Tóm tắt Luận án Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 
TẠ MẠNH HÙNG 
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG 
ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI 
QUANG TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 
THUỐC VÀ TRONG DỊCH SINH HỌC 
Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT 
Mã số: 62720410 
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
Hà Nội, năm 2016
 Công trình được hoàn thành tại: 
 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 
 VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu 
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 
Phản biện 1: . 
 . 
Phản biện 2: . 
 . 
Phản biện 3: . 
 . 
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường 
họp tại: .. 
... 
... 
Vào hồi giờngày.thángnăm 2016. 
Có thể tìm hiểu luận án tại: 
 Thư viện Quốc gia Việt Nam 
 Thư viện Trường đại học Dược Hà Nội. 
1 
A – GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 
1. Tính cấp thiết của luận án 
Theo thống kê, khoảng 50% số hoạt chất đang lưu hành trên thị trường 
dược phẩm là các hợp chất có đồng phân đối quang (ĐPĐQ) và gần 1/3 
trong số này, các ĐPĐQ của dược chất có đặc tính dược lý, dược lực 
học, độc tính không giống nhau. Atenolol (ATN) dẫn chất của 
benzenacetamid, có tác dụng ức chế chọn lọc β–adrenergic, được dùng 
trong điều trị tăng huyết áp là một trong số những dược chất có các đặc 
điểm nêu trên. Trong hai ĐPĐQ, đồng phân tả tuyền (S-ATN) có tác 
dụng ức chế β–adrenergic cao hơn khoảng 50 lần và ít tác dụng phụ hơn 
so với đồng phân hữu tuyền (R-ATN). Để giảm lượng dược chất đưa 
vào cơ thể, giảm tác dụng không mong muốn của R-ATN và duy trì 
quyền bảo hộ, nhiều công ty dược đã và đang nghiên cứu sản xuất các 
chế phẩm thuốc chỉ có dược chất S-ATN với hàm lượng bằng 1/2 thuốc 
ATN racemic. 
Xu hướng nghiên cứu chuyển các thuốc có các ĐPĐQ tác dụng dược 
lý khác nhau ở dạng racemic thành thuốc chứa một ĐPĐQ đang là một 
hướng phát triển mới của ngành công nghiệp dược trong những năm gần 
đây. Hướng phát triển này, đòi hỏi phải có các phương pháp phân tích 
ĐPĐQ trong kiểm tra chất lượng, nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và 
đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) các thuốc. Tuy nhiên, các 
ĐPĐQ có cấu tạo hóa học giống nhau, nhiều tính chất lý-hóa tương tự 
nhau nên phân tích ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc và đặc biệt trong dịch 
sinh học còn gặp nhiều khó khăn. 
Do vậy, luận án “Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng 
phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh 
học” đã được thực hiện. 
2. Mục tiêu của luận án 
 Luận án được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu các phương pháp phân 
tích ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc và trong huyết tương 
(HT) nhằm góp phần kiểm soát chất lượng thuốc và so sánh SKD, 
2 
TĐSH các thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường. Để đạt được mục 
tiêu này, luận án thực hiện các nội dung chính sau: 
1) Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích các 
ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc. 
2) Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích ATN và 
các ĐPĐQ trong huyết tương. 
3) Ứng dụng các phương pháp phân tích (PPPT) đồng phân trong 
kiểm tra chất lượng và nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH một số 
chế phẩm thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường. 
3. Những đóng góp mới của luận án 
 Lần đầu tiên tại Việt Nam, xây dựng thành công các phương pháp 
điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng–
khối phổ (LC-MS/MS) phân tích ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm 
thuốc và trong HT người. 
- Phương pháp CE phân tách các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm với 
cột mao quản silica nung chảy cùng dung dịch điện ly nền chứa tác 
nhân hoạt quang carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD) đáp ứng 
các yêu cầu của Dược điển Việt Nam, Anh, Mỹ. 
- Phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang 
cellobiohydrolase có thời gian phân tích ngắn (dưới 8 phút), độ phân 
giải giữa các pic đồng phân lớn (Rs > 5), giới hạn định lượng nhỏ 
(0,273 ppm) không những phù hợp để phân tích các ĐPĐQ của ATN 
trong chế phẩm thuốc mà còn thích hợp để xác định hàm lượng tạp 
chất đối quang R-ATN trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm thuốc 
đơn đồng phân S-ATN với mức giới hạn rất thấp (dưới 0,1%). 
- Phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT 
người với cột C18 có kích thước hạt nhồi nhỏ và xác định nồng độ 
ATN bằng MS/MS với nguồn ion hóa ESI (+) có thời gian phân tích 
rất ngắn (2,5 phút), giới hạn định lượng dưới rất nhỏ (5 ppb). 
- Phương pháp LC-MS/MS phân tích các ĐPĐQ của ATN trong HT 
người bằng LC-MS/MS với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang và 
3 
xác định nồng độ ATN trong mẫu bằng MS/MS với nguồn ESI (+) 
có thời gian phân tích ngắn, độ phân giải giữa các pic đồng phân lớn, 
giới hạn định lượng dưới rất nhỏ (2,5 ppb). 
Phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong HT 
người nghiên cứu trong luận án được công bố lần đầu. 
 Lần đầu tiên tại Việt Nam, đã kiểm tra chất lượng và nghiên cứu 
SKD in vivo một số thuốc ATN (dạng racemic và dạng S-ATN) đang lưu 
hành bằng các phương pháp phân tích đồng thời ĐPĐQ. 
- Các mẫu thuốc S-ATN có hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN 
không giống nhau, 1 mẫu có hàm lượng tạp > 2,0%. 
- SKD của R-ATN và S-ATN trên người tình nguyện (NTN) tương tự 
nhau, không có sự chuyển dạng giữa các đồng phân. S-ATN trong 
thuốc đơn đồng phân có SKD cao hơn so với S-ATN trong thuốc 
racemic. Các thuốc ATN racemic có Cmax, AUC và Tmax tương 
đương nhau. Các thuốc S-ATN có Cmax và AUC khác nhau. 
4. Ý nghĩa của luận án 
Phân tích ĐPĐQ trong chế phẩm và đặc biệt là phân tích các ĐPĐQ 
trong dịch sinh học cho đến nay vẫn là một trong các chủ đề phân tích 
khá khó khăn không những ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước khác. Việc 
xây dựng thành công các phương pháp phân tích ĐPĐQ của ATN trong 
chế phẩm thuốc và trong HT giúp nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát 
chất lượng các thuốc đối quang của hệ thống kiểm nghiệm trong nước. 
 Kết quả kiểm tra chất lượng, nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH 
một số chế phẩm thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường cho thấy sự 
cần thiết phải có các phương pháp phân tích ĐPĐQ để đảm bảo chất 
lượng, hiệu quả điều trị và công bằng thương mại giữa các thuốc đối 
quang dạng racemic và dạng đơn đồng phân. 
5. Bố cục của luận án 
Luận án gồm 4 chương, 58 bảng, 66 hình, 206 tài liệu tham khảo với 19 
tài liệu tiếng Việt, 187 tài liệu tiếng Anh và 6 phụ lục. 
 Luận án dài 148 trang, gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); 
4 
Chương 1: Tổng quan (46 trang); Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị, 
nội dung và phương pháp nghiên cứu (13 trang); Chương 3: Kết quả 
nghiên cứu (68 trang); Chương 4: Bàn luận (16 trang); Kết luận và kiến 
nghị (3 trang). 
B – NỘI DUNG LUẬN ÁN 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 
Đã trình bày và tập hợp có hệ thống 3 nội dung chính liên quan đến luận 
án bao gồm: 
- Khái niệm thuốc chứa dược chất đối quang; tầm quan trọng của 
phân tích ĐPĐQ; tình hình nghiên cứu phân tích ĐPĐQ trong 
nước; nguyên lý phân tích ĐPĐQ và các phương pháp phân tích 
ĐPĐQ thường gặp. 
- Kỹ thuật xử lý, chiết tách hoạt chất cần phân tích trong mẫu dịch 
sinh học; phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng LC-MS/MS và 
các yêu cầu thẩm định PPPT thuốc trong dịch sinh học của US-
FDA và EMA. 
- Tổng quan về atenolol; các nghiên cứu phân tích ATN và ĐPĐQ 
trong chế phẩm thuốc và trong dịch học từ trước đến nay ở Việt 
Nam và trên thế giới. 
ĐPĐQ là hai đồng phân không gian dạng ảnh và vật qua gương, 
chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau chỉ khác về cách bố 
trí không gian của các nhóm thế quanh trung tâm bất đối xứng của phân 
tử. Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các nhóm thế làm cho mỗi 
dạng đồng phân có tương tác khác nhau với một thụ thể sinh học xác 
định (tương tự như phản ứng đặc hiệu “chất mang-thụ thể” của các 
enzym). Lịch sử y văn thế giới từng ghi nhận một thảm họa y học liên 
quan đến ĐPĐQ tả tuyền trong thuốc thalidomid dạng racemic (hội 
chứng phocomelia) nhưng số lượng các thuốc chứa dược chất đối quang 
vẫn không ngừng gia tăng qua các năm vừa qua. Theo thống kê, khoảng 
50% số hoạt chất đang lưu hành trên thị trường dược phẩm là các hợp 
chất có tính đối quang và gần 1/3 trong số này, các ĐPĐQ của dược chất 
5 
có đặc tính sinh học trên cơ thể sống không giống nhau. Các thuốc có 
doanh số bán chạy nhất toàn cầu các năm 2006 – 2012 đều là các thuốc 
chứa dược chất đối quang. Xu hướng này đòi hỏi phải có các PPPT phù 
hợp trong nghiên cứu phát triển sản phẩm cũng như trong kiểm tra chất 
lượng, nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH các thuốc đối quang. 
 Các ĐPĐQ có công thức cấu tạo hóa học giống nhau và nhiều tính 
chất lý-hóa tương tự nhau nên trên thực tế không thể phân tích bằng các 
phương pháp HPLC, GC hoặc CE thông thường. Đặc điểm thường được 
sử dụng để phân tách hai ĐPĐQ của một hỗn hợp racemic bằng các 
PPPT hóa lý là khả năng tương tác khác nhau của các ĐPĐQ đối với 
một chất chọn lọc hoạt quang xác định. Trong dung dịch, sự tương tác 
giữa tác nhân chọn lọc hoạt quang (Re-S) và các đồng phân hữu tuyền 
(R-A) hoặc tả tuyền (S-A) được mô tả bằng các phương trình phản ứng: 
  )S(ReAKR SReA-R R    
  )S(ReASKS SReA-S    
Hỗn hợp các phức hợp phi đối quang tạo thành có năng lượng và độ bền 
liên kết khác nhau phụ thuộc vào cấu tạo của đồng phân và tác nhân 
hoạt quang. Sự khác biệt giữa các hằng số tạo phức KR, KS và sự khác 
biệt về độ bền của các phức hợp tạo thành là cơ sở hóa lý của việc phân 
tích đồng phân đối quang bằng phương pháp sắc ký hoặc điện di. Tùy 
theo cơ chế tạo phức và đặc điểm của PPPT, các tác nhân chọn lọc hoạt 
quang có thể được thêm vào hệ thống phân tích theo một trong hai cách 
là trực tiếp hoặc gián tiếp. 
 Atenolol là một dẫn chất của benzenacetamid (CTPT: C14H22N2O3, 
KLPT: 266,3 g/mol) và có tên khoa học là 4-[2-hydroxy-3-[(1-
metyletyl)amino]propoxy] benzeneacetamid. Do phân tử có cấu tạo bất 
đối xứng, trong công thức cấu tạo phân tử, nguyên tử carbon bất đối ở 
mạnh nhánh liên kết các nhóm thế khác nhau nên ATN có các ĐPĐQ tả 
tuyền và hữu tuyền. Trong hai ĐPĐQ, S-ATN có tác dụng ức chế chọn 
lọc β–adrenergic cao hơn và các tác dụng phụ như loạn nhịp, đánh trống 
ngực ít hơn so với R-ATN. ATN là một trong số ít các dược chất đối 
6 
quang, đã được Cơ quan quản lý thuốc của một số nước đồng ý cấp 
phép cho lưu hành song song ở cả hai dạng ATN racemic và S-ATN. 
Các thuốc đơn đồng phân S-ATN có hàm lượng bằng 1/2 hàm lượng 
thuốc ATN racemic. Tuy vậy, ATN là một dược chất có SKD không 
cao, nồng độ dược chất trong máu thấp và dao động mạnh giữa các cá 
thể đồng thời SKD của S-ATN so với ATN racemic chưa được nghiên 
cứu, thiết lập đầy đủ. Do đó, cần thiết phải xây dựng PPPT các ĐPĐQ 
của ATN trong chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học nhằm đánh giá 
chất lượng và so sánh SKD các thuốc đối quang ATN. 
Việc nghiên cứu phân tích và quản lý chất lượng thuốc đối quang 
ATN nói riêng và một số thuốc đối quang khác nói chung tại Việt Nam 
còn nhiều hạn chế và mới được quan tâm trong một số năm gần đây. 
Dược điển Việt Nam lần xuất bản thứ IV năm 2009, mới chỉ có 03 
chuyên luận quy định mức giới hạn tạp chất đối quang cho các dược 
chất dexclopheniramin, lamivudin và timolol. Trong những năm gần đây 
mới có khoảng 10 nghiên cứu phân tích tạp chất đối quang trong các chế 
phẩm thuốc được tiến hành. Chưa có nghiên cứu nào, phân tích ĐPĐQ 
của ATN trong chế phẩm và trong dịch sinh học được công bố. 
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ 
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị 
2.1.1. Dung môi, hóa chất và chất chuẩn 
- Chất chuẩn: Atenolol – VKNTTW, hàm lượng 100,17%, độ ẩm 
0,11%; SKS: 0102093. S-ATN – Sigma, hàm lượng 99,3%, lô: 
021M4620V. R-ATN – Sigma, hàm lượng 99,9%, lô: STBD2674V. 
- Các dung môi, hóa chất thuốc thử dùng trong nghiên cứu: Đạt tiêu 
chuẩn LC-MS, HPLC và tinh khiết hóa học tùy theo từng loại. 
- Các mẫu HT do Viện huyết học và truyền máu TW cung cấp dùng 
trong xây dựng và thẩm định PPPT trong dịch sinh học. 
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích 
- Tất cả các thiết bị được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng yêu cầu 
7 
GLP và ISO-IEC 17025, bao gồm các thiết bị phân tích: Máy HPLC: 
(Shimadzu–Nhật Bản); máy UPLC-MS/MS (Thermo Scientific–Mỹ); 
máy CE (Agilent–Mỹ). Ngoài các thiết bị phân tích chính nêu trên còn 
có cân phân tích (d = 0,01 và 0,1 mg), máy đo pH, máy thử độ hòa tan, 
các thiết bị xử lý, chiết tách và bảo quản mẫu như: Máy lắc siêu âm, lắc 
cơ học, ly tâm, tủ lạnh sâu bảo quản mẫu 
- Các dụng cụ phân tích bao gồm: Cột điện di mao quản silica nung 
chảy; các cột HPLC có thành phần pha tĩnh hoạt quang khác nhau; 
micropipet và các loại dụng cụ thủy tinh chính xác, dụng cụ thủy tinh 
pha và xử lý mẫu 
2.2. Đối tượng nghiên cứu 
2.2.1. Mẫu thuốc nghiên cứu 
- Thuốc viên nén ATN dạng racemic: 03 thuốc Việt Nam sản xuất và 01 
thuốc biệt dược gốc (Ternomin 50mg – AstraZeneca, Anh). 
- Thuốc viên nén S-ATN: 01 thuốc do AhGook Pharm. Ltd., Hàn Quốc 
sản xuất và 03 thuốc của Emcure Pharmaceutical Ltd., Ấn Độ. 
 2.2.2. Mẫu huyết tương người chứa atenolol 
- Các mẫu HT tự tạo chứa ATN: Hòa tan chuẩn ATN hoặc chuẩn R-
ATN hay chuẩn S-ATN trong HT trắng với các nồng độ khác nhau. 
- Mẫu thử: Các mẫu HT của NTN tham gia nghiên cứu khảo sát 
SKD/TĐSH các thuốc ATN (racemic hay S-ATN) hoặc các mẫu HT của 
bệnh nhân sử dụng các chế phẩm thuốc ATN. 
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 
2.3.1. Nghiên cứu định lượng atenolol và ĐPĐQ trong chế phẩm 
2.3.1.1. Khảo sát xây dựng phương pháp 
- Phương pháp CE: Nghiên cứu phân tách các ĐPĐQ bằng phương pháp 
điện di mao quản vùng trên cột mao quản silica nung chảy với các dung 
dịch điện ly nền chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang khác nhau. Nghiên 
cứu ảnh hưởng của các yếu tố như thành phần, pH, nồng độ dung dịch 
đệm; bản chất, nồng độ tác nhân chọn lọc hoạt quang đến khả năng 
tách đồng phân ATN để lựa chọn điều kiện điện di phù hợp. 
8 
- Phương pháp HPLC: nghiên cứu phân tích các ĐPĐQ của ATN với 
các cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang có thành phần và bản chất khác 
nhau. Đối với mỗi loại cột, tiến hành khảo sát: thành phần, tỷ lệ các 
thành phần trong pha động; ảnh hưởng của pH dung dịch đệm... đến khả 
năng phân tách các ĐPĐQ. 
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp 
Tiến hành thẩm định các PPPT theo hướng dẫn thẩm định của dược điển 
với các chỉ tiêu: Độ thích hợp của hệ thống; độ đặc hiệu-chọn lọc; 
khoảng nồng độ tuyến tính; giới hạn LOD, LOQ; độ đúng; độ chụm. 
2.3.1.3. Ứng dụng PPPT kiểm tra chất lượng các thuốc atenolol 
- Xác định hàm lượng các ĐPĐQ của ATN trong một số chế phẩm 
thuốc đang lưu hành bằng các phương pháp HPLC, CE đã được nghiên 
cứu xây dựng và thẩm định ở trên. Phân tích thống kê, so sánh kết quả 
định lượng ATN của các phương pháp. So sánh kết quả định lượng ATN 
toàn phần bằng các phương pháp nghiên cứu trong luận án với phương 
pháp của Dược điển Mỹ. 
- Phân tích xác định hàm lượng tạp chất R-ATN trong các chế phẩm S-
ATN bằng các phương pháp  ... 
hai phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng và thẩm định ở trên. Kết quả 
phân tích thống kê t-test, nồng độ trung bình ATN toàn phần trong các 
mẫu HT xác định bằng hai phương pháp LC-MS/MS khác nhau không 
có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy trên 95%. 
3.2.3.2. Phân tích ATN trong HT bệnh nhân 
Phân tích xác định nồng độ các ĐPĐQ của ATN trong 23 mẫu HT của 8 
bệnh nhân điều trị bệnh tim mạch nội trú, phác đồ điều trị có chỉ định 
dùng thuốc ATN đồng ý tham gia nghiên cứu bằng phương pháp LC-
MS/MS đã xây dựng. Kết quả trình bày ở Bảng 3.38. 
Bảng 3.38. Nồng độ các ĐPĐQ của ATN trong HT bệnh nhân 
Stt 
Bệnh 
nhân 
Mẫu 0h Mẫu 2h Mẫu 24h 
R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN 
1 T.V.H 0 0 178,6 175,6 9,1 9,3 
2 H.T.T 15,5 14,7 124,6 122,4 * * 
3 T.V.C 21,2 22,6 88,6 90,4 24,8 23,5 
4 H.V.S 12,7 12,1 102,4 100,1 11,8 12,5 
5 N.V.S 0 0 138,3 134,2 7,8 8,3 
6 L.T.V.A 18,4 19,5 91,8 94,3 21,2 20,4 
7 N.T.T.H 0 0 73,2 70,1 9,0 10,2 
8 L.T.T.H 8,2 9,1 56,7 58,2 7,7 7,6 
Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp có độ đặc hiệu-chọn lọc và 
độ đúng cao. Kết quả phân tích không bị ảnh hưởng bởi các thuốc sử 
dụng đồng thời trong phác đồ điều trị của các bệnh nhân. Một số mẫu 
18 
RT: 0.00 - 7.00
0 2 4 6
Time (min)
50
100
50
100
R
el
at
iv
e 
A
bu
nd
an
ce
50
100
RT: 3.70
RT: 5.89
RT: 3.70
RT: 5.89
RT: 4.34
RT: 0.00 - 7.00
0 2 4 6
Time (min)
50
100
50
100
R
el
at
iv
e 
A
bu
nd
an
ce
50
100
RT: 5.87
RT: 4.37
HT thời điểm 0 giờ nồng độ ATN > 0 do bệnh nhân đã sử dụng thuốc 
ATN trước khi tham gia vào nghiên cứu của chúng tôi. 
3.2.3.3. Phân tích ATN trong huyết tương NTN tham gia nghiên cứu so 
sánh SKD thuốc ATN 
Mười tám thanh niên khỏe mạnh, tình nguyện tham gia nghiên cứu được 
chia làm 3 nhóm, mỗi nhóm 6 người: Nhóm 1, so sánh SKD của 
Atenolol Stada 50mg và Ternomin 50mg (thuốc ATN racemic); nhóm 2, 
so sánh SKD hai thuốc S-ATN (Atpure® 25 và S-atenolol 25mg); nhóm 
3, so sánh SKD của S-ATN giữa một thuốc ATN racemic (Ternomin 
50mg) với một thuốc S-ATN (Atpure® 25). Thiết kế nghiên cứu đơn 
liều, chéo 2 x 2. Trong mỗi nhóm, mỗi giai đoạn, NTN uống 1 viên 
thuốc thử hoặc 1 viên thuốc đối chứng theo trình tự sử dụng thuốc ngẫu 
nhiên hóa và ngược nhau ở hai giai đoạn. Tiến hành cho NTN uống 
thuốc và lấy các mẫu máu. Lấy 14 mẫu máu/giai đoạn x 5 ml máu/mẫu 
trên mỗi NTN. Nghiên cứu được HĐĐĐ trong nghiên cứu Y sinh học 
phê duyệt đề cương trước khi tiến hành. 
SKĐ phân tích LC-MS/MS xác định nồng độ các ĐPĐQ của ATN trong 
một số mẫu HT của NTN được trình bày ở Hình 3.36; 3.38. 
Hình 3.36. SKĐ mẫu HT của 
NTN02 – 2,5h (ATN racemic) 
Hình 3.38. SKĐ mẫu HT của 
NTN08 – 2,0 h (S-ATN) 
19 
Từ kết quả phân tích, xác định các thông số DĐH và SKD của các thuốc 
(Bảng 3.43) và đường cong nồng độ dược chất - thời gian của các thuốc 
(Hình 3.40 và Hình 3.41). 
Hình 3.40. Đường cong trung bình nồng độ S-ATN – thời gian của các 
chế phẩm thuốc trên người tình nguyện Việt Nam 
Hình 3.41. Đường cong trung bình nồng độ R,S-ATN – thời gian 
20 
Bảng 3.43. Thông số DĐH trung bình của một số thuốc ATN trên NTN 
T.số 
Thuốc 
Cmax 
(ng/ml) 
Tmax 
(h) 
AUC0-t 
(ng.ml-1.h) 
AUC0-∞ 
(ng.ml-1.h) 
T1/2 
(h) 
Ternomin 50mg (n = 12) 
R-ATN 196,4 2,17 1478,0 1559,8 5,34 
S-ATN 192,0 2,15 1428,0 1541,1 5,39 
R,S-ATN 388,4 2,16 2905,3 3137,0 5,37 
Atenolol – STADA 50mg (n = 6) 
R-ATN 182,7 2,25 1422,8 1495,1 5,25 
S-ATN 177,8 2,25 1342,5 1414,8 5,31 
R,S-ATN 360,5 2,25 2765,3 2909,9 5,28 
Atpure® 25mg (n = 12) 
S-ATN 259,3 2,31 1779,9 1906,1 5,24 
Viên nén S-atenolol 25mg (n = 6) 
S-ATN 196,5 1,92 1348,7 1429,2 5,19 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 
4.1. Phân tích ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng HPLC và CE 
Các ĐPĐQ có công thức hóa học và tính chất hóa lý giống nhau nên 
không thể phân tách với các điều kiện phân tích thông thường. Dựa trên 
nguyên tắc các ĐPĐQ phản ứng với một tác nhân đối quang thích hợp 
sẽ tạo các phức hợp phi đối quang có năng lượng liên kết và độ bền khác 
nhau tùy thuộc vào sự tương tác giữa các đồng phân và tác nhân, chúng 
tôi đã xây dựng được các phương pháp HPLC, CE phân tích các ĐPĐQ 
của ATN. Phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối 
quang cellobiohydrolyse có bản chất là một protein, chất hoạt quang tự 
nhiên, phân tử lượng lớn và có nhiều trung tâm bất đối xứng để tạo phức 
hợp với các ĐPĐQ. Phương pháp CE sử dụng tác nhân chọn lọc hoạt 
quang dẫn chất β-CD mang điện tích trong dung dịch điện ly nền để 
tương tác tạo phức “lồng” với các đồng phân R- và S-ATN. 
 So với phương pháp HPLC, phương pháp CE tốn ít hóa chất, thuốc 
thử cho xử lý mẫu và chạy máy. Dung dịch điện ly nền ít độc hại với 
21 
môi trường và an toàn cho kiểm nghiệm viên. Tác nhân hoạt quang được 
thêm vào dung dịch điện ly nền nên việc thay đổi loại và nồng độ tác 
nhân khi nghiên cứu khảo sát phân tách các ĐPĐQ tương đối dễ thực 
hiện. Trong khi đó phương pháp HPLC sử dụng các cột sắc ký chứa pha 
tĩnh hoạt quang, mỗi loại pha tĩnh hoạt quang chỉ thích hợp cho phân 
tách một số ĐPĐQ nhất định, nên việc khảo sát lựa chọn điều kiện sắc 
ký bị bó hẹp và khó khăn hơn. Tuy vậy, kết quả thẩm định cho thấy 
HPLC có độ nhạy tốt hơn so với CE. Giá trị LOD và LOQ của phương 
pháp HPLC nhỏ hơn khoảng 50 – 70 lần so với phương pháp CE. Sở dĩ 
phương pháp CE có độ nhạy thấp hơn là do đầu dò có thể tích nhỏ, 
quang lộ ngắn (bằng với đường kính trong của cột mao quản) và thể tích 
tiêm mẫu ít hơn. Do vậy để xác định tạp R-ATN trong nguyên liệu hay 
chế phẩm S-ATN thì phương pháp HPLC nên là sự lựa chọn hàng đầu. 
Phương pháp CE nghiên cứu trong luận án có thời gian phân tích 
được rút ngắn từ 2 – 4 lần so với các phương pháp CE phân tích ATN và 
các ĐPĐQ của một số tác giả đã công bố. Mặc dù, thời gian phân tích 
rút ngắn, nhưng độ phân giải giữa các đồng phân S- và R-ATN vẫn 
tương đương với các phương pháp đã công bố và đạt yêu cầu của phép 
thử định lượng quy định trong dược điển. Thời gian một lần phân tích 
ngắn tạo nhiều thuận lợi và kinh tế cho công tác kiểm tra giám sát chất 
lượng thuốc trên thực tế. 
Phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN nghiên cứu 
trong luận án, có thời gian phân tích ngắn (7,5 phút), độ phân giải độ 
phân giải giữa các đồng phân lớn (Rs > 5) và LOQ nhỏ (0,273 µg/ml). 
So với một số phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN 
trong chế phẩm thuốc đã được công bố, phương pháp HPLC nghiên cứu 
trong luận án có thời gian phân tích ngắn hơn khoảng 1,5 – 4 lần; Rs lớn 
hơn 1,5 – 2,5 lần và LOD, LOQ nhỏ hơn khoảng 4 – 50 lần. Với giá trị 
LOQ nhỏ, phương pháp HPLC đã nghiên cứu phù hợp để xác định hàm 
lượng tạp chất R-ATN có trong các mẫu nguyên liệu và thuốc S-ATN. 
4.2. Phân tích ATN và ĐPĐQ trong huyết tương bằng LC-MS/MS 
 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương: Có vai trò quan trọng trong 
phương pháp LC-MS/MS. Xử lý mẫu HT giúp loại bỏ tạp chất, loại bỏ 
các tác nhân ảnh hưởng đến quá trình ion hóa hoạt chất cần phân tích ở 
22 
nguồn ESI. Kỹ thuật xử lý mẫu HT bằng kết tủa protein đơn giản, hiệu 
suất thu hồi ATN khá cao (60–70%) song không loại bỏ được các tác 
nhân gây ảnh hưởng nền mẫu. ATN là một base yếu (pKa = 9,6), độ tan 
trong các dung môi hữu cơ không phân cực tăng khi pH dung dịch mẫu 
tăng nên có thể chiết ATN trong HT bằng dung môi hữu cơ không phân 
cực sau khi kiềm hóa mẫu. So với SPE, chiết lỏng–lỏng vẫn có tỷ lệ thu 
hồi ATN cao (> 80%) và cũng không gây ảnh hưởng nền mẫu khi phân 
tích MS/MS nhưng lại đơn giản hơn; không đòi hỏi trang thiết bị đặc 
biệt; dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm, mang lại hiệu quả 
kinh tế cao khi áp dụng trong các nghiên cứu phải phân tích một số 
lượng lớn các mẫu như các nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH. 
 Về phương pháp LC-MS/MS phân tích ATN trong HT: 
So với các phương pháp HPLC định lượng thuốc trong dịch sinh học sử 
dụng các đầu dò thông thường như DAD, huỳnh quang, ECD hoặc đo 
độ dẫn... phương pháp LC-MS/MS định lượng thuốc trong dịch sinh học 
có độ đặc hiệu-chọn lọc và đặc biệt là độ nhạy, giới hạn định lượng tốt 
hơn nhiều lần. Sở dĩ phương pháp LC-MS/MS có độ đặc hiệu-chọn lọc 
và độ nhạy tốt là do phương pháp kết hợp các ưu thế của phương pháp 
HPLC và phương pháp MS/MS. 
 Các phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN và các ĐPĐQ trong 
HT nghiên cứu trong luận án đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các 
yêu cầu đối với PPPT thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA. 
So với các phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong 
HT đã công bố của một số tác giả, phương pháp LC-MS/MS định lượng 
ATN toàn phần nghiên cứu trong luận án có giá trị LOQ và LLOQ thấp 
hơn từ 5 – 10 lần. Đồng thời do sử dụng cột sắc ký có kích thước hạt 
nhồi nhỏ (1,8 µm) và hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) nên 
phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu trong 
luận án có thời gian phân tích một mẫu rất ngắn (chỉ 2,5 phút), ngắn hơn 
nhiều so với các phương pháp đã được công bố. Thời gian phân tích 
ngắn phù hợp cho ứng dụng cần phân tích một số lượng lớn mẫu như 
các nghiên cứu SKD và TĐSH. 
 Để phân tích các ĐPĐQ cuả ATN trong dịch sinh học, các tác giả 
thường sử dụng phương pháp HPLC với đầu dò UV hoặc huỳnh quang. 
23 
Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phân tích các ĐPĐQ của ATN trong 
HT bằng phương pháp LC-MS/MS nào được công bố. Phương pháp LC-
MS/MS phân tích các ĐPĐQ của ATN nghiên cứu trong luận án được 
có thời gian phân tích ngắn hơn, độ phân giải giữa các pic đồng phân 
lớn (Rs > 5) và giá trị LOQ nhỏ hơn nhiều so với các phương pháp 
HPLC định lượng ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học đã công bố. 
 Kết quả kiểm tra chất lượng và nghiên cứu SKD các thuốc ATN: 
Kết quả xác định hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN trong 4 mẫu 
thuốc viên nén S-ATN cho thấy chỉ tiêu giới hạn tạp chất của các thuốc 
S-ATN đang lưu hành không giống nhau. Do vậy, cần thiết phải đánh 
giá hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN bằng PPPT thích hợp. 
 Cho đến nay, mới chỉ có các nghiên cứu SKD, TĐSH của ATN toàn 
phần được công bố. Các số liệu SKD và DĐH của S- và R-ATN trên 
NTN chưa từng được công bố. Kết quả nghiên cứu SKD, TĐSH một số 
thuốc ATN đang lưu hành cho thấy SKD của S- và R-ATN ở NTN Việt 
Nam là tương tự nhau, không có sự dịch giữa các dạng ĐPĐQ trên lâm 
sàng. SKD của S-ATN ở các thuốc chỉ chứa một thành phần đối quang 
có xu hướng cao hơn so với thuốc racemic. Thuốc ATN racemic do Việt 
Nam sản xuất nhiều khả năng TĐSH với thuốc biệt dược gốc và các 
thuốc S-ATN đang lưu hành trên thị trường nhiều khả năng không 
TĐSH. Do vậy, để đảm bảo chất lượng, hiệu quả điều trị cần thiết phải 
triển khai các nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH các thuốc bằng các 
phương pháp phân tích ĐPĐQ trong dịch sinh học phù hợp. 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được kết quả: 
1. Đã xây dựng được các phương pháp HPLC, CE định lượng các 
ĐPĐQ của ATN trong một số chế phẩm thuốc: 
 Phương pháp HPLC: Phân tách các ĐPĐQ bằng cột sắc ký chứa pha 
tĩnh đối quang cellobiohydrolyse. 
 Phương pháp CE: Phân tách các ĐPĐQ trên cột mao quản silica 
nung chảy với dung dịch điện ly nền chứa CM-β-CD 8mM. 
Phương pháp HPLC có giới hạn định lượng nhỏ (0,27 ng/ml) phù hợp 
để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN có trong các mẫu 
thuốc và nguyên liệu S-ATN ở mức giới hạn nhỏ hơn 0,1%. 
24 
2. Đã xây dựng được hai phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN 
và các ĐPĐQ trong HT người: 
Các phương pháp có chung quy trình xử lý mẫu HT, chiết ATN bằng 
cloroform sau khi đã kiềm hóa mẫu. Phân tích ATN toàn phần trong 
dịch chiết bằng HPLC với cột pha đảo còn phân tích các ĐPĐQ trong 
dịch chiết bằng phương pháp HPLC với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối 
quang cellobiohydrolyse. Xác định nồng độ ATN hoặc các ĐPĐQ trong 
dịch rửa giải sắc ký bằng phương pháp MS/MS với nguồn ESI (+). Các 
phương pháp LC-MS/MS đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các yêu 
cầu của Mỹ, châu Âu đối với một PPPT thuốc trong dịch sinh học. 
3. Đã ứng dụng các PPPT kiểm tra chất lượng và nghiên cứu SKD, 
TĐSH một số chế phẩm thuốc ATN: 
- Phân tích xác định hàm lượng ATN và các ĐPĐQ trong 08 mẫu thuốc 
bằng HPLC và CE. Các phương pháp có độ đúng, độ chính xác tương 
đương nhau. Các mẫu thuốc đạt yêu cầu hàm lượng. 
- Phân tích xác định hàm lượng tạp R-ATN trong 04 mẫu chế phẩm 
thuốc S-ATN bằng phương pháp HPLC. Một mẫu thuốc S-ATN có giới 
hạn tạp chất R-ATN vượt quá mức giới hạn chung 2,0%. 
- Áp dụng phương pháp HPLC định lượng ATN và các ĐPĐQ hòa tan 
trong nghiên cứu so sánh độ hòa tan in vitro các thuốc ATN. Bốn mẫu 
thuốc có độ hòa tan in vitro tương đương nhau. 
- Phân tích LC-MS/MS xác định nồng độ các ĐPĐQ của ATN trong 23 
mẫu HT bệnh nhân và 504 mẫu HT của 18 NTN. S- và R-ATN có SKD 
tương tự nhau và không có sự chuyển dạng giữa các đồng phân. SKD 
thuốc S-ATN trên NTN có khác biệt về Cmax, AUC so với thuốc ATN 
racemic. Hai thuốc ATN racemic có Cmax, Tmax, AUC tương tự nhau còn 
hai thuốc S-ATN có Cmax, AUC không giống nhau. 
KIẾN NGHỊ 
Để đảm bảo và nâng cao chất lượng các thuốc chứa dược chất ĐPĐQ 
nói chung và ATN nói riêng đang lưu hành trên thị trường, chúng tôi có 
một số kiến nghị sau: 
1) Kiểm tra giới hạn tạp R-ATN đối với các thuốc S-ATN. 
2) Nghiên cứu đánh giá TĐSH các thuốc S-ATN; ATN racemic và so 
sánh SKD các thuốc S-ATN với thuốc biệt dược gốc ATN racemic.
 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA 
TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 
1. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn 
Thị Kiều Anh (2013), “Nghiên cứu tách các đồng phân quang học 
của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh 
đối quang”, Tạp chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 
6/2013, tr. 218 - 224. 
2. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, 
Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Bước đầu nghiên cứu định lượng 
đồng phân đối quang của atenolol bằng phương pháp điện di mao 
quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 11, số 42, tr. 14 - 19. 
3. Tạ Mạnh Hùng, Phan Thị Nghĩa, Trịnh Văn Lẩu (2014), “Nghiên 
cứu định lượng atenolol trong huyết tương người bằng phương 
pháp sắc ký lỏng khối phổ”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 12, 
số 44, tr. 2 - 7. 
4. Tạ Mạnh Hùng, Ngô Minh Thúy, Vũ Ngân Bình, Lê Thị Hồng 
Hảo, Nguyễn Thị Kiều Anh (2014), “Nghiên cứu định lượng 
đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản”, Tạp 
chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 6/2014, tr. 212 - 217. 
5. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2015), 
“Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang học của 
atenolol trong một số chế phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC-
DAD”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 13, số 49, tr. 16 - 23. 
6. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), 
“Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang học của 
atenolol trong huyết tương người bằng phương pháp LC-
MS/MS”. Tạp chí Dược học, số 482, tr. 56 - 60.