39-45.
2. Nguyễn Trọng Điệp, Chử Văn Mến, Vũ Bình Dương, Nguyễn
Vũ Minh, Nguyễn Thanh Hải (2014), Nghiên cứu định lượng
luteolin, apigenin trong dược liệu và bột cao khô cúc hoa vàng
(Chrysanthemum indicum L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao, Tạp chí Dược học, 461(54), tr. 66-70.
3. Nguyễn Trọng Điệp, Vũ Bình Dương, Nguyễn Thanh Hải
(2015), Nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược đến chất lượng bột cao
khô cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.) bào chế bằng
phương pháp phun sấy, Tạp chí Y Dược học Quân sự, 40(1), tr.11-
18.
4. Nguyễn Trọng Điệp, Vũ Bình Dương, Nguyễn Thanh Hải
(2015), Nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược đến qui trình bào chế bột
cao khô quả nhàu (Morinda citrifolia L.) bằng phương pháp phun
sấy, Tạp chí Dược học, 465(55), tr. 13-18.
5. Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Tùng Linh, Nguyễn Văn Long
(2016), Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của viên nang
cứng Kaviran trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu
tia xạ, Tạp chí Y Dược học Quân sự, 41 (Số chuyên đề Dược), tr.
117-124.
6. Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Tùng Linh (2016), Nghiên cứu tác
dụng bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên mô hình gây tổn
thương gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol, Tạp chí Y Dược học
Quân sự, 41(9), tr. 5-11.