Vai trò của nhân tố phiên mã Osnli - If trong tăng cường tính chịu hạn ở lúa

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
285 
VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ OsNLI-IF TRONG TĂNG CƯỜNG 
TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA 
Nguyễn Duy Phương, Phạm Xuân Hội 
Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 
TÓM TẮT 
 Thực vật đáp ứng với các điều kiện môi trường bất lợi bằng cách hoạt hóa hàng loạt các gen 
liên quan tới chống chịu stress, trong đó bao gồm cả nhóm gen điều khiển mã hóa các nhân tố phiên 
mã. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF từ thư 
viện cDNA xử lý stress của lúa bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu. Nghiên cứu cho thấy OsNLI-
IF được tăng cường biểu hiện trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao theo con 
đường không phụ thuộc vào ABA. Cây thuốc lá được chuyển gen OsNLI-IF có tốc độ sinh trưởng 
chậm hơn trong điều kiện môi trường bình thường nhưng thể hiện khả năng chống chịu cao hơn rõ 
rệt so với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện môi trường hạn. Kết quả của nghiên cứu 
này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng rất lớn của gen OsNLI-IF trong việc phát triển các giống cây trồng 
chuyển gen kháng hạn. 
Từ khóa: chịu hạn, chuyển gen, lúa, nhân tố phiên mã, OsNLI-IF, thuốc lá. 
I. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Hạn và mặn là hai trong số những nhân 
tố quan trọng nhất kìm hãm sự phát triển sản 
xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa gạo. 
Hiện nay, nghiên cứu tạo ra giống cây trồng 
chuyển gen dựa trên công nghệ tế bào thực vật 
đã trở nên phổ biến trên thế giới và đang dần 
được áp dụng ở Việt Nam. Do đó, việc nghiên 
cứu đặc tính các gen đáp ứng hạn và mặn cũng 
như việc đánh giá khả năng áp dụng của chúng 
là một yêu cầu hết sức cấp thiết. Trong hệ gen 
thực vật có rất nhiều gen đã được xác định liên 
quan tới đáp ứng chống chịu stress và được 
chia thành hai nhóm chính: (1) nhóm gen chức 
năng mã hóa cho các protein, enzyme tham gia 
trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện 
bất lợi của thực vật và (2) nhóm gen điều khiển 
mã hóa các nhân tố phiên mã có vai trò điều 
khiển quá trình hoạt động của các gen chức 
năng [5]. Gần đây, rất nhiều nghiên cứu về 
nhân tố phiên mã được thực hiện trên cây mô 
hình Arabidopsis và các loài thực vật khác đã 
chứng minh các nhân tố phiên mã có thể kích 
hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng, 
từ đó giúp tăng cường khả năng chống chịu 
điều kiện bất lợi ở thực vật [6]. 
Trong nghiên cứu này, bằng kỹ thuật 
PCR, chúng tôi đã phân lập được gen mã hóa 
protein OsNLI-IF (Nuclear LIM interactor-
interacting factor) từ thư viện cDNA xử lí stress 
của lúa. Nghiên cứu ban đầu cho thấy OsNLI-IF 
được cảm ứng bởi các điều kiện bất lợi của môi 
trường như hạn, mặn và lạnh. Các cấu trúc biểu 
hiện của gen OsNLI-IF đã được chuyển vào cây 
thuốc lá mô hình để nghiên cứu chức năng của 
nhân tố phiên mã OsNLI-IF. 
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu 
Thư viện cDNA của lúa Pusa Basmati 1 
xử lý stress do phòng Bệnh học Phân tử, Viện 
Di truyền Nông nghiệp cung cấp. 
2.2. Phương pháp 
2.2.1. Phân lập gen từ thư viện cDNA xử lý 
stress 
Đoạn gen OsNLI-IF được nhân bản từ thư 
viện cDNA của lúa bằng kỹ thuật PCR [4], sử 
dụng mồi xuôi EcoRI-NLI-Fw (5’-
GAATTCATGCCAGCACTGAGGATG-3’) và 
mồi ngược XhoI-NLI-Rv (5’-
CTCGAGTTATTGGAAAATCTCAGC-3’). 
Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 µl DNA 
khuôn; 1 µl mỗi loại mồi; 2,5 µl đệm Taq 
polymerase 10 X; 2,5 µl dNTP 2 mM; 1 µl Taq 
polymerase; 17,5 µl H2O cất khử trùng khử ion. 
Phản ứng được thực hiện 35 chu kỳ: biến tính 
DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 
giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 1 phút. Sản 
phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose bằng 
bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) và 
nhân dòng vào vector pGEM-T (Promega) theo 
quy trình hướng dẫn đi kèm bộ kit. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
286 
2.2.2. Phân tích Northern blot 
Thí nghiệm lai RNA được thực hiện theo 
mô tả trước đây của Nakashima [3]. Mảnh 
DNA mang trình tự đầy đủ của OsRap2.4A và 
rRNA 18S (đối chứng) được đánh dấu phóng 
xạ bằng [α32P]-dCTP và sử dụng làm đầu dò 
cho thí nghiệm lai. RNA tổng số được điện di 
trên gel agarose biến tính 1.2% chứa 
formaldehyde-MOPS và chuyển lên màng 
Hybond-N+ (Amersham Biosciences). Sau khi 
chuyển màng, màng được rửa hai lần trong 
SSC 2X chứa SDS 0,1% trong 20 phút ở 65oC 
và một lần trong SSC 1X chứa SDS 0,1%. 
RNA được phát hiện trên phim X. rRNA 18S 
được sử dụng làm mẫu nội chuẩn. 
2.2.3. Lai thẩm tách miễn dịch (Western blot) 
Dịch chiết protein sau khi điện di trên gel 
SDS-PAGE theo phương pháp của Laemmli 
(1970) [4] được chuyển lên màng 
nitrocellulose bằng phương pháp điện chuyển 
trong đệm Tris-glycine có 20% methanol. 
Màng được cố định bằng dung dịch BSA 1% 
trước khi được ủ với kháng thể sơ cấp và thứ 
cấp. Băng protein được hiện màu bằng cách ủ 
màng trong dung dịch cơ chất p-nitro blue 
tetrazolium chloridel 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl phosphat (NBT/BCIP) pha trong đệm 
TBS pH 9,0 có MgCl2 5 mM. 
2.2.4. Thiết kế vector biểu hiện trong tế bào 
thực vật và tạo cây chuyển gen 
Để thiết kế hệ vector biểu hiện 
pCAMBIA1301, vector tách dòng 
pGEM/OsNLI-IF và “vector cho” pRT101 được 
xử lí đồng thời bằng EcoRI. Trình tự mã hóa 
NLI-IF được ghép nối vào “vector cho” pRT101 
để tạo cấu trúc biểu hiện gen [35S:OsNLI-
IF:NOS]. Cấu trúc [35S:OsNLI-IF:NOS] được 
chèn vào vị trí nhận biết của enzyme giới hạn 
HindIII của vector chuyển gen pCAMBIA1301. 
Các cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF được 
chuyển vào cây thuốc lá theo phương pháp của 
Horsch et al., sử dụng vi khuẩn Agrobacterium 
tumerfaciens LBA4404 [2]. 
2.2.5. Đánh giá khả năng chống chịu hạn 
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn 
của cây chuyển gen được thực hiện theo 
phương pháp của Dubouzet [1]. Hạt thuốc lá 
được cho nảy mầm trên môi trường MS không 
có chất kháng sinh (đối với cây đối chứng 
không chuyển gen) và có chứa Hygromycin 50 
mg/l (đối với cây chuyển gen). Cây non ở giai 
đoạn 2 lá non được chuyển sang chậu đất và 
trồng trong điều kiện nhà kính trong 2 tuần. Các 
mẫu cây được xử lý stress hạn giả định bằng 
cách ngừng tưới nước trong 1 tháng, sau đó tưới 
nước trở lại bình thường. Sau 2 tuần, số cây 
phục hồi sinh trưởng được đếm và ghi lại. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Phân lập nhân tố phiên mã OsNLI-IF 
từ thư viện cDNA xử lý stress 
Để phục vụ cho việc nghiên cứu chức 
năng của OsNLI-IF trong cây lúa, thí nghiệm 
nhân dòng OsNLI-IF vào pGEM-T đã được 
thực hiện. Cặp mồi đặc hiệu EcoRI-NLI-
Fw/XhoI-NLI-Rv để nhân bản vùng ORF của 
OsNLI-IF từ thư viện cDNA thứ cấp pAD-
GAL4 đã được thiết kế dựa trên trình tự gen 
OsNLI-IF được công bố trên GenBank (mã số 
NM_001050330.1). 
Đoạn gen OsNLI-IF được nhân bản 
bằng PCR. Kết quả ảnh điện di sản phẩm PCR 
cho thấy tất cả sản phẩm PCR sử dụng khuôn 
là thư viện cDNA đều chứa 1 băng DNA duy 
nhất có kích thước khoảng 1,3 kb (Hình 1, 
giếng 1-5) tương ứng với kích thước theo lý 
thuyết của gen OsNLI-IF; trong khi phản ứng 
đối chứng âm không có DNA khuôn, chúng 
tôi không thu được băng DNA này (Hình 1, 
giếng 6). 
Hình 1: Nhân bản đoạn gen OsNLI-IF bằng kỹ 
thuật PCR 
Ghi chú: Sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-
Fw/XhoI-NLI-Rv được điện di trên gel agarose 1%. 
Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 – 5: 
khuôn là thư viện cDNA pha loãng tỉ lệ 1:1, 1:10, 
1:50, 1:100 và 1:500; giếng 6: đối chứng âm 
(không có DNA khuôn). 
Sản phẩm nhân bản đoạn gen OsNLI-IF 
được tinh sạch (nhằm loại bỏ toàn bộ các thành 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
287 
phần dư thừa của PCR và các băng DNA 
không đặc hiệu khác), sau đó ghép nối vào 
vector nhân dòng pGEM-T. Vector tái tổ hợp 
sau đó được kiểm tra bằng hai phương pháp 
PCR và cắt enzyme giới hạn. 
Kết quả điện di trên hình 2A cho thấy đối 
với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 
của OsNLI-IF (EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv), 
sản phẩm PCR cho một băng DNA có kích 
thước khoảng 1,3 kb (hình 2B, giếng 3) tương 
ứng với kích thước của đoạn gen đích. Đối với 
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho 
vector (T7-Pro/SP6-Pro), kết quả điện di thu 
được một băng DNA khoảng 1,5 kb (hình 2B, 
giếng 1); kích thước này phù hợp với kích thước 
đoạn DNA theo tính toán lý thuyết bao gồm 1,3 
kb chiều dài OsNLI-IF và 186 bp của đoạn 
DNA nằm trên vector pGEM (hình 2A). 
Đối với thí nghiệm kiểm tra plasmid tái 
tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, do trên 
vector pGEM-T và đoạn gen OsNLI-IF đều có 
1 vị trí nhận biết của enzyme NdeI (hình 2A) 
nên chúng tôi đã thực hiện phản ứng cắt giới 
hạn pGEM/Hox24 bằng NdeI để xác định sự 
có mặt của OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp. 
Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn cho 
thấy sự xuất hiện của hai băng DNA có kích 
thước đúng với kích thước tính toán lý thuyết 
(hình 2C, giếng 1) chứng tỏ plasmid thu được 
là vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF. 
Hình 2: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF bằng PCR và cắt giới hạn 
Ghi chú: (A) Sơ đồ vị trí nhận biết của mồi và enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM/OsNLI-IF. Sản phẩm 
PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (B) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 2: PCR với cặp 
mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là 
pGEM/OsNLI-IF; giếng 2 và 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn). (C) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng 
NdeI ; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb. 
Để khẳng định chính xác đoạn DNA 
được nhân bản và nhân dòng vào vector 
pGEM-T đúng là đoạn gen mã hoá protein 
OsNLI-IF, chúng tôi tiến hành giải trình tự 
vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF và phân tích 
kết quả bằng phần mềm BioEdit. Kết quả so 
sánh trình tự nucleotide cho thấy đoạn DNA đã 
nhân dòng có kích thước 1320 bp, mang trình 
tự mã hóa một chuỗi polypeptide gồm 439 acid 
amin, tương đồng với trình tự DNA có mã số 
NM_001050330.1 trong GenBank và được đặt 
tên là OsNLI-IF. Các kết quả thu được chứng 
tỏ khung đọc mở của gen mã hóa protein 
OsNLI-IF đã được nhân dòng thành công. 
3.2. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF 
Để xác định mô hình biểu hiện của 
OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh 
học, cây lúa non ba tuần tuổi xử lý với các điều 
kiện stress giả định (nhân tạo), sau đó mẫu 
RNA tổng số của các mẫu lúa đã xử lý stress 
trong khoảng thời gian khác nhau được tách 
chiết và sử dụng cho các thí nghiệm phân tích 
hàm lượng mRNA. Mẫu RNA tách chiết từ cây 
lúa ở thời điểm chưa xử lý stress được sử dụng 
làm mẫu đối chứng âm. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
288 
Hình 3: Mức độ tích lũy mRNA OsNLI-IF trong cây lúa xử lý stress. 
Ghi chú: Cây lúa được xử lý stress bằng cách để khô trong không khí (mất nước), hạn (PEG 20%), mặn 
(NaCl 200 mM), lạnh (4oC), nóng (42oC) và hormone (ABA 100 µM) trong thời gian 0,5 h, 1 h, 2 h, 6h, 12 
h và 24 h. mRNA của OsNLI-IF được phát hiện bằng kỹ thuật Northern blot, sử dụng đầu dò (sản phẩm 
PCR nhân bản OsNLI-IF) có gắn phóng xạ P32. Mẫu tách chiết rRNA 18S được điện di trên gel agarose 
biến tính và nhuộm EtBr làm đối chứng. 
Kết quả phân tích hàm lượng mRNA bằng 
kĩ thuật Northern blot cho thấy hàm lượng 
mRNA của OsNLI-IF thay đổi rõ rệt theo thời 
gian trong thí nghiệm xử lý stress. Mức độ biểu 
hiện cao nhất của OsNLI-IF quan sát được ở thời 
điểm 12 giờ trong thí nghiệm xử lý stress mặn, 
thể hiện ở hàm lượng mRNA tăng khoảng 68 lần 
so với bình thường. Hàm lượng mRNA của 
OsNLI-IF tăng đáng kể trong vòng 2 giờ sau khi 
tiếp xúc với stress lạnh và mặn (tăng khoảng 20 
lần), đạt đỉnh sau 6 – 12 giờ xử lý stress. Trong 
thí nghiệm xử lý điều kiện mất nước, mức độ 
phiên mã của OsNLI-IF tăng chậm hơn nhưng 
đạt đỉnh khá sớm ở thời điểm 2 giờ (tăng ~30 
lần), sau đó bắt đầu giảm dần. Đối với thí 
nghiệm xử lý nhiệt độ 42oC, chúng tôi phát hiện 
hàm lượng mRNA của OsNLI-IF thay đổi rất 
nhanh, tăng hơn 40 lần chỉ trong thời gian 30 
phút, sau đó bắt đầu giảm dần. Tuy nhiên, đến 
thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress, OsNLI-IF 
dường như tăng biểu hiện trở lại và đạt gần tới 
mức biểu hiện cao nhất (thời điểm 0,5 giờ) sau 
12 giờ. Mức độ tích lũy mRNA của OsNLI-IF 
trong điều kiện hạn và lạnh xảy ra chậm hơn so 
với trong điều kiện stress nhiệt độ cao và đều đạt 
đỉnh ở thời điểm 6 giờ sau khi xử lý stress. Tuy 
nhiên, mức độ biểu hiện của OsNLI-IF trong 
điều kiện stress hạn giảm rất nhanh về gần mức 
cơ bản sau 12 giờ xử lý stress. Ngược lại, trong 
các thí nghiệm xử lý stress lạnh, mất nước và 
đặc biệt là stress mặn, OsNLI-IF vẫn duy trì mức 
độ biểu hiện cao sau 24 giờ tiếp xúc với yếu tố 
stress. Đối với thí nghiệm xử lý cây lúa non bằng 
hormone ABA, chúng tôi không phát hiện được 
sự thay đổi đáng kể nào về hàm lượng mRNA 
trong hầu hết thời gian thí nghiệm. Các kết quả 
thu được này chứng tỏ quá trình phiên mã của 
OsNLI-IF được điều hòa bởi nhiều yếu tố stress 
phi sinh học khác nhau, bao gồm stress mặn, 
hạn, mất nước, lạnh và nhiệt độ cao. 
3.3. Biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc 
lá chuyển gen 
Trong nghiên cứu này, để xác định chức 
năng của nhân tố phiên mã OsNLI-IF trong 
điều kiện in vivo, chúng tôi tiến hành thí 
nghiệm chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào cây 
thuốc lá. Các dòng cây chuyển gen (T0 và T1) 
được kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện 
gen bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu của cấu 
trúc biểu hiện gen đích (số liệu không trình 
bày). Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các 
dòng thuốc lá chuyển gen T1 được phát hiện 
bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch với kháng 
thể kháng đặc hiệu OsNLI-IF. 
Kết quả lai thẩm tách miễn dịch cho thấy 
có 5 trong số 6 dòng thuốc lá chuyển gen được 
kiểm tra (TL1, TL3, TL7, TL8 và TL10) có 
biểu hiện protein đích với sự xuất hiện của 1 
băng protein 52 kDa (Hình 4A, giếng 1, 2, 5, 6, 
và 7) tương tự mẫu đối chứng dương sử dụng 
protein OsNLI-IF tái tổ hợp (Hình 4A, giếng 
4). Ngược lại, cả 3 cây T1 thuộc dòng TL4 và 3 
cây thuộc hai dòng đối chứng (chuyển cấu trúc 
pCAMBIA1301 và không chuyển gen) đều cho 
kết quả âm tính. Sử dụng phần mềm ImageJ, 
mức độ biểu hiện protein OsNLI-IF tương quan 
giữa các dòng thuốc lá chuyển gen đã được xác 
định (Hình 4B). Kết quả so sánh cho thấy mức 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
289 
độ biểu hiện của gen đích OsNLI-IF có sự khác 
biệt đáng kể giữa các dòng thuốc lá chuyển 
gen. Cụ thể, hàm lượng protein OsNLI-IF cao 
nhất được phát hiện trong các cây thuộc hai 
dòng TL1 và TL8; hai dòng TL3 và TL7 có 
mức độ biểu hiện protein đích ở mức vừa phải; 
dòng TL10 có mức độ tích lũy OsNLI-IF thấp 
nhất; dòng TL4 hoàn toàn không biểu hiện 
protein đích. 
Hình 4: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 
Ghi chú: (A) Protein OsNLI-IF trong dịch chiết protein tổng số của các dòng thuốc lá được phát hiện bằng 
kháng thể đa dòng đặc hiệu (pha loãng 1:2000); giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 và 5 – 7: dòng 
TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng 4: OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dòng ĐC8 (V); giếng 9: cây 
thuốc lá không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein OsNLI-IF tương quan giữa các 
dòng thuốc lá; hàm lượng OsNLI-IF của dòng TL10 có giá trị bằng 1; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả 
trung bình của 3 lần thí nghiệm trên 3 cây khác nhau. 
Hình 5: Khả năng sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 
Ghi chú: Hình thái của các dòng thuốc lá sinh trưởng ở giai đoạn 4 tuần tuổi. (WT) cây thuốc lá dại; (V) 
dòng thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-
IF:Nos. 
Để xác định ảnh hưởng của sự biểu hiện 
liên tục gen mã hóa OsNLI-IF đối với khả năng 
sinh trưởng của cây thuốc lá chuyển gen, hạt 
của 3 dòng thuốc lá đại diện cho 3 mức độ biểu 
hiện gen khác nhau (TL1 – biểu hiện cao, 
TL10 – biểu hiện thấp và TL4 – không biểu 
hiện) đã được lựa chọn để tiếp tục phân tích, 
đánh giá kiểu hình. Kết quả quan sát các cây 
thuốc lá ở giai đoạn 4 tuần tuổi cho thấy không 
có sự khác biệt đáng kể về hình thái và tốc độ 
sinh trưởng giữa cây thuốc lá đối chứng không 
chuyển gen (Hình 5, dòng WT) và cây thuốc lá 
được chuyển cấu trúc không mang gen đích 
pCAMBIA1301 (Hình 5, dòng V). Điều này 
chứng tỏ việc chuyển cấu trúc biểu hiện gen 
trên vector pCAMBIA1301 vào cây thuốc lá 
không gây ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng 
của cây. Đối với ba dòng thuốc lá được chuyển 
cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF, mặc dù hình 
thái cây không xuất hiện những đặc điểm bất 
thường, tốc độ sinh trưởng của ba dòng cây 
chuyển gen này có sự khác biệt đáng kể khi 
được so sánh với nhau và với hai dòng thuốc lá 
đối chứng. Quan sát này cho thấy tốc độ sinh 
trưởng của cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với 
mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF. Cụ thể, 
dòng thuốc lá tích lũy protein OsNLI-IF ở mức 
cao nhất (dòng TL1) có tốc độ sinh trưởng 
chậm nhất, dòng thuốc lá biểu hiện protein 
OsNLI-IF ở mức thấp (dòng TL10) hoặc không 
biểu hiện protein OsNLI-IF (dòng TL4) có tốc 
độ sinh trưởng nhanh hơn và không khác biệt 
lớn so với hai dòng đối chứng (Hình 5, dòng 
TL1, TL4 và TL10). Kết quả này chứng tỏ sự 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
290 
biểu hiện của gen OsNLI-IF đã gây ảnh hưởng 
tới khả năng sinh trưởng của cây thuốc lá 
chuyển gen và mức độ tích lũy protein OsNLI-
IF trong mô càng cao sẽ dẫn tới cây sinh 
trưởng càng chậm trong điều kiện gieo trồng 
bình thường (không có stress). 
Để đánh giá khả năng chống chịu hạn 
của cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện tăng 
cường protein OsNLI-IF của lúa, các cây thuốc 
lá chuyển gen T1 được chúng tôi trồng trong 
điều kiện stress hạn giả định (không tưới nước) 
trong một tháng, sau đó tưới nước trở lại và 
quan sát khả năng phục hồi. Kết quả thể hiện ở 
bảng 2 cho thấy dòng thuốc lá TL10 biểu hiện 
protein đích OsNLI-IF ở mức độ thấp có khả 
năng chống chịu hạn cao nhất với tỉ lệ cây phục 
hồi sau stress hạn chiếm 75% tổng số cây được 
kiểm tra. Khả năng chịu hạn của dòng thuốc lá 
TL1 (có gen OsNLI-IF biểu hiện mạnh) thấp 
hơn so với dòng thuốc lá TL10, với 20/36 cây 
phục hồi sau thí nghiệm xử lý hạn (56%). Đặc 
biệt, tỉ lệ sống sót của các cây thuốc lá có biểu 
hiện protein OsNLI-IF cao hơn rõ rệt so với 
dòng đối chứng không chuyển gen (16%) cũng 
như dòng ĐC2 được chuyển cấu trúc 
pCAMBIA1301 không mang gen (8%) hay 
dòng TL4 được chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF 
nhưng không biểu hiện gen đích (8%). 
Bảng 2: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá 
Dòng thuốc lá Cấu trúc biểu hiện gen Tỉ lệ cây sống sót Tưới nước1 Không tưới nước2 
Đối chứng Không chuyển gen 35/35 (100%) 
6/36 
(16%) 
ĐC2 pCAMBIA1301 36/36 (100%) 
3/36 
(8%) 
TL1 35S:OsNLI-IF 35/36 (97%) 
20/36 
`(56%) 
TL4 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 
8/36 
(22%) 
TL10 35S:OsNLI-IF 36/36 (100%) 
27/36 
(75%) 
(1)Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và tưới nước hàng ngày. 
 (2)Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và không tưới nước liên tục trong 1 tháng, sau đó 
tưới nước trở lại liên tục trong 3 ngày. 
IV. KẾT LUẬN 
 Bằng phương pháp PCR chúng tôi đã 
phân lập thành công gen mã hóa nhân tố phiên 
mã OsNLI-IF từ thư viện cDNA xử lý stress 
của lúa. Đoạn gen phân lập được có kích thước 
1320 bp mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 
439 acid amin, tương đồng 100% với trình tự 
có mã số NM_001050330.1 trên GenBank. Gen 
OsNLI-IF cảm ứng biểu hiện với các yếu tố 
môi trường bất lợi bao gồm hạn, mặn, lạnh và 
nhiệt độ cao theo con đường điều hòa không 
phụ thuộc ABA. Các dòng thuốc lá chuyển gen 
OsNLI-IF có tốc độ sinh trưởng chậm hơn so 
với các dòng cây đối chứng trong điều kiện 
bình thường; trong thí nghiệm xử lý stress hạn 
(ngừng tưới nước), cây chuyển gen thể hiện 
khả năng chống chịu cao hơn rõ rệt so với cây 
đối chứng, tỉ lệ cây chuyển gen sống sót đạt 22 
– 75% so với 8 – 16% của cây đối chứng. 
LỜI CẢM ƠN 
 Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn: 
Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia 
đã cấp kinh phí thực hiện nghiên cứu theo đề 
tài “Nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa 
nhân tố phiên mã biểu hiện trong điều kiện 
hạn, mặn ở lúa” năm 2012; Trung tâm Quốc tế 
Kĩ thuật di truyền và Công nghệ sinh học New 
Delhi, Ấn Độ (International Centre for Genetic 
Engineering and Biotechnology, New Delhi, 
India) đã hợp tác về mặt khoa học; Viện Di 
truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi 
để thực hiện đề tài. 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 
291 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Dubouzet J.G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga 
M., Dubouzet E.G., Miura S., Seki M., 
Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. 
(2003), OsDREB genes in rice, Oryza sativa 
L., encode transcription activators that 
function in drought-, high-salt- and cold-
responsive gene expression. Plant J., 33(4): 
751-763. 
2. Horsch R. B., Fry J.E., Hoffmann N.L., 
Wallroth M., Eichholtz D., Rogers S.G. and 
Fraley R.T. (1985). A simple and gen-eral 
method for transferring genes into plants. 
Science, 227: 1229–1231. 
3. Nakashima K. and Yamaguchi-Shinozaki K. 
(2002), Molecular Methods of Plant 
Analysis: Testing for Genetic Manipulation 
in Plants, Berlin: Springer-Verlag, 22: 37-61. 
4. Sambrook J. and Russel D.W. (2001), 
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold 
Spring Harbour, New York. 
5. Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. 
(2007). Gene networks involved in drought 
stress response and tolerance. J. Exp. Bot., 
58: 221-227. 
6. Todaka D., Shinozaki K. and Yamaguchi-
Shinozaki K. (2015). Recent advances in the 
dissection of drought-stress regualatory 
networks and strategies for development of 
drought-tolerant transgenic rice plants. Plant 
Sci., 6:84. DOI: 10.3389/fpls.2015.00084. 
ABSTRACT 
Transcription factor OsNLI-IF relating to drought tolerance in rice (Oryza sativa L.) 
Plants adapt to unfavorable environments via activating various genes relating to stress 
including genes encoded transcription factors (protein TFs). In the study, rice genes encoding 
transcription factor OsNLI-IF were examined from cDNA library under stress treatments. PCR was 
analyzed with specific primers. Accordingly, OsNLI-IF was enhanced and well expressed under 
drought, salinity, cold, heat through ABA-independent pathway. Transgenic tabacco with OsNLI-IF 
exhibited its slow growth as compared to wild type under normal condition, but more tolerant than wild 
type under drought stress. The result clarified great potential of OsNLI-IF in rice improvement of 
drought tolerance. 
Keywords: drought tolerance, OsNLI-IF, tabacco, transcription factor, transgenic rice. 
Người phản biện: TS. Khuất Hữu Trung