Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phẫu thuật ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên thỏ thực nghiệm

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
Đặt vấn đề
Bề mặt nhãn cầu (BMNC) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ nhãn cầu chống lại các tác nhân gây bệnh, đảm bảo cho giác mạc (GM) trong suốt và duy trì chức năng thị giác. Rối loạn BMNC nặng do suy giảm toàn bộ tế bào gốc vùng rìa là một trong những thách thức đối với các nhà nhãn khoa bởi mức độ khó khăn trong điều trị và tiên lượng. Biểu hiện rối loạn BMNC là xâm lấn biểu mô kết mạc, tổ chức xơ và tân mạch vào GM gây giảm thị lực trầm trọng, thường kèm theo các dấu hiệu kích thích cơ năng ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống của người bệnh.
Phẫu thuật ghép tế bào gốc tự thân từ tế bào gốc vùng rìa của mắt lành để điều trị cho bệnh nhân có rối loạn BMNC ở 1 mắt là phương pháp tối ưu đã được áp dụng thành công trên thế giới cũng như ở Việt nam. Tuy nhiên không thể áp dụng được phương pháp này với các bệnh nhân bị bệnh ở cả 2 mắt do không còn tế bào gốc. Mặt khác, phương pháp ghép tế bào gốc dị thân đòi hỏi phối hợp thuốc ức chế miễn dịch toàn thân kéo dài để chống thải ghép, nguy cơ tổn hại chức năng gan thận, nhiễm trùng toàn thân và tại chỗ, do đó còn hạn chế trong việc áp dụng.
Cùng với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào, việc sử dụng tế bào biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy làm nguồn cung cấp biểu mô cho việc kiến tạo BMNC là giải pháp mới cho điều trị bệnh nhân có rối loạn BMNC ở cả 2 mắt, phương pháp này đã được áp dụng thành công ở nhiều nước phát triển. 
Với mong muốn áp dụng phương pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị cho các bệnh nhân bị rối loạn BMNC ở 2 mắt ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
Nghiên cứu phẫu thuật ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên thỏ thực nghiệm. 
Đánh giá kết quả bước đầu của phẫu thuật ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên bệnh nhân rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt. 
Tính cấp thiết của đề tài
Rối loạn nặng BMNC do suy giảm toàn bộ tế bào gốc vùng rìa cho tới nay vẫn là thách thức trong nhãn khoa do điều trị và tiên lượng còn rất khó khăn. Các bệnh nhân bị suy giảm toàn bộ tế bào gốc ở 2 mắt nằm trong tình trạng gần như mù lòa do thị lực rất thấp, điều trị ghép tế bào gốc dị thân còn nhiều hạn chế do thải loại miễn dịch và nguy cơ do dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài. Do đó việc nghiên cứu phương pháp mới để điều trị hiệu quả bệnh lý này là rất cần thiết. Nhờ sự phát triển của công nghệ tế bào gốc, việc sử dụng biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy làm nguồn cung cấp biểu mô cho việc kiến tạo BMNC là giải pháp mới cho điều trị bệnh nhân có rối loạn BMNC ở cả 2 mắt.
Những đóng góp mới của luận án
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn nặng BMNC 2 mắt, nghiên cứu trên thực nghiệm và ứng dụng trên bệnh nhân. Với thời gian theo dõi dài nhất sau phẫu thuật đến 62 tháng , nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả và độ an toàn của phương pháp trong việc kiến tạo BMNC ổn định, giảm viêm, giảm tân mạch GM, chứng minh tấm biểu mô tồn tại lâu dài và gắn với mô nền GM sau khi ghép.
Nghiên cứu đã cho thấy ưu việt của việc kết hợp nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng. Thành công từ nghiên cứu thực nghiệm là cơ sở khoa học của việc ứng dụng phẫu thuật này trong việc điều trị cho bệnh nhân. Đồng thời nghiên cứu thực nghiệm giúp định hướng, rút kinh nghiệm và hoàn thiện các bước nghiên cứu khi áp dụng trên lâm sàng 
Bố cục luận án
Luận án gồm 101 trang: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (34 trang), Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (10 trang), Kết quả (25 trang), Bàn luận (27 trang), và Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang). 
Trong luận án có 5 bảng, 1 biểu đồ, 32 hình, phụ lục. Có 115 tài liệu tham khảo, trong đó 3 tiếng Việt, 112 tiếng Anh.
Chương 1. TỔNG QUAN
Cấu tạo và chức năng của bề mặt nhãn cầu và các yếu tố liên quan
BMNC được duy trì sự ổn định nhờ sự toàn vẹn về giải phẫu và chức năng sinh lý của các yếu tố có liên quan bao gồm mi mắt, phim nước mắt, biểu mô của kết mạc, giác mạc và vùng rìa. 
Mi mắt: có vai trò bảo vệ nhãn cầu, dàn đều phim nước mắt
Phim nước mắt: từ ngoài vào gồm 3 lớp lipid, nước, mucin. Phim nước mắt có tác dụng bôi trơn, cung cấp chất dinh dưỡng, duy trì áp suất thẩm thấu, ổn định khúc xạ bề mặt của giác mạc
Biểu mô kết mạc (KM): chứa các vi nhung mao giúp gắn kết glycocalyx, tế bào đài chế tiết mucin, tuyến lệ phụ tiết nước, lớp đệm chứa lympho bào.
Biểu mô vùng rìa: chứa tế bào gốc là thành phần quan trọng có vai trò tăng sinh và biệt hóa biểu mô, ngăn chặn kết mạc xâm nhập vào giác mạc
Biểu mô giác mạc (GM): gồm 5-7 hàng tế bào lát tầng không sừng hóa, trong suốt. Trong đó: lớp tế bào bề mặt biệt hóa cao, chứa nhiều vi nhung mao gắn mucin, lớp đáy hình trụ đơn có khả năng phân chia, màng đáy giúp biểu mô di cư, phân tầng trật tự và liên tục
Rối loạn bề mặt nhãn cầu
Chẩn đoán lâm sàng rối loạn BMNC
Mất ổn định BMNC biểu hiện tùy theo mức độ tổn hại tế bào gốc. Khi toàn bộ tế bào gốc tổn thương sẽ xuất hiện rối loạn nặng BMNC.
Cơ năng: giảm thị lực, sợ ánh sáng, chảy nước mắt, co quắp mi và tiển sử viêm mạn tính ở mắt
Thực thể 
Rối loạn mi, tuyến Meibomius, khô mắt
Hiện tượng “kết mạc hóa giác mạc”, mất cấu trúc giải phẫu của vùng rìa
Biểu mô GM không đều, có thể xuất hiện tróc biểu mô tái phát, hoặc khuyết biểu mô dai dẳng, đôi khi nhuyễn hoại tử GM
Tân mạch và sẹo đục GM
Giai đoạn muộn có thể xuất hiện sừng hóa BMNC
Chẩn đoán cận lâm sàng
Có vai trò hỗ trợ chẩn đoán và xác định các mức độ tổn thương của bệnh
Test áp tế bào, sinh thiết KM, chất nạo BMNC
Đo liềm nước mắt, đo áp suất thẩm thấu của phim nước mắt bằng máy giao thoa
Chụp Meibography, soi hiển vi đồng tiêu cự
Test nhanh xác định dấu ấn của phản ứng viêm
Máy đo cảm giác GM
Các nguyên nhân gây rối loạn BMNC
Viêm bờ mi kéo dài
Khô mắt nặng
Viêm kết mạc dị ứng
Mộng và tân sản biểu mô BMNC
Rối loạn dính kết biểu mô
Bỏng hóa chất hoặc bỏng nhiệt
Tổn hại tế bào gốc bẩm sinh: dị tật không có mống mắt, loạn dưỡng GM dạng giọt gelatin, viêm GM kèm thiểu năng nội tiết, củng mạc hóa GM
Rối loạn BMNC do các bệnh tự miễn: pemphigoid, dị ứng thuốc, viêm khớp dạng thấp
Tổn hại tế bào gốc do liên quan đến điều trị (do 1 số thuốc hoặc phẫu thuật nhiều lần ở vùng rìa).
Phân loại các mức độ tổn thương BMNC
Bảng 1.1. Phân loại các mức độ tổn thương BMNC
KM bình thường
(mức “a”)
KM viêm cũ đã hết
(mức “b”)
KM đang viêm
(mức “c”)
Thiếu hụt 1 phần tế bào gốc (mức I-nhẹ)
Bệnh GM do KTX, suy giảm tế bào gốc có liên quan điều trị, tăng sản nội BM (Ia)
Bỏng cũ (Ib)
Dị ứng thuốc hoặc pemphigoid nhẹ, bỏng mới (Ic)
Thiếu hụt toàn bộ tế bào gốc (mức II-nặng)
Dị tật không có MM, bệnh GM do KTX nặng, suy giảm tế bào gốc có liên quan điều trị (IIa)
Bỏng cũ nặng (IIb)
Dị ứng thuốc hoặc pemphigoid nặng, bỏng mới nặng (IIc)
Mức độ suy giảm tế bào gốc vùng rìa và tình trạng viêm KM đóng vai trò quan trọng nhất trong việc xác định mức độ tổn thương BMNC, từ đó quyết định chiến lược điều trị và tiên lượng bệnh.
Điều trị rối loạn BMNC
Nội khoa: điều trị tại mắt và toàn thân, bao gồm kiểm soát tình trạng viêm, tăng cường dinh dưỡng thúc đẩy hàn gắn biểu mô. Điều trị nội khoa làm cải thiện tình trạng BMNC, duy trì, tăng hiệu quả phẫu thuật, tránh phẫu thuật không cần thiết 
Kính tiếp xúc (KTX): có tác dụng giảm đau, tăng liền biểu mô trong 1 số trường hợp tróc biểu mô tái phát, khuyết biểu mô dai dẳng. 
Phẫu thuật bảo vệ BMNC: nạo biểu mô, gọt GM, đóng điểm lệ, cò mi áp dụng trong 1 số trường hợp 
Phẫu thuật kiến tạo BMNC: Các bệnh nhân có tổn hại trầm trọng tế bào gốc khi đã điều trị nội khoa qua giai đoạn viêm cấp, tùy mức độ tổn thương có thể lựa chọn loại phẫu thuật kiến tạo BMNC phù hợp. 
Ghép màng ối áp dụng trong trường hợp cần che phủ hoặc hàn gắn bề mặt như tách dính mi cầu, loét khó hàn gắn, bỏng cấp, dị ứng thuốc cấp. Nhược điểm là do chỉ là chất nền ko thay thế được biểu mô, vì vậy quá trình biểu mô hóa khó khăn, dễ bị xâm nhập xơ mạch vào GM.
Ghép tự thân KM rìa (CLAU) hoặc tấm biểu mô GM vùng rìa nuôi cấy từ mắt lành (Auto-CLET) là phương pháp cho hiệu quả cao và an toàn nhưng chỉ áp dụng được cho những bệnh nhân bị rối loạn BMNC ở 1 mắt 
Với bệnh nhân bị rối loạn BMNC nặng do suy giảm tế bào gốc ở 2 mắt, có thể ghép KM rìa(Lr-CLAL)/ tấm biểu mô vùng rìa nuôi cấy đồng loài (Lr-CLET) từ người đồng huyết thống hoặc từ vành GM hiến (KLAL), phương pháp này còn nhiều khó khăn do vấn đề thải loại miễn dịch và nguy cơ do dùng thuốc ức chế miễn dịch toàn thân kéo dài 
Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy và ứng dụng trong điều trị rối loạn BMNC
Cấu trúc biểu mô niêm mạc miệng: các nghiên cứu mô học chỉ ra rằng niêm mạc miệng có nguồn gốc từ ngoại bì, lát tầng không sừng hóa, lớp đáy có khả năng phân chia, tế bào gốc nằm ở lớp đáy (đỉnh nhú chân bì).
Các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy 
Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ nuôi cấy tế bào và ứng dụng thành tựu của y học tái tạo cho phép nuôi tạo tấm biểu mô từ biểu mô niêm mạc miệng. Tấm biểu mô nuôi cấy có cấu trúc mô học, chức năng tương đồng với biểu mô GM.
Ứng dụng của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trong điều trị rối loạn BMNC: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trên thực nghiệm cũng như trên bệnh nhân về ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị rối loạn BMNC hai mắt (COMET).
Nakamura (2003), Hayashida (2005) thành công trên thỏ gây bỏng. 
Nishida (2004), Inatomi (2006), Chen (2009), Nakamura (2011), Satake (2011), Kocaba (2014) đã thực hiện thành công trên bệnh nhân, thời gian theo dõi 14 đến 55 tháng, với cỡ mẫu 4 – 40 ca. 
Kết quả chung: Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy có khả năng tồn tại và giúp duy trì ổn định BMNC sau thời gian khá dài, là giải pháp an toàn, hiệu quả cho điều trị bệnh lý rối loạn BMNC nặng ở 2 mắt. 
Chương 2 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu 
Nghiên cứu thực nghiệm: 15 thỏ khỏe, 2 ± 0.2 kg, nuôi cùng điều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Mô – phôi, Đại học Y Hà Nội
Nghiên cứu trên bệnh nhân: 12 bệnh nhân rối loạn BMNC nặng 2 mắt điều trị tại khoa Kết giác mạc – Bệnh viện Mắt Trung Ương 1/2009 - 6/2014.
Tiêu chuẩn lựa chọn: suy giảm toàn bộ tế bào gốc 2 mắt, xơ mạch GM toàn bộ, không nhiễm trùng, đã qua giai đoạn viêm cấp.
Tiêu chuẩn loại trừ: Bất thường mi, khô mắt nặng đến mức sừng hóa BMNC, không hợp tác nghiên cứu. 
Phương pháp nghiên cứu 
Nghiên cứu thực nghiệm: 15 thỏ chia 5 lô ngẫu nhiên 
Thiết kế: Nghiên cứu thực nghiệm, thực hiện tại Bộ môn Mô phôi - ĐHYHN.
Các bước:
Gây bỏng mắt thỏ 
Sau 2 tuần sinh thiết niêm mạc miệng thỏ (đường kính 3mm), nuôi tạo 2 tấm biểu mô 
1 tấm định danh, 1 tấm ghép tự thân cho thỏ 
Đánh giá đại thể, vi thể GM thỏ sau mổ: 7, 15, 30, 60, 180 ngày 
Nghiên cứu trên bệnh nhân:
Thiết kế: thử nghiệm lâm sàng, tiến cứu, thực hiện tại Bệnh viện Mắt TW
Các bước:
Đánh giá bệnh nhân trước mổ: mức độ kích thích cơ năng, thị lực, nhãn áp, tình trạng BMNC. Điều trị trước mổ: chống viêm, dinh dưỡng, điều trị mi, phẫu thuật tách dính
Sinh thiết niêm mạc miệng (3mm), nuôi tạo 2 tấm biểu mô
1 tấm định danh, 1 tấm ghép tự thân cho bệnh nhân
Đánh giá tình trạng mắt sau phẫu thuật: 2 ngày/lần trong 2 tuần đầu, hàng tuần trong 1 tháng, 2 tuần/ lần trong 2 tháng, sau đó 1 tháng/ lần.
Tiêu chí đánh giá chất lượng tấm biểu mô nuôi cấy: Các tiêu chí về đại thể, cấu trúc vi thể và siêu vi của tấm biểu mô
Tiêu chí đánh giá kết quả phẫu thuật: Cải thiện triệu trứng cơ năng, thị lực, tình trạng biểu mô BMNC 
Thu thập và phân tích số liệu 
	Mẫu bệnh án, ảnh chụp tổn thương GM và BMNC, hình ảnh lâm sàng và mô học, video phẫu thuật.
Gây bỏng cho thỏ
Mô hình nghiên cứu
Thực nghiệm
2 tuần
4 tuần
Ghép tự thân cho thỏ
Nuôi tạo tấm BM
2 tuần
Đánh giá mắt thỏ
Thực nghiệm thành công
Nuôi tạo tấm BM cho BN
Lâm sàng
2-3 tuần
Ghép tự thân tấm BM cho BN
Đánh giá mắt BN 
sau ghép
Đạo đức nghiên cứu 
Là 1 phần nội dung Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu quy trình sử dụng tế bào gốc để điều trị một số bệnh của bề mặt nhãn cầu”, mã số ĐTĐL.2010T/15 thuộc Bộ môn Mô-phôi ĐHYHN, đã được Hội đồng đạo đức của trường ĐHYHN chấp thuận (số 77/HĐĐĐ – YHN).
Chương 3. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả trên thỏ thực nghiệm 
Đặc điểm thỏ thực nghiệm: cả 15 thỏ đều sống trong suốt quá trình nghiên cứu.
Kết quả định danh tấm biểu mô nuôi cấy 
Hình ảnh mô học: Tấm biểu mô phẳng, có 4-5 hàng tế bào đa diện đều nhau, lớp đáy hình trụ nhân lớn, bào quan phát triển, các lớp trên dẹt dần, lớp trên cùng vẫn còn nhân, bề mặt chứa nhiều vi nhung mao. Các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết, liên kết với màng ối bằng thể bán liên kết. 
Hóa mô miễn dịch: hiện diện p63 ở nhân lớp đáy, K3 ở lớp trên, không có tế bào đài.
Kết quả ghép tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm
Lâm sàng: 14/15 thỏ có tấm biểu mô áp tốt, trong, BMNC nhẵn, không có tân mạch GM; 1 thỏ có tân mạch vào 1 phần chu biên GM.
Mô học GM thỏ: Sau 6 tháng, tấm biểu mô tồn tại nguyên vẹn, áp chặt nhu mô, tế bào sắp xếp đều đặn, lớp trên cùng còn nhân, không sừng hóa. 
 Hình 3.11. Mắt thỏ có kết quả phẫu thuật tốt sau 180 ngày
Hình đại thể của mắt thỏ: GM trong, Fluorescein (-)
Cấu trúc vi thể của GM thỏ (nhuộm H.E.): 1. Lớp biểu mô lát tầng gồm 4-5 hàng tế bào, áp chặt vào nhu mô; 2. Lớp nhu mô không có thâm nhiễm tế bào viêm. 
Kết quả trên bệnh nhân 
Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 
Tuổi trung bình: 26,2 tuổi (12 – 57 tuổi)
Thị lực xa: 95% < ĐNT 1m; thị lực gần (-)
Nguyên nhân bệnh: 3 bệnh nhân loạn dưỡng GM giọt gelatin và 9 bệnh nhân bỏng hóa chất 2 mắt. 
Tổng số 20 lượt phẫu thuật, thực hiện ở 17 mắt của 12 bệnh nhân (10 nam, 2 nữ), trong đó 5 bệnh nhân được mổ 2 mắt, 3 mắt được mổ 2 lần. 
Thời gian theo dõi trung bình: 18,95 tháng (12 – 62 tháng)
Kết quả định danh tấm biểu mô nuôi cấy 
Mô học: 4-5 hàng tế bào đa diện lát tầng. Lớp đáy nhân lớn, bào quan phát triển, lớp trên dẹt dần, lớp trên cùng vẫn còn nhân, nhiều vi nhung mao ngắn bề mặt. Có thể liên kết giữa các tế bào, thể bán liên kết giữa tế bào và giá đỡ. 
Hóa mô miễn dịch: hiện diện p63 ở nhân lớp đáy, K3 ở lớp trên 
Hình 3.13. Tấm biểu mô niêm mạc miệng BN Nguyễn Hữu C. 
(KHV soi ngược x 250) 
2
1
Hình 3.14. Tấm biểu mô niêm mạc miệng BN Phạm Ngọc T. 
(HE x 500)
1.Biểu mô	2.Màng ối
Kết quả ghép tấm biểu mô trên bệnh nhân 
Sau sinh thiết, niêm mạc miệng liền tốt, sẹo nhỏ và mịn. Không có biến chứng trong và sau quá trình sinh thiết.
Không có biến chứng trong và sau phẫu thuật ghép tấm biểu mô.
Tỷ lệ thành công là 14/20 (70%): Kết quả tốt 6/20 (30%), khá 4/20 (20%), trung bình 4/20 (20%). Tỷ lệ thất bại cho kết quả xấu là 6/20 (30%). 
A B
Hình 3.21. Mắt bệnh nhân có kết quả tốt sau phẫu thuật 3 năm
Trước mổ: biểu mô GM gồ ghề, màng xơ và tân mạch xâm lấn toàn bộ vùng rìa 360 vào đến trung tâm GM.
Sau mổ 3 năm: GM trong, biểu mô nhẵn, không có tân mạch.
Kết quả cải thiện các triệu chứng cơ năng 
Có 12 trường hợp (60%) cải thiện cả 3 triệu trứng cơ năng sau phẫu thuật, bệnh nhân giảm và hết các triệu chứng chói sợ ánh sáng, cảm giác khô mắt, cảm giác đau. Có 1 trường hợp cải thiện 2 triệu chứng, 2 trường hợp cải thiện 1 triệu chứng. Không có trường hợp nào thấy triệu chứng cơ năng nặng hơn. 
Kết quả thị lực 
Nhìn xa: 14/20 ca (70%) thị lực tăng, trong đó 13 ca tăng rõ rệt. 
7/20 ca thị lực tăng trên 2 hàng, thị lực cao nhất là 20/60
Thị lực trước mổ + 2,17, sau mổ +1,415 (logMAR): mức cải thiện – 0,755
9/20 trường hợp cải thiện thị lực gần 
Biểu đồ 3.1. Kết quả thị lực nhìn xa
Diễn biến tình trạng bề mặt nhãn cầu sau phẫu thuật 
Ở các mắt thành công: trong 1 tháng đầu đều có tân mạch nhỏ nằm ở lớp nông dưới biểu mô, chỉ dừng ở quanh rìa hoặc chu biên, thoái triển và rút dần sau 3-6 tháng. 
Kết quả chung của nghiên cứu: phương pháp cho tỷ lệ thành công ở 14/20 trường hợp với thời gian theo dõi trung bình là 18,95 tháng (12-62 tháng), cho tỷ lệ 70%. Ở các trường hợp này, giác mạc trong hơn và trơn nhẵn, giảm tân mạch, bề mặt nhãn cầu ổn định
Biến chứng của phẫu thuật:
Không có biến chứng xảy ra trong suốt quá trình nghiên cứu
Trong quá trình theo dõi không gặp vấn đề về miễn dịch và thuốc ức chế miễn dịch. Thời gian dùng steroid ngắn, không gặp biến chứng do steroid (tăng nhãn áp, bội nhiễm)
Phương pháp được thực hiện lần 2 ở một số bệnh nhân khi lần đầu thất bại, và đều diễn ra an toàn 
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phẫu thuật 
Nguyên nhân bệnh: nhóm loạn dưỡng cho kết quả tốt hơn nhóm bỏng.
Tổn thương phối hợp: các trường hợp có tổn thương biểu mô dai dẳng, tổn thương phối hợp trong nhãn cầu cho kết quả kém.
Quy trình phẫu thuật và chăm sóc sau mổ có ảnh hưởng đến kết quả phẫu thuật.
Chất lượng tấm biểu mô nuôi cấy: các trường hợp tấm biểu mô bị dính chặt vào đáy giếng nuôi cấy và rách khi phẫu thuật cho kết quả xấu.
Chương 4. BÀN LUẬN
Ghép tự thân tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm 
Đặc điểm tấm biểu mô nuôi cấy 
Mô học: tấm biểu mô có hình thái tương đồng với biểu mô GM, lớp trên cùng vẫn còn nhân, thể hiện đặc tính không sừng hóa. Lớp tế bào đáy hình trụ có nhân lớn, bào quan phát triển. Các vi nhung mao giúp tăng diện tích tiếp xúc bề mặt, tăng lưu giữ nước mắt. Thể liên kết gắn kết chặt chẽ giữa các tế bào với nhau tạo nên hàng rào bảo vệ của biểu mô, thể bán liên kết gắn chặt tế bào với giá đỡ giúp tấm biểu mô bám dính tốt.
Hóa mô miễn dịch: Hiện diện p63 ở lớp đáy thể hiện đặc tính tế bào gốc, đảm bảo khả năng tái sinh của biểu mô sau ghép
Kết quả ghép tự thân tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm
Về lâm sàng, tất cả các thỏ đều có GM trong và ổn định sau mổ. Kết quả sinh thiết GM thỏ ở các thời điểm đã xác định tình trạng tấm biểu mô nuôi cấy sau ghép: Sau 6 tháng, tấm biểu mô vẫn tồn tại nguyên vẹn, áp chặt nhu mô, tế bào sắp xếp đều đặn, lớp trên cùng còn nhân, không sừng hóa. Kết quả của chúng tôi tương tự với nghiên cứu của Nakamura (2003) và Hayashida (2005)
Kinh nghiệm thu hoạch từ nghiên cứu thực nghiệm 
Hoàn thiện kỹ năng phẫu thuật, loại bỏ tối đa các yếu tố ảnh hưởng tới sự thành công của phẫu thuật.
Kinh nghiệm khi áp dụng trên lâm sàng: Nghiên cứu trên thỏ thuận lợi hơn do gây bỏng cho thỏ chủ động ở bề mặt: phản ứng viêm ít, không tổn hại phim nước mắt, vì vậy khi áp dụng trên bệnh nhân cần lưu ý bổ sung thuốc dinh dưỡng và chống viêm. Ngoài ra thỏ có mí phụ có tác dụng bảo vệ rất tốt cho BMNC, khi tiến hành phẫu thuật trên bệnh nhân cần sử dụng kính tiếp xúc lâu dài. 
Hình ảnh mô học GM thỏ chứng tỏ sự tồn tại của tấm biểu mô sau ghép qua thời gian.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự các công bố của các tác giả nước ngoài. Nghiên cứu thực nghiệm thành công là minh chứng khoa học cho phương pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy, tạo cơ sở cho việc áp dụng phẫu thuật này cho bệnh nhân 
Kết quả trên bệnh nhân
Vị trí và kích thước vùng sinh thiết: trung tâm niêm mạc má: niêm mạc dày, nhú chân bì rõ, nhân tế bào đáy có độ hiện diện p63 cao. Như vậy niêm mạc vùng má có những đặc điểm thích hợp để nuôi cấy, vì khả năng thu được tế bào gốc ở vùng này cao hơn. Đường kính sinh thiết 3 mm: Sinh thiết không đau, nhanh liền, lấy được nhiều lần. 
Đặc điểm của tấm biểu mô nuôi cấy 
Mô học tương đồng với biểu mô GM, lớp trên cùng vẫn còn nhân, thể hiện đặc tính không sừng hóa. Các vi nhung mao giúp tăng diện tích tiếp xúc bề mặt, làm tăng lưu giữ nước mắt. Thể bán liên kết gắn kết chặt chẽ giữa các tế bào với nhau tạo hàng rào bảo vệ biểu mô, thể bán liên kết gắn chặt tế bào với giá đỡ giúp tấm biểu mô bám dính tốt. Hóa mô miễn dịch: có hiện diện p63 ở nhân lớp đáy thể hiện đặc tính gốc, K3 ở lớp trên thể hiện đặc tính của biểu mô GM biệt hóa. Như vậy tấm biểu mô chứa cả tế bào gốc lẫn tế bào trưởng thành, đảm bảo chức năng giữ ổn định BMNC và khả năng tái sinh bền vững của biểu mô sau ghép qua thời gian. Kết quả này tương tự với:
Madhira (2008): 2-3 hàng tế bào ko sừng hóa, chứa thể liên kết, bán liên kết, có hiện diện p63 ở lớp đáy, K3 ở các lớp trên. 
Sen (2011): Tấm biểu mô lát tầng ko sừng hóa, chứa thể liên kết, bán liên kết. Có hiện diện p63, K3, đặc biệt là các hạt mucin trong tế bào: MUC gắn màng 1,13,15,16, MUC tạo keo 5B,6 , làm cải thiện tình trạng khô mắt. 
Klingbeli (2010): có hiện diện pAkt và PTEN (protein chống ung thư), ko có p53 và MDM2 (protein gây ung thư). Điều này thể hiện độ an toàn và không làm xuất hiện tế bào đột biến khi nuôi cấy. 
Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 
Đối tượng bệnh nhân còn trẻ, tuổi trung bình: 26,2 (12 – 57 tuổi), nhu cầu học tập và lao động cao, có cả 2 mắt cùng bị bệnh, lại có thị lực rất thấp, gần như mù lòa: thị lực xa: 95% < ĐNT 1m; thị lực gần (-) thì việc tìm giải pháp để nâng cao thị lực cho bệnh nhân là rất cần thiết. 
2 nhóm nguyên nhân bệnh chính là loạn dưỡng GM giọt gelatin (3 bệnh nhân) và bỏng hóa chất (9 bệnh nhân): phù hợp với đặc điểm về tuổi bệnh nhân.
Hiệu quả của phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy
Cải thiện các triệu chứng cơ năng: 12/20 ca cải thiện cả 3 triệu chứng, 1 ca cải thiện 2 triệu chứng, 2 ca cải thiện 1 triệu chứng. Kết quả tương tự với Burillon (2012) và Kocaba (2014). Giảm kích thích cơ năng giúp cải thiện chất lượng cuộc sống, giảm phản ứng viêm bề mặt, làm ổn định BMNC. 
Thị lực: tuy không phải là mục tiêu chính trong điều trị rối loạn BMNC nặng, phẫu thuật vẫn có khả năng làm tăng thị lực trong trường hợp bệnh lý tổn thương ở lớp biểu mô và nhu mô nông. Với các trường hợp đục nhu mô sâu, tấm biểu mô có vai trò kiến tạo bề mặt ổn định, giảm tân mạch để tạo thuận lợi cho ghép quang học thì 2 nhằm tăng thị lực. Ở nhóm nghiên cứu của chúng tôi, thị lực nhìn xa được tăng đáng kể, sau mổ có 14 ca tăng thị lực, trong đó 13 ca tăng rõ rệt (đạt tỷ lệ 70%). Có 7 ca tăng trên 2 hàng, thị lực cao nhất là 20/60. Tính theo LogMAR, chúng tôi đã đưa thị lực trung bình từ +2,17 về +1,415, mức cải thiện đạt được là -0,755. Nghiên cứu của Sotozono (2013) và Kocaba (2014) cũng cho kết quả tương tự.
Đặc biệt, có 9 ca cải thiện rõ rệt thị lực nhìn gần. Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng vì đa số bệnh nhân trẻ và nhu cầu học tập lao động cao, quá trình điều trị đưa từ trạng thái gần như mù lòa tới 1 mức thị lực nhất định cho dù ít ỏi cũng làm tăng đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh. 
Diễn biến tình trạng bề mặt nhãn cầu sau phẫu thuật: Ở các mắt thành công: trong 1 tháng đầu đều có tân mạch nhỏ nằm ở lớp nông dưới biểu mô, chỉ dừng ở quanh rìa hoặc chu biên, thoái triển và rút dần sau 3-6 tháng. Kết quả này tương tự với Inatomi (2006), Satake (2011), Nakamura (2011), điều này có thể được giải thích là do biểu mô giác mạc của bệnh nhân sau mổ có nguồn gốc từ niêm mạc miệng nên có thể chứa các yếu tố phát triển nội mạch. 
Tổng hợp và so sánh, kết quả chung của chúng tôi tương đối khả quan so với các tác giả khác trên thế giới với số lượng đủ lớn và thời gian theo dõi tương đối dài. 
Bảng 4.1. Tỷ lệ thành công của các nghiên cứu ghép tấm biểu mô
niêm mạc miệng nuôi cấy
Nghiên cứu
Tỷ lệ thành công
Thời gian theo dõi
Cỡ mẫu
Inatomi (2006)
67%
20 tháng
15
Nakamura (2011)
79%
55 tháng
19
Satake (2011)
64,8% sau 1 năm
59% sau 2 năm
25,5 tháng
40
Burillon (2012)
64%
360 ngày
26
Sotozono (2013)
48%
28,7 tháng
46
Kocaba (2014)
62,5%
28 tháng
26
N T T Thủy (2016)
70%
18,95 tháng
20
Ưu điểm của phương pháp:
Độ an toàn 
Ghép tự thân: không gặp vấn đề về miễn dịch, không cần dùng thuốc ức chế miễn dịch. Thời gian dùng corticoid ngắn hơn, giảm biến chứng (tăng nhãn áp, bội nhiễm)
Nguồn nguyên liệu dồi dào, diện sinh thiết nhỏ, phẫu thuật thực hiện đơn thuần ở lớp bề mặt: ít xâm lấn và dễ thực hiện. Như vậy đây là phương pháp an toàn, có thể nhắc lại 
Khả năng tồn tại của tấm biểu mô sau ghép 
Trong nghiên cứu có 14 trường hợp BMNC vẫn ổn định, ko bị tân mạch và KM xâm nhập đến thời điểm cuối cùng 12-62 tháng. điều này chứng tỏ sự hiện diện của tế bào gốc trong biểu mô GM sau ghép, do đó biểu mô GM được tiếp tục tự đổi mới 1 cách hằng định qua thời gian dài, tránh được KM hoá, điều này cũng phù hợp với kết quả định danh tấm biểu mô bằng hóa mô miễn dịch thấy có sự hiện diện của p63, thể hiện đặc tính của tế bào gốc trong tấm biểu mô. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh sự tồn tại lâu dài của biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy sau ghép: Chen (2009) sau 10-22 tháng, Kocaba (2014) sau 28 tháng: định danh mảnh GM sau phẫu thuật khi ghép GM quang học thì 2: tấm biểu mô vẫn tồn tại nguyên vẹn, có hiện diện p63
Nhược điểm của phương pháp:
Tân mạch rìa GM sau ghép: do hoạt động của yếu tố phát triển nội mạch tồn tại trong tấm biểu mô, do vậy ý tưởng phối hợp anti-VEGF với phẫu thuật được một số tác giả đề xuất 
So với tấm biểu mô vùng rìa nuôi cấy thì tấm biểu mô niêm mạc miệng mờ, dầy và kém đồng nhất hơn, có thể là do giá đỡ màng ối và nguồn gốc từ niêm mạc miệng nên các tế bào nuôi cấy có kích thước lớn hơn, sắp xếp kém đồng nhất hơn, gây ra hiện tượng tán xạ ánh sáng, ảnh hưởng đến thị lực. Trong nghiên cứu của Nakamura (2011), Ma (2009), Inatomi (2006), chúng tôi cũng thấy đề cập đến vấn đề này 
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phẫu thuật 
Nguyên nhân bệnh: kết quả nhóm loạn dưỡng tốt hơn nhóm bỏng (do mức độ sâu của tổn thương, tình trạng tổn hại phim nước mắt khác nhau)
Tổn thương phối hợp: tổn thương biểu mô dai dẳng, tổn thương phối hợp trong nhãn cầu có kết quả kém – Satake (2011) cũng cho kết quả tương tự
Quy trình phẫu thuật (gọt nền ghép nhẵn, tránh tổn thương tấm biểu mô trong phẫu thuật) và chăm sóc sau mổ (tra thuốc dinh dưỡng liên tục, kính tiếp xúc kéo dài) giúp tấm biểu mô ổn định tốt.
Chất lượng tấm biểu mô nuôi cấy: mức độ dai và đàn hồi của lớp giá đỡ, khả năng tách rời khỏi đáy giếng khi phẫu thuật đem lại thành công cao hơn 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên 15 thỏ thực nghiệm và 20 lượt phẫu thuật cho 12 bệnh nhân rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt, chúng tôi nhận thấy:
1. Kết quả ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên mắt thỏ thực nghiệm
Đã góp phần nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng thỏ thực nghiệm, tấm biểu mô thu được có đặc điểm hình thái và cấu trúc mô học tương tự biểu mô giác mạc thỏ bình thường.
Đã ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy thành công cho 15 thỏ. Theo dõi đến 6 tháng, có 14 thỏ đạt kết quả tốt, 1 thỏ đạt kết quả khá. Bề mặt giác mạc trong và ổn định, tấm biểu mô vẫn tồn tại nguyên vẹn và gắn chặt với mô nền của giác mạc qua các thời điểm theo dõi.
2. Kết quả ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên bệnh nhân
Đã góp phần nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng trên bệnh nhân, tấm biểu mô thu được có hình thái và cấu trúc siêu vi giống như biểu mô giác mạc bình thường.
Phẫu thuật ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đạt tỷ lệ thành công ở 14/20 trường hợp (tỷ lệ 70%),trong đó 6/14 ca tốt, 4/14 ca khá, 4/14 ca trung bình. Việc ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy có tác dụng kiến tạo bề mặt nhãn cầu ổn định cho các bệnh nhân suy giảm tế bào gốc cả 2 mắt, làm giảm viêm và giảm tân mạch giác mạc.
Ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đã cải thiện cả 3 dấu hiệu cơ năng ở 12/20 trường hợp (60%), cải thiện thị lực nhìn xa cho 13/20 trường hợp (65%), trong đó 9/20 trường hợp (45%) có cải thiện rõ rệt thị lực nhìn gần.
Trong các nhóm nguyên nhân gây bệnh, nhóm bỏng hóa chất cho kết quả kém hơn so với nhóm loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin. Ngoài ra các tổn thương biểu mô dai dẳng trước mổ và các tổn thương sâu trong nhãn cầu là yếu tố tiên lượng xấu đến kết quả điều trị.
Chất lượng của tấm biểu mô (mức độ dai, khả năng bóc tách khỏi đáy giếng nuôi cấy) cũng có ảnh hưởng đến kết quả phẫu thuật.
Sử dụng kính tiếp xúc và thuốc dinh dưỡng giác mạc liên tục trong thời gian đầu sau mổ có tác dụng giúp cho tấm biểu mô nuôi cấy bám dính và ổn định tốt trên bề mặt giác mạc.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu với số lượng bệnh nhân lớn hơn và thời gian theo dõi dài hơn để đánh giá chính xác hơn hiệu quả của phương pháp
Phối hợp với labo nuôi cấy để tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy và xây dựng tiêu chuẩn của tấm biểu mô tốt nhất, phù hợp với điều kiện Việt Nam. 
Nghiên cứu phối hợp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy với sử dụng thuốc ức chế phát triển nội mạch (anti-VEGF) với các đối tượng nguy cơ cao và đánh giá kết quả.