Xây dựng hệ thống định lượng alpha - Fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha - fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou

 209 
XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN 
TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN 
ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU 
Phan Ngọc Tiến* 
TÓM TẮT 
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể 
đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP). 
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm. 
Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng 
kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F, 
có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu 
huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có 
HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân 
u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh 
nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%). 
Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột 
LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml. 
ABSTRACT 
THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTI-
ALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT 
Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 208 - 212 
Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using 
monoclonal antibodies. 
Method: Experimental research. 
Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal 
antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml. 
In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples 
of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B 
hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 
ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP 
< 500 ng/ml (24%), respectively. 
Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal 
antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml. 
 ĐẶT VẤN ĐỀ 
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng 
được Georges Kohler và César Milstein trình 
bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng 
thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất 
nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận 
diện và định lượng kháng nguyên. 
Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có 
trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được 
tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ 
AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh 
* Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh 
 210 
bào thai người rất cao. Tuy nhiên AFP có trong 
huyết thanh người sau sinh và người trưởng 
thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11). 
Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên 
phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP 
trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh 
ung thư gan nguyên phát. 
Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được 
sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã 
mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng 
tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong 
huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10). 
Mục tiêu nghiên cứu 
Xây dựng hệ thống định lượng alpha-
fetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng 
kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế 
bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với 
AFP và dòng tế bào IR983. 
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Thiết kế nghiên cứu 
Nghiên cứu thực nghiệm. 
Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu 
- Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể 
đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase. 
- Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại 
Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế 
và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh. 
Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân 
có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong 
đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của 
bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B 
cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14 
mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không 
có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ, 
35 mẫu huyết thanh của người bình thường 
khỏe mạnh, HBsAg (-). 
Phương pháp thu thập số liệu 
- Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai 
đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang 
tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA. 
- Xác định mật độ quang tương ứng của các 
nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 
350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh 
chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM. 
- Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể 
định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ 
chuột LOU: dùng phương pháp ELISA 
- Xác định mật độ quang tương ứng của các 
nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5 
ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có 
thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ 
chuột LOU với phương pháp ELISA. 
- Định lượng AFP trong các mẫu huyết 
thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng 
kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng 
phương pháp ELISA. 
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh 
số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết 
thanh của người bình thường được đánh số từ 
1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân 
có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16 
mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu 
vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu 
huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh 
số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định 
lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu 
huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1 
sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu 
huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên 
350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả 
cuối cùng là trên 500 ng/ml. 
Xử lý số liệu 
Chương trình Point To Point, chương trình 
dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để 
tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương 
trình SPSS 11.5 
KẾT QUẢ 
Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng 
độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng 
Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy 
khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo. 
Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500 
ng/ml thì DO tăng không đáng kể. 
 211 
Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng 
nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao 
nhất là 350ng/ml. 
Qua đường cong chuẩn của hệ thống định 
lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng 
kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng 
tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ 
AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận. 
+ r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và 
nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ. 
+ Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng: 
y = a + bx, trong đó: 
Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính 
là: y = 0,599 + 0,0055x 
+ P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan 
tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng 
DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương 
quan có ý nghĩa thống kê. 
AFP (ng/ml)
500450400350300250200150100500
D
O 3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
98
7
6
5
4
3
2
1
Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou
AFP (ng/ml)
6543210
D
O ,30
,25
,20
,15
,10
,05
0,00
8
7
6
5
4321
Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP 
Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ 
thống định lượng AFP dựa trên kháng thể 
đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể 
định lượng được (đồ thị 2) 
Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng 
độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng 
khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn 
đi ngang. Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống 
định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng 
kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng 
 212 
được là 0,5 ng/ml. 
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các 
mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng 
AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP 
của chuột LOU 
Số thứ tự 
mẫu huyết 
thanh 
Số mẫu 
huyết 
thanh 
Giá trị 
nhỏ nhất 
Giá trị lớn 
nhất 
Giá trị 
trung bình 
1-35 35 1,08 7,26 2,7780 
36-49 14 0,91 6,08 3,7993 
50-65 16 6,2 113,53 32,1806 
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những 
bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ 
số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%). 
BÀN LUẬN 
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein 
trong huyết thanh người bằng phương pháp 
Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản 
xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và 
dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ 
đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở 
nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống 
định lượng của các hãng khác là Abbott 
0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và 
AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao 
nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là 
350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6). 
Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các 
thử nghiệm đặc tính và định lượng không có 
phản ứng chéo với các protein của huyết thanh 
nhất là với albumin, protein có trọng lượng 
phân tử và cấu trúc gần giống với AFP. 
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90 
mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với 
các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8). 
Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng 
kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột 
Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết 
thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng 
góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ 
thống định lượng AFP. 
KẾT LUẬN 
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein 
bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn 
dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào 
lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP 
và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng 
độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến 
350ng/ml. 
Mật độ quang và nồng độ AFP có mối 
quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p = 
0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: 
nồng độ AFP chuẩn). 
Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ 
thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn 
dòng kháng AFP của chuột LOU 
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những 
người bình thường là 2,8 ng/ml. 
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những 
bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml. 
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những 
bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml. 
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những 
bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%). 
Cám ơn: GS.TS. Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp. HCM, 
BS. Cao Đức Trùng Dương và BS. Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ 
Dũ Tp. HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular 
snd Molecular Immunology, W.B. Sauders Company, A 
division of Harcourt Brace Company, USA. 
2. Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor 
marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8. 
3. Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal 
Antobody, CRC Press, USA. 
4. Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th 
Edition, Vol 2, pp.1381-1383. 
5. Kemeny D.M. (1991), A practiceal guide to Elisa, Department 
of Allergy Guy’s Hospital, London. 
6. Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme 
Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, 
USA. 
7. Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan 
nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4), 
tr.24-28. 
8. Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ 
Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm 
sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr. 
1-3. 
 213 
9. Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học 
tập 1, nhà xuất bản tự điển bách khoa, Hà Nội, tr. 303-306. 
10. Tijssen P. (1985), Practice and Theory of enzyme 
immunoassays, Elsevier, The Netherlands. 
11. Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang 
(1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của 
Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35. 
 214