Đánh giá đa dạng di truyền và tính gây bệnh của nấm corynespora cassiicola trên cây cao su (hevea brasiliensis) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH 
************************* 
NGUYỄN ĐÔN HIỆU 
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ TÍNH GÂY BỆNH 
CỦA NẤM Corynespora cassiicola TRÊN CÂY CAO SU 
(Hevea brasiliensis) Ở VIỆT NAM 
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật 
Mã số : 9.62.01.12 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Hướng dẫn Khoa học: 
TS. NGUYỄN ANH NGHĨA 
PGS.TS. NGUYỄN BẢO QUỐC 
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2020 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH 
************************* 
NGUYỄN ĐÔN HIỆU 
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ TÍNH GÂY BỆNH 
CỦA NẤM Corynespora cassiicola TRÊN CÂY CAO SU 
(Hevea brasiliensis) Ở VIỆT NAM 
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật 
Mã số : 9.62.01.12 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Hướng dẫn Khoa học: 
TS. NGUYỄN ANH NGHĨA 
PGS.TS. NGUYỄN BẢO QUỐC 
Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2020 
i 
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: 
 TS. Nguyễn Anh Nghĩa, PGS.TS. Nguyễn Bảo Quốc đã tận tình hướng dẫn 
và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quí báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài, 
giúp tôi hoàn thành luận án này; 
 TS. Võ Thị Thu Oanh, TS. Phạm Đức Toàn, TS. Phan Công Kiên đã luôn 
quan tâm, góp ý xây dựng trong suốt quá trình thực hiện đề tài; 
 Ban Giám hiệu, Thầy Cô Khoa Nông học và Phòng Sau Đại học - Trường 
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá 
trình học tập; 
 Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam và Phòng Nghiên cứu Bảo 
vệ Thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia khóa học và thực hiện luận 
án nghiên cứu này; 
 ThS. Nguyễn Thị Kim Uyên, KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Bùi Thanh Tuấn, 
ThS. Nguyễn Thị Thanh Trang (Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực Vật), KS. Huỳnh 
Đức Định (Phòng Nghiên cứu Di truyền Giống) - Viện Nghiên cứu Cao su Việt 
Nam đã tích cực giúp đỡ trong việc thực hiện các thí nghiệm thuộc đề tài; 
 Các bạn đồng nghiệp và gia đình đã động viên khuyến khích, giúp đỡ tôi 
trong suốt thời gian học tập tại Trường. 
 Tác giả luận án 
Nguyễn Đôn Hiệu 
ii 
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự 
hướng dẫn của TS. Nguyễn Anh Nghĩa và PGS.TS. Nguyễn Bảo Quốc tại Viện 
Nghiên cứu Cao su Việt Nam và Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Số 
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực đã được công bố trong các tạp chí, hội 
nghị khoa học bởi tác giả, nhóm tác giả và chưa được ai công bố. 
 Tác giả luận án 
Nguyễn Đôn Hiệu 
iii 
TÓM TẮT 
NGUYỄN ĐÔN HIỆU – “Đánh giá đa dạng di truyền và tính gây bệnh 
của nấm Corynespora cassiicola trên cây cao su (Hevea brasiliensis) ở Việt 
Nam” 
Chuyên ngành: Bảo vệ Thực vật Mã số: 9.62.01.12. 
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2016 – 2020 
Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của 76 mẫu 
nấm C. cassiicola phân lập từ 16 dòng vô tính (DVT) cao su và tính gây bệnh của 6 
mẫu nấm đại diện cho các phân nhóm di truyền và vùng địa lý khác nhau ở Việt 
Nam. 
 Đặc điểm hình thái tản nấm của 76 mẫu phân lập (MPL) C. cassiicola có sự 
biến thiên về màu sắc, cấu trúc sợi nấm và tốc độ sinh trưởng. Một số MPL tạo sắc 
tố hồng trên môi trường dinh dưỡng PSA. Hình thái bào tử có sự biến thiên rất lớn 
về hình dạng và kích thước không chỉ giữa các MPL mà còn trong cùng một MPL. 
Trình tự vùng rDNA-ITS (ribosomal DNA internal transcribed spacer) của 
76 MPL C. cassiicola có cùng kích thước 559 bp và giống nhau ngoại trừ 2 
nucleotide khác biệt được phát hiện ở vị trí 135 và vị trí 474. Trình tự vùng rDNA-
ITS đã phân chia 76 MPL thành 3 nhóm di truyền riêng biệt, nhóm 1 gồm 38 MPL 
có cytosine (C) ở nucleotide vị trí 135, nhóm 2 gồm 35 MPL có thymine (T) ở cùng 
vị trí và nhóm 3 gồm 3 MPL có adenine (A) ở vị trí 474. 
Mối quan hệ di truyền của 76 MPL nấm C. cassiicola được phân tích dựa 
trên chỉ thị phân tử SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism). Ba mươi 
(30) cặp primer SRAP đã được sử dụng để khuếch đại DNA vùng ORFs (Open 
Reading Frames), thu được 223 băng DNA với tỷ lệ đa hình là 93,3%. Cây phân 
nhóm di truyền được tạo từ phân tích UPGMA dựa trên hệ số Nei và Li’s đã chia 76 
MPL thành 2 nhóm chính. Nhóm 1 bao gồm 54 MPL, trong đó nhóm phụ 1A có 51 
MPL và nhóm phụ 1B có 3 MPL. Nhóm 2 bao gồm 22 MPL, trong đó nhóm phụ 
2A có 20 MPL và nhóm phụ 2B có 2 MPL. Giá trị Bootstrap cho nhóm 1 và 2 lần 
iv 
lượt là 61% và 100%. Hệ số tương đồng giữa 2 nhóm chính là 67%. Sự phân nhóm 
theo vùng địa lý ở mức cao và kiểu di truyền của các MPL nấm C. cassiicola dường 
như phụ thuộc vào vùng địa lý hơn là nguồn gốc ký chủ (DVT cao su). 
Sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mã hóa độc tố cassiicolin (gen Cas) 
với 7 cặp primer chuyên biệt đã phát hiện được 40/76 MPL nấm có sự hiện diện của 
gen Cas2 và 36 mẫu nấm còn lại không phát hiện được gen Cas, xếp vào nhóm 
Cas0. Dựa vào gen Cas, 76 MPL được phân chia thành 2 nhóm di truyền riêng biệt. 
Bảy mươi sáu (76) MPL C. cassiicola nghiên cứu đã được khảo sát khả năng 
gây bệnh trên hai dòng vô tính cao su, RRIV 4 (DVT mẫn cảm) và PB 260 (DVT 
chống chịu bệnh) bằng phương pháp lá cắt rời. Tất cả 76 MPL đều có thể lây nhiễm 
lá của 2 DVT cao su. Mức độ lây nhiễm của các MPL trên DVT RRIV 4 nghiêm 
trọng hơn rõ rệt so với trên DVT PB 260, tương ứng chỉ số bệnh (CSB) biến thiên 
từ 25,7% đến 100% so với 9,7% đến 76,7%. 
Sáu (6) MPL đại diện cho các phân nhóm di truyền và vùng địa lý khác nhau 
gồm CoryLK02, CoryDP03, CoryDN39, CoryKT04, CoryBT17, CorySL02 được 
chọn để đánh giá mức độ gây bệnh trên 12 DVT cao su. Trong điều kiện phòng thí 
nghiệm, tất cả 6 MPL đều gây bệnh rất nặng trên DVT RRIV 4 (CSB trung bình 
94,6%), gây bệnh nặng trên RRIV 1, RRIV 106, RRIV 206, RRIV 114, PB 260, PB 
255, RRIV 209 (CSB trung bình 52,5% – 75,6%), gây bệnh trung bình trên RRIV 
109, RRIV 124, PB 312, RRIV 230 (CSB trung bình 31,7% – 44,8%). Trong điều 
kiện nhà lưới, tất cả 6 MPL đều gây bệnh rất nặng trên DVT RRIV 4 (CSB trung 
bình 95,4%), trung bình trên RRIV 106, RRIV 1 (CSB trung bình 32,6% – 33,7%), 
gây bệnh nhẹ trên các DVT khác (CSB trung bình 6,4% – 19,2%). 
v 
SUMMARY 
NGUYEN DON HIEU – “Genetic diversity and pathogenicity of the fungus 
Corynespora cassiicola on rubber tree (Hevea brasiliensis) in Vietnam” 
Major: Plant Protection Code: 9.62.01.12 
Nong Lam University Ho Chi Minh City, 2016 – 2020 
The study was carried out to assess the genetic diversity among 76 C. 
cassiicola isolates collected from 16 rubber clones and pathogenicity of 6 isolates 
represent different distinct genetic groups and geographic regions in Vietnam. 
The morphological characteristics of 76 C. cassiicola isolates vary in colour, 
hyphae texture and growth speed. Some isolates produced pink pigment. Conidial 
morphology was found greatly different in shape and size not only among isolates 
but also within each isolate. 
DNA sequences confirmed the DNA fragments generated from 76 isolates 
were equal in length with 559 bp and the rDNA-ITS regions of all these isolates 
were identical with the exception two different nucleotide detected at base pair 135th 
and 474th. The rDNA-ITS sequences segregated the 76 studied isolates into three 
distinct genetic groups. Group 1, includes 38 isolates, contained cytosin (C); group 
2, includes 35 isolates, contained thymin (T) at base pair 135; and group 3, includes 
3 isolates, contained adenine (A) at base pair 474. 
The genetic relationship of 76 isolates of C. cassiicola was analysed using 
the SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism) markers. Thirty (30) SRAP 
primers were used to amplify DNA in ORFs (Open Reading Frames). The total 
DNA band obtained was 223 in which 93.3% were polymorphic. A dendrogram 
produced from UPGMA analysis based on Nei and Li’s coefficient divided the 76 
C. cassiicola isolates into two main clusters. Cluster one included 54 fungal isolates 
of which 51 and 3 were observed in subgroup 1A and 1B respectively. There were 
22 C. cassiicola isolates belonging to cluster two with subgroups 2A and 2B 
consisted of 20 and 2 fungal isolates, respectively. Bootstrap values for groups one 
and two were 61% and 100%. Similarity coefficient between the two main groups at 
vi 
67%. SRAP markers divided the studied isolates into two distinct groups which 
correlated with geographical environment rather than host source (rubber clone). 
Cas genes were amplified using PCR technique with 7 specific primer pairs 
in order to detect cassiicolin encoding genes in 76 C. cassiicola. Cassiicolin protein 
isoform Cas2 encoding gene was detected in 40 out of 76 isolates, meanwhile no 
Cas genes was detected in the remaining 36 isolates, which were subsequently 
classified to Cas0 group. Based on Cas gen, the 76 C. cassiicola isolates have been 
divided into two distinct genetic groups. 
A total of 76 C. cassiicola isolates were tested their pathogenicity on two 
rubber clones, RRIV 4 (susceptible clone) and PB 260 (tolerant clone), using 
detached leaf assay. All of the 76 isolates could infect leaves of 2 rubber clones. 
The infection levels of 76 isolates on rubber clone RRIV 4 were markedly more 
serious than that on rubber clone PB 260 with percent disease intensity (PDI) 
ranging from 25.7% to 100% in comparison to 9.7% to 76.7%, respectively. 
Six of these studied isolates representing different genetic groups and 
geographic regions including CoryLK02, CoryDP03, CoryDN39, CoryKT04, 
CoryBT17, CorySL02 were selected to assess their pathogenicity on 12 rubber 
clones. In laboratory condition, all of six isolates caused very severe disease on 
RRIV 4 (average PDI = 94.6%), severe disease on RRIV 1, RRIV 106, RRIV 206, 
RRIV 114, PB 260, PB 255, RRIV 209 with average PDI values ranging from 
52.5% to 75.6%, moderate disease on RRIV 109, RRIV 124, PB 312, RRIV 230 
with average PDI ranging from 31.7% to 44.8%. In greenhouse condition, all of six 
isolates caused very severe disease on RRIV 4 (average PDI = 95.4%), moderate 
disease on RRIV 106, RRIV 1 with average PDI values ranging from 32.6% to 
33.7%, and mild on others with average PDI values ranging from 6.4% to 19.2%. 
vii 
MỤC LỤC 
Lời cảm ơn  i 
Lời cam đoan  ii 
Tóm tắt . iii 
Mục lục .............................................................................................................. vii 
Danh sách chữ viết tắt ........................................................................................ xi 
Danh sách các bảng ........................................................................................... xiii 
Danh sách các hình ............................................................................................ xiv 
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1 
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..... 2 
2.1. Ý nghĩa khoa học ...... 2 
2.2. Ý nghĩa thực tiễn ... 3 
3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................... 3 
4. Thời gian, đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................. 3 
4.1. Thời gian nghiên cứu .... 3 
4.2. Đối tượng nghiên cứu ... 3 
4.3. Phạm vi nghiên cứu .... 3 
5. Những đóng góp mới của luận án  4 
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5 
1.1. Sơ lược về tình hình sản xuất và vị trí cây cao su ở Việt Nam  5 
1.2. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ....... 6 
1.2.1. Lịch sử và tác hại của bệnh rụng lá Corynespora tại một số quốc gia 
trên thế giới....... 6 
1.2.2. Lịch sử và tác hại của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ở 
Việt Nam .... 7 
1.2.3. Triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su...... 8 
1.3. Đặc điểm của nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên cây cao su và 
một số cây ký chủ khác................................................................................... 10 
viii 
1.3.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái nấm Corynespora cassiicola...... 10 
1.3.2. Phân bố và ký chủ của nấm Corynespora cassiicola............................ 12 
1.4. Đặc điểm phát sinh và phát triển của nấm Corynespora cassiicola trên 
cây cao su  14 
1.5. Đặc điểm sinh lý, sự xâm nhiễm, lây lan và lưu tồn của nấm 
Corynespora cassiicola ...... 15 
1.6. Nghiên cứu về đa dạng di truyền của nấm Corynespora cassiicola bằng 
chỉ thị phân tử . 16 
1.6.1. Sự đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của nấm Corynespora 
cassiicola . 16 
1.6.2. Các chỉ thị phân tử được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 
nấm Corynespora cassiicola ... 18 
1.6.2.1. Chỉ thị phân tử RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 19 
1.6.2.2. Chỉ thị phân tử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .. 19 
1.6.2.3. Chỉ thị phân tử ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) ... 20 
1.6.2.4. Phân tích trình tự vùng rDNA-ITS ..................................................... 21 
1.6.2.5. Chỉ thị phân tử SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism) 24 
1.7. Độc tố cassiicolin của nấm Corynespora cassiicola ................................ 25 
1.7.1. Vai trò của độc tố cassiicolin ................................................................ 25 
1.7.2. Cấu trúc và đặc tính của độc tố cassiicolin ............................................ 26 
1.7.3. Mối liên hệ giữa cassiicolin, tính gây bệnh của nấm Corynespora 
cassiicola và tính kháng của ký chủ ................................................................ 27 
1.8. Nghiên cứu về đa dạng di truyền gen mã hóa độc tố cassiicolin (gen 
Cas) của nấm Corynespora cassiicola ....... 28 
1.9. Nghiên cứu về tính gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola ....... 30 
1.10. Khái lược về tương tác ký sinh – ký chủ trong bệnh cây ... 31 
1.10.1. Thuyết “gen for gen”.... 31 
1.10.2. Tính kháng của ký chủ ........................................................................ 32 
1.10.3. Phản ứng siêu nhạy cảm (HR: hypersensitivity response) ... 34 
ix 
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 36 
2.1. Nội dung nghiên cứu............................................................................... 36 
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 36 
2.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 37 
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 45 
2.4.1. Thu thập mẫu bệnh và phân lập nấm ..... 45 
2.4.2. Khảo sát đặc điểm hình thái nấm Corynespora cassiicola .................... 45 
2.4.3. Phân tích đa dạng di truyền nấm Corynespora cassiicola ................ 46 
2.4.3.1. Ly trích DNA nấm Corynespora cassiicola....................................... 46 
2.4.3. ...  DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 9.70667 4.85333 1.13 0.3399 
 D 11 10790.12083 980.92008 229.19 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 9.70667 4.85333 1.13 0.3399 
 D 11 10790.12083 980.92008 229.19 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 22 
 Error Mean Square 4.28 
185 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N D (DVT) 
 A 76.867 3 12 
 B 31.933 3 1 
 C 23.033 3 9 
 D C 20.800 3 2 
 D C 19.467 3 5 
 D E 17.000 3 8 
 E 14.200 3 11 
 E 13.300 3 7 
 E 13.300 3 6 
 E 13.300 3 3 
 E 13.300 3 4 
 E 12.400 3 10 
------------------------------------------------ M=4 (CoryKT04) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 13 12619.86111 970.75855 149.92 <.0001 
 Error 22 142.45111 6.47505 
 Corrected Total 35 12762.31222 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.988838 9.648834 2.544612 26.37222 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 2.84222 1.42111 0.22 0.8047 
 D 11 12617.01889 1147.00172 177.14 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 2.84222 1.42111 0.22 0.8047 
 D 11 12617.01889 1147.00172 177.14 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 22 
 Error Mean Square 6.475051 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N D (DVT) 
 A 79.133 3 12 
 B 42.733 3 1 
 B 42.333 3 2 
 C 24.067 3 9 
 D C 19.400 3 11 
 D C 19.033 3 3 
 D E 16.400 3 10 
 D E 15.667 3 4 
 D E 15.667 3 5 
 D E 15.433 3 6 
 D E 14.200 3 8 
 E 12.400 3 7 
186 
------------------------------------------------ M=5 (CoryBT17) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 13 11345.32944 872.71765 142.90 <.0001 
 Error 22 134.35611 6.10710 
 Corrected Total 35 11479.68556 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.988296 10.23765 2.471254 24.13889 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 11.44389 5.72194 0.94 0.4069 
 D 11 11333.88556 1030.35323 168.71 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 11.44389 5.72194 0.94 0.4069 
 D 11 11333.88556 1030.35323 168.71 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 22 
 Error Mean Square 6.107096 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N D (DVT) 
 A 79.633 3 12 
 B 33.033 3 4 
 C 26.000 3 2 
 D C 23.067 3 1 
 D C 21.433 3 9 
 D E 19.600 3 10 
 D E F 17.700 3 3 
 D E F 17.067 3 11 
 E F 14.033 3 5 
 F 13.300 3 7 
 F 12.400 3 6 
 F 12.400 3 8 
------------------------------------------------ M=6 (CorySL02) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Class Level Information 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 13 8455.391944 650.414765 83.70 <.0001 
 Error 22 170.951111 7.770505 
 Corrected Total 35 8626.343056 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.980183 8.030107 2.787563 34.71389 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 45.768889 22.884444 2.95 0.0736 
 D 11 8409.623056 764.511187 98.39 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 45.768889 22.884444 2.95 0.0736 
 D 11 8409.623056 764.511187 98.39 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 22 
 Error Mean Square 7.770505 
187 
Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N D 
 A 78.000 3 12 
 B 47.267 3 2 
 C B 41.167 3 1 
 C D 37.233 3 8 
 E D 34.333 3 9 
 E D 34.000 3 6 
 E F 27.933 3 4 
 F 26.867 3 11 
 G F 24.600 3 5 
 G F 23.067 3 10 
 G F 22.533 3 3 
 G 19.567 3 7 
Xét theo từng DVT cao su 
------------------------------------------------ D=1 (RRIV 1) -----------------------------------------
- 
The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 854.3633333 122.0519048 20.16 <.0001 
 Error 10 60.5366667 6.0536667 
 Corrected Total 17 914.9000000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.933832 7.003093 2.460420 35.13333 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 0.3033333 0.1516667 0.03 0.9753 
 M 5 854.0600000 170.8120000 28.22 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 0.3033333 0.1516667 0.03 0.9753 
 M 5 854.0600000 170.8120000 28.22 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 6.053667 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M (MPL) 
 A 42.733 3 4 
 A 41.167 3 6 
 A 40.033 3 2 
 B 31.933 3 3 
 B 31.867 3 1 
 C 23.067 3 5 
------------------------------------------------ D=2 (RRIV 106) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 1880.380556 268.625794 85.60 <.0001 
 Error 10 31.382222 3.138222 
 Corrected Total 17 1911.762778 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.983585 5.200954 1.771503 34.06111 
188 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 7.697778 3.848889 1.23 0.3339 
 M 5 1872.682778 374.536556 119.35 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 7.697778 3.848889 1.23 0.3339 
 M 5 1872.682778 374.536556 119.35 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 3.138222 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 47.267 3 6 
 B 42.367 3 2 
 B 42.333 3 4 
 C 26.000 3 5 
 C 25.600 3 1 
 D 20.800 3 3 
------------------------------------------------ D=3 (RRIV 109) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 152.5122222 21.7874603 9.51 0.0010 
 Error 10 22.8988889 2.2898889 
 Corrected Total 17 175.4111111 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.869456 8.464351 1.513238 17.87778 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 1.8477778 0.9238889 0.40 0.6784 
 M 5 150.6644444 30.1328889 13.16 0.0004 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 1.8477778 0.9238889 0.40 0.6784 
 M 5 150.6644444 30.1328889 13.16 0.0004 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 2.289889 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M (MPL) 
 A 22.533 3 6 
 B A 19.033 3 1 
 B A 19.033 3 4 
 B 17.700 3 5 
 B C 15.667 3 2 
 C 13.300 3 3 
189 
------------------------------------------------ D=4 (RRIV 114) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 1175.503333 167.929048 13.11 0.0003 
 Error 10 128.056667 12.805667 
 Corrected Total 17 1303.560000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.901764 14.33311 3.578501 24.96667 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 45.250000 22.625000 1.77 0.2203 
 M 5 1130.253333 226.050667 17.65 0.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 45.250000 22.625000 1.77 0.2203 
 M 5 1130.253333 226.050667 17.65 0.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 12.80567 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 33.867 3 2 
 A 33.033 3 5 
 A 27.933 3 6 
 A 26.000 3 1 
 B 15.667 3 4 
 B 13.300 3 3 
------------------------------------------------ D=5 (RRIV 124) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 249.5772222 35.6538889 8.03 0.0020 
 Error 10 44.3922222 4.4392222 
 Corrected Total 17 293.9694444 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.848990 12.11275 2.106946 17.39444 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 4.5077778 2.2538889 0.51 0.6166 
 M 5 245.0694444 49.0138889 11.04 0.0008 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 4.5077778 2.2538889 0.51 0.6166 
 M 5 245.0694444 49.0138889 11.04 0.0008 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 4.439222 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 24.600 3 6 
 B A 19.467 3 3 
 B 16.400 3 1 
 B 15.667 3 4 
 B 14.200 3 2 
 B 14.033 3 5 
190 
------------------------------------------------ D=6 (DVT 206) ---------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 1083.475556 154.782222 23.82 <.0001 
 Error 10 64.982222 6.498222 
 Corrected Total 17 1148.457778 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.943418 13.63998 2.549161 18.68889 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 22.697778 11.348889 1.75 0.2236 
 M 5 1060.777778 212.155556 32.65 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 22.697778 11.348889 1.75 0.2236 
 M 5 1060.777778 212.155556 32.65 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 6.498222 
 Number of Means 2 3 4 5 6 
 Critical Range 6.596 6.874 7.049 7.169 7.257 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 34.000 3 6 
 B 22.967 3 1 
 C 15.433 3 4 
 C 14.033 3 2 
 C 13.300 3 3 
 C 12.400 3 5 
------------------------------------------------ D=7 (RRIV 209) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 115.6700000 16.5242857 6.07 0.0057 
 Error 10 27.2300000 2.7230000 
 Corrected Total 17 142.9000000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.809447 11.40658 1.650152 14.46667 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 11.9233333 5.9616667 2.19 0.1627 
 M 5 103.7466667 20.7493333 7.62 0.0034 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 11.9233333 5.9616667 2.19 0.1627 
 M 5 103.7466667 20.7493333 7.62 0.0034 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 2.723 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 19.567 3 6 
 B 14.933 3 2 
 B 13.300 3 1 
 B 13.300 3 3 
 B 13.300 3 5 
 B 12.400 3 4 
191 
------------------------------------------------ D=8 (RRIV 230) --------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 1637.310556 233.901508 39.05 <.0001 
 Error 10 59.892222 5.989222 
 Corrected Total 17 1697.202778 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.964711 10.85807 2.447289 22.53889 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 38.907778 19.453889 3.25 0.0819 
 M 5 1598.402778 319.680556 53.38 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 38.907778 19.453889 3.25 0.0819 
 M 5 1598.402778 319.680556 53.38 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 5.989222 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 37.233 3 6 
 A 33.133 3 2 
 B 21.267 3 1 
 C B 17.000 3 3 
 C 14.200 3 4 
 C 12.400 3 5 
------------------------------------------------ D=9 (PB 255) ----------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 599.0233333 85.5747619 16.41 <.0001 
 Error 10 52.1366667 5.2136667 
 Corrected Total 17 651.1600000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.919933 9.913222 2.283345 23.03333 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 29.3233333 14.6616667 2.81 0.1074 
 M 5 569.7000000 113.9400000 21.85 <.0001 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 29.3233333 14.6616667 2.81 0.1074 
 M 5 569.7000000 113.9400000 21.85 <.0001 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 5.213667 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 34.333 3 6 
 B 24.067 3 4 
 C B 23.033 3 3 
 C B 21.433 3 5 
 C B 18.367 3 1 
 C 16.967 3 2 
192 
------------------------------------------------ D=10 (PB 312) ---------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 272.7983333 38.9711905 10.40 0.0007 
 Error 10 37.4666667 3.7466667 
 Corrected Total 17 310.2650000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.879243 11.69565 1.935631 16.55000 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 5.7733333 2.8866667 0.77 0.4884 
 M 5 267.0250000 53.4050000 14.25 0.0003 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 5.7733333 2.8866667 0.77 0.4884 
 M 5 267.0250000 53.4050000 14.25 0.0003 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 3.746667 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 23.067 3 6 
 B A 19.600 3 5 
 B C 16.400 3 4 
 B C 15.667 3 2 
 C 12.400 3 3 
 C 12.167 3 1 
------------------------------------------------ D=11 (PB 260) ---------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 422.5722222 60.3674603 8.34 0.0017 
 Error 10 72.3855556 7.2385556 
 Corrected Total 17 494.9577778 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.853754 15.29634 2.690456 17.58889 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 26.5877778 13.2938889 1.84 0.2093 
 M 5 395.9844444 79.1968889 10.94 0.0008 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 26.5877778 13.2938889 1.84 0.2093 
 M 5 395.9844444 79.1968889 10.94 0.0008 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 7.238556 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 26.867 3 6 
 B 19.400 3 4 
 B 17.067 3 5 
 B 15.600 3 1 
 B 14.200 3 3 
 B 12.400 3 2 
193 
------------------------------------------------ D=12 (RRIV 4) ---------------------------------------- 
 The GLM Procedure 
 Sum of 
 Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 
 Model 7 87.1100000 12.4442857 1.09 0.4351 
 Error 10 114.0500000 11.4050000 
 Corrected Total 17 201.1600000 
 R-Square Coeff Var Root MSE CSB Mean 
 0.433038 4.322264 3.377129 78.13333 
 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 62.74333333 31.37166667 2.75 0.1117 
 M 5 24.36666667 4.87333333 0.43 0.8198 
 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 
 K 2 62.74333333 31.37166667 2.75 0.1117 
 M 5 24.36666667 4.87333333 0.43 0.8198 
 Alpha 0.01 
 Error Degrees of Freedom 10 
 Error Mean Square 11.405 
 Means with the same letter are not significantly different. 
 Duncan Grouping Mean N M 
 A 79.633 3 5 
 A 79.133 3 4 
 A 78.733 3 2 
 A 78.000 3 6 
 A 76.867 3 3 
 A 76.433 3 1