Ứng dụng ssr (simple sequence repeats) để cải thiện tính kháng đạo ôn trên lúa

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
1 
ỨNG DỤNG SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) ĐỂ CẢI THIỆN 
TÍNH KHÁNG ĐẠO ÔN TRÊN LÚA 
Trần Vũ Hải1, Nguyễn Thị Phong Lan1, Phạm Ngọc Tú1 
1 Viện Lúa ĐBSCL 
TÓM TẮT 
Bệnh đạo ôn trên lúa là một trong những bệnh rất nghiêm trọng và thiệt hại lớn đến năng suất 
trên thế giới. Nhiều tài liệu đã chứng minh việc sử dụng các giống lúa kháng sẽ là cách hiệu quả nhất 
để kiểm soát bệnh này. Do đó, việc khai thác hiệu quả các gen kháng là nền tảng quan trọng trong 
chọn tạo giống lúa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định sự hiện diện của gen Piz và Pik-m bằng 
cách sử dụng phương pháp SSR (simple sequence repeat) với marker liên kết với gen Piz và Pik-m là 
RM3431 và RM1144. Kết quả thu được 5 cá thể có nguồn gốc từ OM6976 đã được kiểm chứng với sự 
hiện diện của hai gen Piz + Pik-m 
Từ khóa: Bệnh đạo ôn, gen Piz, gen Pik-m, OM6976 
I. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Bệnh đạo ôn hại lúa là một trong những 
dịch hại quan trọng ở hầu hết các vùng trồng lúa 
trên thế giới. Nấm có khả năng gây hại ở hầu hết 
các giai đoạn của cây lúa từ giai đoạn mạ đến 
chín và là một trong những bệnh gây thiệt hại 
trực tiếp đến năng suất và chất lượng lúa. Năm 
2003, với sự trợ giúp của kỹ thuật sinh học phân 
tử (RFLP, AFLP, CAP, RGA, SSR,) các nhà 
khoa học đã xác định được khoảng 40 gen chủ 
lực kháng bệnh đạo ôn đã được định vị trên bản 
đồ gen (Sallaud và ctv., 2003). Hiện nay, có 100 
gen chủ lực kháng bệnh đạo ôn và khoảng 500 
QTLs được xác định trong bộ gen cây lúa 
(Ashkani và ctv., 2016). 
Ở Việt Nam, nghiên cứu của Lã Tuấn 
Nghĩa và ctv. (2009) đã lai quy tụ gen kháng 
bệnh đạo ôn Pi-1 và Pi-5 vào dòng lúa được 
tạo ra bằng phương pháp đột biến phóng xạ 
bằng tia gama - (60Co) giống lúa Bắc thơm 7. 
Qua nhiều thế hệ chọn lọc đánh giá, dòng NB-
01 có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc 
thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống 
chịu sâu. Nguyễn Thị Lang và ctv. (2009) đã 
tạo ra 6 tổ hợp lai: OM 24/IR 64, IR 24/OM 
2514, C 53/IR 64, C53/OM 2514, OM 
1308/TeTep và IR 36/C53. Trong số đó, có 4 tổ 
hợp lai đã được lập bản đồ bằng cách sử dụng 
marker phân tử. Các gen kháng là di truyền trội 
và nằm trên nhiễm sắc thể 6, 8 và 11. Marker 
SSR (RM 483) đã được sử dụng để phát hiện 
khả năng kháng đạo ôn của 100 giống địa 
phương ở Đồng bằng sông Cửu Long. Ngoài 
ra, một số giống lúa kháng đạo ôn như 
P(OM1), OMP2, OMP4, OMP5 và OMP6 đã 
được báo cáo bởi nhiều nhà khoa học. Đây 
được coi là nguồn vật liệu có giá trị cho gen 
kháng để tạo ra các giống kháng bền vững. 
Tính đa hình ADN của 181 isolates nấm gây 
bệnh đạo ôn ở ĐBSCL được ghi nhận, với 181 
kiểu gen tương ứng với 181 haplotype nấm 
(Dư và Loan, 2009). Trong đó, hai gen Pi-
z,Pik-m có tỷ lệ isolates nấm gây bệnh đạo ôn 
tấn công thấp nhất (Dư và Loan, 2009). Những 
kết quả nghiên cứu nói trên là nguồn tư liệu và 
vật liệu quí cho công tác nghiên cứu và chọn 
tạo giống kháng bệnh đạo ôn. Tuy nhiên, để có 
đủ cơ sở dữ liệu và vật liệu phục vụ chọn tạo 
các giống lúa kháng bệnh đạo ôn đáp ứng yêu 
cầu của thực tế thì cần phải có một nghiên cứu 
toàn diện hơn nữa. 
Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, 
chúng tôi nghiên cứu xác định sự hiện diện của 
gen Piz và Pik-m. bằng cách sử dụng phương 
pháp SSR (simple sequence repeat) với marker 
liên kết Piz và Pik-m. từ giống lúa IRBL 9 và 
IRBL 25 để cải thiện tính kháng đạo ôn cho 
giống lúa OM6976. 
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu nghiên cứu 
- Giống nhận gen: Giống lúa OM6976 
có năng suất cao, phẩm chất gạo tốt, nhiễm 
bệnh đạo ôn 
- Vật liệu cho gen kháng: là dòng đẳng 
gen (NIL) mang gen kháng tương ứng với gen 
Piz và Pik-m. là IRBL 9 và IRBL 25. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
2 
- Chỉ thị liên kết Piz, kích thước 195 (bp) - Chỉ thị liên kết Pik-m, kích thước 245 
(bp) 
Bảng 1. Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR. 
Primers Sequences (5’-3’) Sản phẩm khuếch đại (bp) 
RM3431 (F) 
RM3431 (R) 
AGGGAACATTCTGGAAGACACG 
ACACATTGCGTGTAGTGTGAAGC 
195 
RM 144 (F) 
RM 144 (R) 
TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC 
GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG 
245 
- Một số môi trường nuôi cấy, hóa chất, 
vật dụng thí nghiệm cần thiết khác 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
2.2.1. Lai hồi giao (backcross) và sử dụng chỉ 
thị phân tử để chọn cá thể lúa mang gen (Pi) 
kháng bệnh đạo ôn 
Bảng 2. Sơ đồ lai hồi giao và dùng chỉ thị phân tử chọn gen kháng bệnh đạo ôn 
Thế hệ Nội dung thực hiện 
Sơ đồ lai Sơ đồ lai 
P Lai đơn giữa vật liệu nhận gen 
kháng (vật liệu hồi giao) P1 và vật 
liệu cho gen kháng P2 - mang gen 
Piz và P3 mang gen Pik-m 
P1xP2 P1xP3 
F1 
BC1F1 
Chọn 5 cá thể mang gen kháng 
Piz và Pi k-m 
F1 x P1 
BC1F1 mang gen Piz 
 x P1 
F1 x P1 
BC1F1 mang gen Pik-m 
 x P1 
BC2F1 Lai mỗi bông của mỗi cá thể được 
chọn với P1 thu hạt BC2F1. Chọn 5 
cá thể mang gen kháng Piz và Pik-
m 
BC2F1 mang gen Piz 
 x P1 
BC2F1 mang gen Pik-m 
 x P1 
BC3F1 Lai mỗi bông của mỗi cá thể được 
chọn với P1 thu hạt BC3F1. Chọn 5 
cá thể mang gen kháng Piz và Pik-
m 
 BC3F1 mang gen Piz 
BC3F1 mang gen Pik-m 
 Lai hai cá thể BC3F1 mang gen 
kháng Piz và Pik-m với nhau để
được hạt F1 
 BC3F1 (Piz) x BC3F1 (Pik-m) 
 F1 
 Chọn các cá thể mang hai gen 
đồng hợp tử Piz+Pik-m qua đánh 
giá kiểu gen 
 F2 
 Chọn cá thể thuần kháng bệnh đạo 
ôn và có dạng hình đẹp 
 F3 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
3 
2.2.2. Ly trích DNA 
DNA được ly trích theo phương pháp 
CTAB (Murray và Thompson, 1980) có cải tiến. 
2.2.3. Chạy PCR bằng phương pháp mồi liên 
kết với chỉ thị SSR 
Theo phương pháp của Zheng và ctv. 
(1995). 
2.2.4. Chạy PCR bằng phương pháp mồi liên 
kết với chỉ thị STS 
Theo phương pháp của Li và ctv. (2007). 
2.2.5. Chọn các dòng lúa mang gen kháng 
bệnh đạo ôn dựa vào chỉ thị phân tử 
 Chọn các dòng lúa mang một gen và 
hai gen kháng bệnh đạo ôn dựa vào chỉ thị 
RM3431 liên kết với gen Piz và RM144 liên 
kết với gen Pi km để xác định các cá thể BCnF1 
mang gen kháng Pi z và Pik-m dị hợp tử. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Đánh giá tính đa hình của các chỉ thị 
phân tử giữa bố và mẹ 
Chỉ thị phân tử được xem như cho tính 
đa hình khi có sự khác nhau rõ rệt về kích 
thước của 2 băng bố mẹ, sự khác nhau này 
được đánh giá dựa trên kết quả chạy điện di. 
Kết quả chạy điện di cho thấy ở chỉ thị 
RM 3431 cho tính đa hình giữa 2 bố mẹ 
OM6976 x IRBL9. Ở chỉ thị RM144 cũng cho 
tính đa hình giữa 2 bố mẹ OM6976 và IRBL25 
(Hình 1). 
Hình 1. Tính đa hình giữa bố và mẹ cặp primer RM144 (1, 3:OM6976; 2,4: IRBL25) 
Chọn lọc các dòng hồi giao dựa vào chỉ thị 
phân tử với các dòng lúa mang một gen 
kháng bệnh đạo ôn 
Kết quả lai tạo trong quần thể hồi giao 
BCnF1 xuất hiện hai dạng kiểu gen là kiểu gen 
dị hợp tử kháng (hai băng) và kiểu gen đồng 
hợp tử nhiễm (một băng), kiểu gen dị hợp tử 
kháng ở quần thể BC1F1 sẽ được chọn và chọn 
cá thể càng giống dạng hình của OM 6976 
càng tốt để sử dụng trong chương trình lai hồi 
giao tiếp theo. Ở thế hệ BC2F1 và BC3F1 cũng 
làm tương tự thế hệ BC1F1. 
Hình 2. Kiểu gen của bố mẹ và các cá thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m và Piz 
(M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL9, land 1,2, 6, 9, 10, 13, 14 các cá thể BC1F1 mang 
gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m, cá thể số 3, 5 và 11 các cá thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Piz). 
Kết quả giữa cặp lai OM6976 x 
IRBL25 ở thế hệ BC1F1 đã chọn được 7 cá thể 
dị hợp tử số 1, 2, 6, 9, 10, 13, 14 mang gen Pik-
m (Hình 2). Thế hệ BC2F1 chọn được 6 cá thể 
dị hợp số 1, 2, 4, 5, 7, 8 (Hình 3). Thế hệ 
BC3F1 chọn được 6 cá thể dị hợp số 9, 10, 12, 
13, 14, 15 (Hình 4). 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
4 
Hình 3. Kiểu gen các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL25 mang gen kháng bệnh đạo 
ôn Pik-m 
(M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, 1-8 các cá thể BC2F1) 
Hình 4. Kiểu gen các cá thể BC3F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL25 mang gen kháng bệnh đạo 
ôn Pik-m 
(M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, 9-15 các cá thể BC3F1) 
Kết quả giữa cặp lai OM6976 x IRBL9 
ở thế hệ BC1F1 đã chọn được 3 cá thể dị hợp tử 
số 3, 5, 11 mang gen Piz (Hình 2). Thế hệ 
BC2F1 chọn được 13 cá thể dị hợp tử số 1, 2, 3, 
4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16 (Hình 5). Thế hệ 
BC3F1 chọn được 6 cá thể dị hợp tử số 2, 3, 5, 
8, 10, 13 (Hình 6). 
Hình 5. Kiểu gen các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL9 mang gen kháng bệnh đạo ôn 
Piz (M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, P2: IRBL9, 1-16 các cá thể BC2F1) 
Hình 6. Kiểu gen các cá thể BC3F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL9 mang gen kháng bệnh đạo ôn 
Piz (M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, P2: IRBL9, 1-15 các cá thể BC3F1) 
Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử trong 
chọn lọc các dòng dị hợp tử mang gen kháng 
Piz và Pik-m cho thấy đối với thế hệ BC1F1, 
BC2F1 và BC3F1 của cặp lai OM 6976 x IRBL9 
mang gen kháng Piz ở 3 thế hệ này đã thực 
hiện thành công và chọn được tổng số cá thể dị 
hợp tử để thực hiện cho mục đích tiếp theo với 
số cá thể lần lượt là 3, 13 và 6 cá thể. Đối với 
thế hệ BC1F1, BC2F1 và BC3F1 của cặp lai 
OM6976 x IRBL25 mang gen kháng Pik-m ở 3 
thế hệ này cũng đã chọn được tổng số cá thể dị 
hợp tử để thực hiện cho mục đích tiếp theo với 
số cá thể lần lượt là 7, 6 và 6 cá thể. 
Kết quả từ BC1F1 cho đến thế hệ BC3F1 
có tất cả 22 cá thể mang gen Piz và 19 cá thể 
mang gen Pik-m. 
3.2. Chọn lọc các dòng hồi giao dựa vào chỉ 
thị phân tử với các dòng lúa mang hai gen 
kháng bệnh đạo ôn 
Sau khi lai cá thể BC3F1 có mang gen 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
5 
kháng Piz với cá thể BC3F1 mang gen Pik-m, 
thu được F1 mang 2 gen kháng Piz + Pik-m. 
Cho F1 tự thụ và thu được hạt F2 của từng cá 
thể. Dùng chỉ thị phân tử RM3431 liên kết với 
Piz và RM144 liên kết với Pik-m để xác định 
cá thể F2 mang 2 gen kháng Piz + Pik-m đồng 
hợp tử. Tiếp theo cho các cá thể đã được chọn 
lọc kiểu gen mang hai gen kháng này tự thụ và 
thu hạt F3. Chọn các dòng F3 có dạng hình tốt 
đưa vào so sánh năng suất phục vụ cho mục 
đích tiếp theo. 
Kết quả chọn lọc các cá thể mang 2 gen 
kháng dựa vào chỉ thị phân tử RM3431 cho 
gen Piz và RM144 cho gen kháng Pik-m, 5 cá 
thể Piz + Pik-m đã được chọn cho cặp lai 
OM6976/IRBL9//3*OM6976///OM6976/IRBL
25//3*OM6976 (Hình 7) 
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ cá thể F2 có từ cặp lai OM6976/IRBL9// 
3*OM6976///OM6976/IRBL25//3*OM6976 sử dụng 2 mồi RM3431 và RM144 
M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL 9, 1-10 các cá thể F2, cá thể số 1, 2, 6, 7 và 10 
mang 2 gen kháng Pi z + Pi k-m được chon lọc qua sự hiện diện của 2 băng ở vị trí khoảng 195bp và 
245bp. 
IV. KẾT LUẬN 
4.1. Kết luận 
- Đã chọn lọc và lai tạo thành công 5 cá 
thể mang 2 gen Piz + Pik-m của cặp lai 
OM6976/IRBL9//3*OM6976///OM6976/IRBL
25//3*OM6976. 
4.2. Đề nghị 
- Tiếp tục nhân, đánh giá các cá thể 
mang 2 gen kháng ở các vụ sau. 
LỜI CẢM ƠN 
Tác giả chân thành cảm ơn: 
- Bộ Khoa học và Công nghệ, Chương 
trình trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 đã 
cấp kinh phí thực hiện Đề tài “Nghiên cứu 
chọn tạo và phát triển giống lúa thơm, năng 
suất, chất lượng cao”. 
- Cám ơn cán bộ của Bộ môn Công 
nghệ Sinh học ,Viện Lúa ĐBSCL, Viện Khoa 
học Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện để 
thực hiện đề tài này. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Ashkani S, Rafii MY, Shabanimofrad M, 
Ghasemzadeh A, Ravanfar SA, Latif MA., 
2016. Molecular progress on the mapping 
and cloning of functional genes for blast 
disease in rice (Oryza sativa L.): current 
status and future considerations. Crit Rev 
Biotechnol., 36(2): 353-67. 
Dư Phạm Văn và Lê Cẩm Loan, 2009. Nghiên 
cứu một số gen kháng bệnh đạo ôn có hiệu 
quả đối với các nòi nấm Pyricularia grisea 
ở Đồng bằng sông Cửu Long. Trong Hội 
thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam 
lần thứ 8. Ninh Thuận, 25-26/7/2009: 7-14. 
Lang Nguyen Thi, Trinh Thi Luy, Pham Thi Thu 
Ha and Bui Chi Buu, 2009. Monogenic 
lines resistance to blast disease in rice 
(Oryza sativa L.) in Vietnam. International 
Journal of Genetict and Molecular 
Biology, 1: 127-136. 
Li HJ, Conner RL, Liu ZY, Zhou YL, Duan XY, 
Shen TM, Chen Q, Graf RJ, Li YW, Chen 
Y, Jia X., 2007. Characterization of wheat-
triticale lines resistant to powdery mildew, 
stem rust, stripe rust, wheat curl mite, and 
limitation on spread of WSMV. Plant 
Disease, 91(4):368-374. 
Murray WF and Thompson MG, 1980. Rapid 
isolation of high molecular weight plant 
DNA. Nucleic Acids Research, 8: 4321-
4325. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
6 
Nghĩa Lã Tuấn, Nguyễn Kiến Quốc, Nguyễn Văn 
Bích, 2009. Ứng dụng công nghệ chỉ thị 
phân tử để chọn tạo dòng/giống lúa kháng 
đạo ôn. Trong Hội nghị Công nghệ sinh 
học toàn quốc năm 2009. 
Sallaud C, Lorieux M, Roumen E, Tharreau E, 
Berruyer R, Svestasrani P, Garsmeur O, 
Ghesquiere A and Notteghem JL., 2003. 
Identification of five new blast resistance 
genes in the highly blast-resistant rice 
variety IR64 using a QTL mapping 
strategy. Theoretical Applied Genetics,106: 
794-803. 
Zheng K, Huang N, Bennett J and Khush GS., 
1995. PCR-based marker-assisted selection 
in rice breeding. IRRI Discussion Paper 
Series, 12:24. 
ABSTRACT 
Appications SSR (Simple Sequence Repeats) for improvement of resistance to rice blast 
Rice blast is one of the most serious rice diseases and caused great yield losses every year in 
the world. It had been proved that using resistant rice varieties would be the most effective way to 
control this disease; therefore, mining the resistant genes might be important foundational work in the 
breeding program. In the present study, we identified the existence of the Piz and Pik-m gene by using 
the SSR marker RM3431 and RM1144 linked with gene of IRBL9 and IRBL25 rice variety. A simple 
sequence repeat (SSR) based on molecular marker-aided selection system for the Piz and Pik-m 
segment was established. Five lines derived from the recurrent parent OM6976 was obtained with Piz 
and Pik-m gene. 
Keywords: Rice blast; SSR marker; Piz gene; Pik-m gene, OM6976 
Người phản biện: TS. Khuất Hữu Trung