Khảo sát các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời một số kháng sinh họ β - Lactam bằng phương pháp điện di

Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299
295 
KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH 
ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI 
Nguyễn Thị Ánh Tuyết1, Nguyễn Văn Ri2 
 1 Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên 
2
 Đại học quốc gia Hà Nội 
TÓM TẮT 
Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao 
quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ 
silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 
6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin 
được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng 
sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2- 
105,8%. 
Từ khóa: Mao mạch phát hiện giới hạn, phục hồi 
MỞ ĐẦU 
β- lactam được dùng như các thuốc kháng 
khuẩn từ hơn 80 năm nay mà vẫn là một 
nhóm quan trọng của kháng sinh. Mỗi loại 
kháng sinh lại có tác dụng nhất định, có thể 
hạn chế hay tiêu diệt được mầm bệnh trong y 
học, chăn nuôi hay sản xuất[1]. Tuy nhiên 
liều lượng của nó cũng để lại hậu quả rất lớn 
đối với sức khỏe của con người, do đó việc 
xác định hàm lượng kháng sinh là rất cần 
thiết. Bên cạnh kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng 
cao, điện di mao quản cũng là một kỹ thuật 
đầy triển vọng để tách các chất phân tích có 
mang điện tích cũng như trung tính và được 
ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau. 
Trong những năm gần đây phương pháp này 
đã thu hút rất nhiều nhà khoa học bởi những 
ưu điểm nổi bật như kỹ thuật dể sử dụng, tính 
linh hoạt cao, tiết kiệm hóa chất và khả năng 
tách tốt hơn nữa phương pháp cũng cho độ tin 
cậy cao[2,3]. 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi công bố điều 
kiện tách và xác định một số kháng sinh họ β 
– lactam bằng phương pháp điện di mao quản 
điện động học kiểu mixen(dùng mao quản 
Highsensitip). 
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Phương pháp tách và xác định các β-Lactam 
sử dụng chất hoạt động bề mặt, sodium 
dodecyl sunfate- SDS làm pha tĩnh, là các 
mixen mang điện tích âm, còn gọi là các pha 
tĩnh giả. Các mixen mang tính anion, được 
pha chế trong dung dịch đệm, chứa trong mao 
quản hẹp bằng silic, có đường kính 50 µm. 
Áp vào hai đầu mao quản trường điện áp cao 
(10-30KV), khi đó dung dịch đệm di chuyển 
từ cực dương sang cực âm, các mixen cũng di 
chuyển về phía cực âm nhưng có tốc độ khác 
với tốc độ dung dịch đệm. Các mixen có chức 
năng hấp thu các chất phân tích ở mức độ 
khác nhau tùy thuộc vào tính tương tự về độ 
phân cực giữa các mixen và từng chất phân tích.
Hình 1. Tách các β-Lactam bằng phương pháp MEKC* 
*
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 
Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299
296 
Nhờ sự phân bố khác nhau, các β-Lactam di 
chuyển với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau. 
Điều kiện rất quan trọng là giá trị pH, nồng 
độ đệm, thế điện di để phương pháp tách có 
hiệu quả cao nhất. 
THỰC NGHIỆM 
Thiết bị và hóa chất 
- Máy điện di model 1602A của hãng Agilent, 
HP3D, detector DAD, mao quản silica trần 
d=50µm, chiều dài 75.5 cm, hiệu dụng 70 cm. 
- Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat 
Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt SDS, 
NaOH  của hãng Merk. Nước deion được 
lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore. 
Các chất chuẩn: amoxicillin – AMO, 
ampicillin – AMP, penicillin G – PENG, 
oxacillin – OXA, cloxacillin – CLO, 
cephalexin – CEP, do Viện kiểm nghiệm Bộ 
Y tế cung cấp 
Nghiên cứu điều kiện tách các β- Lactam 
bằng phương pháp điện di. 
Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di đến 
khả năng tách các β- Lactam 
Nghiên cứu này, ảnh hưởng của pH trong 
dung dịch đệm điện di được khảo sát với 
dung dịch điện di chứa các chất kháng sinh 
cùng nồng độ 2 µg/ml, 15mM đệm Borat + 
75mM SDS. Mao quản được đặt ở nhiệt độ 
280C, điện áp phân cực 22kV. Mẫu được bơm 
ở áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s. 
Các giá trị pH thay đổi là 6,5; 6,8; 7,0; 7,2. 
Trong nghiên cứu này, cặp CEP-AMP có ∆t 
giảm dần theo chiều tăng của pH, cặp OXA-
CLO có ∆t thay đổi không đáng kể. Sự thay 
đổi pH làm thay đổi lớp điện kép của thành 
mao quản, do đó làm ảnh hưởng đến sự điện 
di của các chất. 
Như vậy tăng pH của dung dịch đệm, rút ngắn 
thời gian phân tích, tuy nhiên khả năng tách 
giảm, nên phải chọn một giá tri pH phù hợp. 
Ở pH = 6,5 các β- Lactam tách tốt nhưng có 
một píc nhỏ dính vào píc của PEN-G làm cho 
diện tích của píc không chính xác nên chúng 
tôi chọn pH = 6,8 để tách các β-Lactam trong 
những nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát ảnh 
hưởng của nồng độ đệm. 
Chất điện ly trong pha động cũng có vai trò 
quan trọng vì nó là chất dẫn điện, tạo dòng 
điện di thẩm thấu. Trong thực tế, người ta cố 
gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính 
là chất điện giải của sắc ký điện di. Chúng tôi 
chọn Natritetraborat vừa là chất đệm pH vừa 
là chất điện giải. 
Khảo sát nồng độ đệm tại 4 gía trị là 10mM; 
15mM; 20 mM; 25mM với 75mM SDS, pH = 
6,8. Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 
50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao 
quản 250C Các chất kháng sinh cùng nồng độ 
1µg/ml. Kết quả cho thấy tăng nồng độ đệm 
thì độ điện di hiệu dụng của 6 kháng sinh β-
Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan 
tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt. 
Theo dõi sự chênh lệch thời gian lưu (∆tR) 
của các cặp: CEP-AMP; PENG- OXA cho 
thấy quy luật biến đổi ∆tR theo nồng độ dung 
dịch đệm cũng không giống nhau (bảng 2). 
Nồng độ đệm 20mM, lực ion thấp hơn, giảm 
được dòng điện di, tăng sự hấp phụ của mẫu 
lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các 
chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, 
hai pic của CEP và AMP dính vào nhau. 
Chúng tôi chọn nồng độ 15mM đệm Borat là 
điều kiện tối ưu. 
Bảng 1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam 
pH Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút 
 t0 AMO PENG OXA CLO CEP AMP 
7,2 6,253 7,889 10,283 10,699 11,717 12,448 12,754 
Khoảng cách 2 pic, ∆tR 0,416 1,018 0,731 0,306 
7,0 6,960 8,896 11,345 11,613 12,612 13,404 13,972 
Khoảng cách 2 pic ,∆tR 0,268 0,999 0,792 0,568 
6,8 7,368 9,466 12,342 12,908 14,229 14,793 15,525 
Khoảng cách 2 pic, ∆tR 0,566 1,321 0,564 0,732 
6,5 7,594 9,505 12,536 13,160 14,622 15,967 16,772 
Khoảng cách 2 pic, ∆tR 0,624 1,362 1,345 0,805 
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 
Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299
297 
Bảng 2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút) 
Nồng độ 
đệm 
Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút 
t0 AMO PENG OXA CLO CEP AMP 
10 mM 6,958 8,896 11,345 11,613 12,612 13,404 13,972 
 ∆tR của 2 β-Lactam 0,268 0,586 
15 mM 7,363 9,375 12,087 12,881 14,178 14,990 15,825 
 ∆tR của 2 β-Lactam 0,794 0,835 
20 mM 7,403 9,576 12,238 12,542 14,231 16,013 16,082 
 ∆tR của 2 β-Lactam 0,304 0,069 
25 mM 7,505 10,012 12,879 12,932 15,375 16,873 16,934 
 ∆tR của 2 β-Lactam 0,053 0,061 
Hình 2. Sắc đồ điện di của 6 kháng sinh họ β-lactam tại điều kiện tối ưu: pH = 6,8; 15 mM đệm borat, 
75 mM SDS, thế 22 kV, nhiệt độ mao quản 250C, bơm mẫu 8s, nồng độ các chất 2µg/ml. Thứ tự các 
chất: 1- AMO; 2- PENG; 3-OXA; 4-CLO; 5-CEP và 6- AMP 
Khảo sát ảnh hưởng của thế điện di và các 
điều kiện khác 
Khi tăng thế điện từ 18kV đến 25kV thì thời 
gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm 
do độ linh động điện di tỷ lệ thuận với thế. 
Mặt khác thế càng cao, nhiệt sinh ra trong 
mao quản càng tăng, làm cho sự chênh lệch 
nhiệt độ giữa thành mao quản và trong lòng 
của nó, dẫn đến độ nhớt chênh lệch đây chính 
là nguyên nhân làm giảm hiệu quả tách. Tại 
thế 18kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, 
nhưng thời gian lưu lớn (20,6 phút cho AMP), 
nhưng thế 25kV thời gian lưu ngắn hơn 
nhưng hiệu quả tách kém hơn, pic CEP và 
CLO dính chân vào nhau. Vì vậy chúng tôi 
chọn thế tại 22kV là phù hợp nhất để tách các 
β-Lactam. 
Để có được píc rõ ràng và độ hấp thụ píc cao 
nhất thì thời gian bơm mẫu cần 8s cho nồng 
độ từ 0,2- 15 µg/ml ,nồng độ SDS 75mM, 
nhiệt độ mao quản 250C 
Đánh giá phương pháp phân tích. 
Tiến hành lập đường chuẩn của 6 chất kháng 
sinh β-lactam tại các nồng độ khác nhau: với 
AMO, CEP, CLO thì nồng độ khảo sát từ 0,2-
10µg/ml còn các chất AMP, OXA và PEN-G 
nồng độ khảo sát từ 0,3-10µg/ml. Mỗi nồng 
độ được đo lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung 
bình. Sử dụng origin 8.0 xử lý, kết quả thu 
được trình bày ở bảng 3. 
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp 
phân tích, chúng tôi tiến hành chọn 3 mẫu 
tương ứng với điểm đầu, điểm giữa và điểm 
cuối của khoảng tuyến tính đó là 1µg/ml; 
5µg/ml và 10µg/ml. Tiến hành đo các mẫu 
trên với điều kiện tối ưu, mỗi mẫu đo lặp lại 5 
lần. Kết quả cho thấy độ chính xác nằm trong 
giới hạn cho phép <15%. Do đó chúng tôi áp 
dụng phương pháp này vào phân tích mẫu 
dược phẩm. 
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 
Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299
298 
Bảng 3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 
Chất phân 
tích 
Phương trình 
y = Ax+ B 
R Độ lệch chuẩn 
(Sy) 
LOD 
µg/ml 
LOQ 
µg/ml 
AMO y = 12,615x-1,7269 0,9991 1,3864 0,329 1,099 
CEP y = 8,654x-1,5316 0,9989 1,0800 0,774 1,248 
AMP y = 6,792x+ 0,1066 0,9998 0,3152 0,139 0,464 
CLO y = 10,229x- 1,1174 0,9995 0,8230 0,241 0,805 
OXA y = 10,690x- 2,1239 0,9978 1,8672 0,524 1,747 
PEN-G y = 5,697x- 0,1909 0,9988 0,7213 0,379 1,266 
Bảng 4. Kết quả tính hàm lượng kháng sinh trong mẫu dược phẩm 
Tên thuốc, 
hoạt chất 
∆C 
Chiều cao 
pic 
(mAU) 
Cx 
%H 
Hiệu suất 
trung bình 
%H 
Khối lượng 
TB 1 viên 
thuốc (mg) 
Khối lượng (mg) 
Trên 
nhãn 
Tìm 
thấy 
Ampicillin 
(AMP) 
0 11,5 
1,48 
94,27 
593,2 
500 
438,97 1 18,4 88,8 
2 26,6 97,0 
3 34,1 97,0 
Amoxicilin 
(AMO) 
0 13,1 
1,13 
97,93 
307,0 
250 
346,90 1 24,4 97,5 
2 35,6 97,1 
3 47,6 99,2 
Cloxacillin 
(CLO) 
0 9,9 
 1,02 
94,17 
307,0 
250 
313,14 1 18,6 89,6 
2 28,8 97,4 
3 37,7 95,5 
Oxacillin 
Sodium 
Capsule 
(OXA) 
0 22,3 2,24 
94,70 
 582,2 
500 
642,43 1 31,5 92,4 
2 40,8 92,9 
3 51,8 98,8 
Cephalexin 
(CEP) 
0 14,6 
1,85 
105,80 
560,5 
500 
518,46 1 23,2 109,8 
2 31,3 105,8 
3 38,7 101,8 
Hình 3. Sắc đồ điện di của mẫu thuốc chứa amoxicilin và cloxacillin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 
Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299
299 
Phân tích mẫu dược phẩm. 
Các mẫu dược phẩm AMO,CLO, AMP, CEP, 
OXA được mua từ các đại lý dược khác nhau. 
Mẫu phân tích được chuẩn bị bằng cách trộn 
đều 4 viên con nhộng, lấy mẫu đại diện, đem 
cân khối lượng thích hợp m=0,02(g) hòa tan 
bằng nước đêion, siêu âm trong vòng 15 phút, 
định mức trong bình 20ml bằng nước đêion. 
Rồi lọc qua màng lọc 0,45µm. Hút 2,5ml dịch 
lọc pha loãng 100 lần ta được dung dịch B 
(bµg/ml). Từ dung dịch B pha thành dung 
dịch có nồng độ thấp hơn (Cxµg/ml) được 
dùng trong ngày. Tiến hành đo bằng phương 
pháp thêm chuẩn đối với 5 mẫu thuốc, chạy 
lặp lại mỗi mẫu phân tích 3 lần với điều kiện 
tối ưu như chạy đường chuẩn, lấy kết quả 
trung bình, sử lý bằng phần mềm origin 8 và 
excel, kết quả thu được ở bảng 4. 
KẾT LUẬN 
Chúng tôi đã đưa ra một phương pháp có độ 
tin cậy dựa trên quá trình điện di dùng 
detector DAD để phát hiện, xác định đồng 
thời 6 chất kháng sinh β-lactam. Rồi áp dụng 
phương pháp này vào xác định hàm lượng 
kháng sinh trong mẫu dược phẩm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Vũ Thị Bảy – Nguyễn Châu Hải – Doãn Huy 
Khắc – Nguyễn Thị Tâm – Định lượng kháng 
sinh, Nhà xuất bản Y học (1983). 
[2] M. I. Bailon-Perez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. 
Cruces-Blanco, Journal of Pharmaceutical and 
Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752. 
[3] W.J. Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy D.G, 
Analyst, 119(12), (1994) 2595-2601. 
Công trình được sự tài trợ của đề tài QG 11.14 
SUMMARY 
STUDY OF CONDITION OF SEPARATION AND DETERMINATION OF 
β -LACTAM ANTIBIOTICS BY CAPILLARY ELECTROKINETIC 
CHROMATOGRAPHY 
Nguyen Thi Anh Tuyet*1, Nguyen Van Ri2 
 1 College of Medicine and Pharmacy - TNU 
2
 Hanoi National University 
In the study, condition of seperation of β – lactam antibiotics by capillary electrokinetic 
chromatography is investigated. The electrophoresis system is 1602A 3D from Agilent. The 
capillary is coating silica with 75,5cm length, 50µm id. The background electrolyte is solution of 
Natritetraborat 15mM with 75mM SDS, pH of 6,8. Amoxicilin, Ampicillin, Cloxacillin, Oxacillin, 
Penicillin-G, Cephalexin, ampicillin are separated in 16 minutes. Limit of detection (LOD) of 
method is ≤ 0,7µg /ml for each. The method is applied for detemination of β – lactam antibiotics in 
pharmaceutical products, recovery is from 94,2 -105,8%. 
Keyword: capillary electrokinetic, detection limits, recovery 
*
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên