Luận án Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α- Glucosidaza từ aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
NGUYỄN ĐỨC TIẾN 
NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM 
α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE 
VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
Hà Nội - 2015 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
NGUYỄN ĐỨC TIẾN 
NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM 
α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE 
VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 62420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 
2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ 
Hà Nội - 2015
 LỜI CẢM ƠN 
Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự 
giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các Thầy Cô, bạn đồng nghiệp và 
các Cơ quan. 
Trước hết cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Giáo Sư Tiến Sĩ 
Hoàng Đình Hòa, Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Quản Lê Hà, là những người đã hướng dẫn, 
chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. 
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau 
thu hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giúp đỡ tôi trong quá 
trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Tôi xin cảm ơn Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội đã cấp kinh phí cho tôi, 
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các Thầy cô của Viện Công Nghệ Sinh Học 
Thực Phẩm - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình 
làm luận án. 
Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp đã cùng tôi làm việc và động viên giúp đỡ 
tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo Sư, Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ là chủ tịch hội 
đồng, phản biện và Ủy viên hội đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc và 
tham gia hội đồng chấm luận án này với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, 
giúp tôi hoàn tất tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án. 
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời biết ơn đến bố mẹ, gia đình và người thân của tôi 
với tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đường để 
hoàn thành được luận án nghiên cứu này. 
 Tác giả luận án 
NGUYỄN ĐỨC TIẾN 
 LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số 
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất 
kỳ công trình nào khác. 
Tập thể giáo viên hướng dẫn 
1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 
2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ 
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2015 
Tác giả luận án 
NGUYỄN ĐỨC TIẾN 
 MỤC LỤC 
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1 
2. Nội dung .............................................................................................................................. 2 
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3 
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án ............................... 4 
5. Bố cục luận án ..................................................................................................................... 5 
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 6 
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ............................................................................................. 6 
1.1.1. Khái niệm ĐTĐ ............................................................................................................. 6 
1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ ................................................................................... 7 
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể ......... 8 
1.2.1. Enzyme α-glucosidase ................................................................................................... 8 
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme....................................................................................................... 8 
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase ......................................................................... 8 
1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ.................................................... 9 
1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) .............................. 11 
1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp .................................................................................................. 12 
1.3.2. AGIs từ động vật ......................................................................................................... 12 
1.3.3. AGIs từ thực vật .......................................................................................................... 12 
1.3.4. AGIs từ vi sinh vật ....................................................................................................... 14 
1.3.5. AGIs từ A.oryzae ......................................................................................................... 15 
1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ........................................................ 16 
1.4.1. Đỗ đen ......................................................................................................................... 16 
1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ............................................................................ 17 
1.5. A.oryzae và lên men bề mặt ............................................................................................ 19 
 1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae ....................................................................................... 19 
1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng 
A.oryzae ................................................................................................................................. 21 
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon .................................................................................. 22 
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................................... 23 
1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng .............................................................. 23 
1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng 
A.oryzae ................................................................................................................................. 24 
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................. 24 
1.5.3.2. Độ ẩm môi trường .................................................................................................... 24 
1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí ......................................................................................... 25 
1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường ..................................................................... 25 
1.5.3.5. Tỷ lệ giống ................................................................................................................ 26 
1.5.3.6. Thời gian lên men ..................................................................................................... 27 
1.6. Thu nhận AGIs ............................................................................................................... 27 
1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men ............................................... 27 
1.6.2. Tinh sạch AGIs ............................................................................................................ 29 
1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất ........................................................................ 30 
1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới ................ 35 
1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam ................................................................... 39 
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 41 
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 41 
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu ................................................................................. 41 
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................... 41 
2.1.3. Môi trường ................................................................................................................... 42 
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống ............................................................. 42 
2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus ......................................................... 42 
 2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn ................................................................................. 42 
2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống ........................................................................ 42 
2.1.3.5. Đỗ đen lên men ......................................................................................................... 43 
2.1.4. Thiết bị ......................................................................................................................... 43 
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................................ 43 
2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 43 
2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................ 43 
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc ................................................................................... 44 
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc ........................................................... 44 
2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................. 44 
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo 
phương pháp của Yamaki và Mori (2006) ............................................................................. 44 
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi ...... 45 
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và 
cộng sự, (1999) ...................................................................................................................... 45 
2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50) ......................................................... 45 
2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm 
thực phẩm .............................................................................................................................. 46 
2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan ................................................................................ 46 
2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật ........... 47 
2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm .............................................. 47 
2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... 47 
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48 
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................................... 48 
2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .................................. 49 
2.3.2.1. Phân lập A.oryzae..................................................................................................... 49 
2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................ 50 
 2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 
- 5,8S - ITS2 ........................................................................................................................... 50 
2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân 
giống trên môi trường rắn ...................................................................................................... 52 
2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 
2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 
2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 
2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 
2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ................... 52 
2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 53 
2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6.................. 53 
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .............. 53 
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành 
AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 53 
2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến 
khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................ 53 
2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường 
lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................... 53 
2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs 
bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 
2.3.4.5. Ảnh  ... cture from the Ayurvedic traditional medicine Salacia 
reticulata in Sri Lanka and India”, Tetrahedron Letters, 38, No. 48, pp. 8367-8370. 
166. Young-Min Kim, Wataru Saburi, Shukun Yu, Hiroyuki Nakai, Janjira Maneesan, 
Min-Sun Kang, Seiya Chiba, Doman Kim, Masayuki Okuyama, Haruhide Mori, and 
Atsuo Kimura (2012), “A novel metabolic pathway for glucose production mediated 
by α-glucosidase-catalyzed conversion of 1,5-anhydrofructose”, Published online, pp. 
22441-22444. 
167. Yun-Ping Zhu, Li-Jun Yin, Yong-Qiang Cheng, Kohji Yamaki, Yutaka Mori, Yi-
Cheng Su, Li-Te Li (2008), “Effects of sources of carbon and nitrogen on production 
of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2”, Food 
Chemistry, 109, pp. 737–742. 
168. Zheng L., Sun D.-W. (2006), “Innovative applications of power ultrasound during 
food freezing processes – a review”, Trends Food Sci. Techn, 17, pp. 16-23. 
169. Zhu Yunping, Li Xiuting, Huang Zhigang, Li Lite and Su Yicheng (2011), 
"Improving Anti-α-Glucosidase Activity of Douchi Koji Using a Newly Isolated 
Strain of Bacillus subtilis B2", International Journal of Food Engineering, 7 (1), pp. 
1556-3758. 
. 
141 
PHỤ LỤC 
Đặc điểm phân loại hình thái của chủng Aspergillus spp phân lập được 
Bảng PL.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên các môi trường 
T
T 
Ký hiệu 
chủng 
Đặc điểm Môi trường phát triển 
CYA 20S CZ CYA25 
1 T1 Đường kính khuẩn lạc (mm) 65 49 55 
Mầu sắc bào tử Xám vàng Nâu oliu Xám vàng 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không màu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
2 T2 Đường kính khuẩn lạc (mm) 65 40 53 
Mầu sắc bào tử Vàng Oliu Vàng oliu 
Hệ sợi Mầu trắng, dày đặc Dày, lông nhung Mầu trắng sữa, dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
3 T3 Đường kính khuẩn lạc (mm) 64 42 51 
Mầu sắc bào tử Oliu Nâu oliu Nâu oliu 
Hệ sợi Màu trắng dày Dày Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
4 T4 Đường kính khuẩn lạc (mm) 70 69 65 
Mầu sắc bào tử Xám oliu Nâu oliu Nâu oliu 
Hệ sợi Dày Dày, lông nhung Màu trắng sữa, dày 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Có màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Có 
5 T5 Đường kính khuẩn lạc (mm) 65 49 55 
Mầu sắc bào tử Xám vàng Nâu oliu Xám vàng 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
6 T6 Đường kính khuẩn lạc (mm) 61 61 62 
Mầu sắc bào tử Vàng xanh Vàng xanh Vàng xanh 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
7 T7 Đường kính khuẩn lạc (mm) 70 65 66 
Mầu sắc bào tử Vàng oliu Nâu oliu Nâu oliu 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Có 
8 T8 Đường kính khuẩn lạc (mm) 49 62 68 
Mầu sắc bào tử Vàng oliu Oliu Vàng oliu 
Hệ sợi Mầu trắng, dày Dày, lông nhung Màu trắng sữa, dày,lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
9 T9 Đường kính khuẩn lạc (mm) 68 63 63 
Mầu sắc bào tử Vàng oliu Nâu oliu Nâu oliu 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Có 
10 T10 Đường kính khuẩn lạc (mm) 63 48 54 
Mầu sắc bào tử Xám vàng Nâu oliu Xám vàng 
Hệ sợi Dày, lông nhung Dày, lông nhung Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
11 T11 Đường kính khuẩn lạc (mm) 64 42 54 
Mầu sắc bào tử Vàng Oliu Vàng oliu 
Hệ sợi Mầu trắng, dày đặc Dày, lông nhung Mầu trắng sữa, dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
12 T12 Đường kính khuẩn lạc (mm) 65 43 53 
Mầu sắc bào tử Oliu Nâu oliu Nâu oliu 
Hệ sợi Màu trắng dày Dày Dày, lông nhung 
Mặt sau của khuẩn lạc Không màu Không màu Không mầu 
Hạch nấm, giọt tiết Không Không Không 
142 
12 chủng Aspergillus spp phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên các môi 
trường CZ, CY20S và CYA25 trong 7 ngày để quan sát đặc điểm hình thái bằng 
mắt thường, kết quả được mô tả ở bảng PL.1. 
Quan sát đặc điểm hình thái của 12 chủng Aspergillus spp qua kính hiển vi ở 
vật kính 10, 40 và 100 lần. Các chỉ tiêu quan sát để định loại Aspergillus: Hình dáng 
bông nấm, kích thước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và 
hình dạng bọng đỉnh giá, cuống sinh bào tử, mô tả ở bảng PL.2. 
Bảng PL.2 Cấu trúc vi học của các chủng Aspergillus spp phân lập được 
Chủng 
A.oryzae 
Thể 
bình 
Bào tử trần Bọng đỉnh giá Cuống sinh bào tử 
Hình dạng Đườn
g kính 
(µm) 
Hình 
dạng 
Đườn
g kính 
(µm) 
Đặc điểm Kích thước 
(µm) 
Chủng 
A.oryzae 
(theo 
khóa phân 
loại của 
Klich) 
1 
hoặc 
2 
hàng 
Hình cầu 
đến hình 
trứng, nhẵn 
đến có gai 
nhẹ 
(3,5) 
4-8,5 
(10) 
Hình quả 
lê, hình 
chùy hoặc 
hình cầu 
(8) 22-
50 
(90) 
Sần xùi 500-2500 (5000) 
T1 1 
hàng 
Hình cầu 
nhẵn 
8-10 Hình cầu, 
hình chùy 
12-54 Sần xùi 500-600 x10-18 
T2 1-2 
hàng 
Hình cầu, 
gần cầu có 
gai 
4,5-5,5 Hình cầu 25-65 Sần xùi 600-1300 x12-
20 
T3 2 
hàng 
Hình tròn, 
nhẵn 
5-7 Hình cầu, 
hình quả 
lê 
22-48 Sần xùi 650-1000 x12-
20 
T4 1 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
7-10 Hình cầu, 
hình chùy 
31-47 Sần xùi 600-1300 x10-
12 
T5 1-2 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
5-8 Hình cầu 35-50 Sần xùi 500-700 x12-18 
T6 2 
hàng 
Hình cầu, 
gần cầu có 
gai 
4-6 Hình cầu 
hay gần 
cầu 
36-50 Sần xùi 550-1400 x12-
20 
T7 1 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
6-10 Hình cầu, 
hình chùy 
32-46 Sần xùi 600-1200 x10-
12 
T8 2 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
6-10 Hình cầu, 
hình chùy 
20-28 Sần xùi 600-800 x10-16 
T9 1 
hàng 
Hình cầu 
nhẵn 
8-9 Hình cầu, 
hình chùy 
11-53 Sần xùi 500-600 x11-18 
T10 1-2 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
5-9 Hình cầu 36-52 Sần xùi 500-700 x13-19 
T11 1 
hàng 
Hình cầu, 
nhẵn 
7-10 Hình cầu, 
hình chùy 
33-47 Sần xùi 600-1200 x10-
12 
T12 1-2 
hàng 
Hình cầu, 
gần cầu có 
gai 
4,6-5,6 Hình cầu 26-67 Sần xùi 600-1300 x13-
20 
143 
A.oryzae strain Yz12 18S ribosomal RNA gene, partial sequence 
Sequence ID: gb|JX489381.1| Length: 1030Number of Matches: 1 
Query 1 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 633 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 574 
Query 61 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 573 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 514 
Query 121 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 513 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 454 
Query 181 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 453 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 394 
Query 241 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 393 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 334 
Query 301 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 333 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 274 
Query 361 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 420 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 273 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 214 
Query 421 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTA 480 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| 
Sbjct 213 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTA 154 
Query 481 ATAAATACACCCCTTCC 497 
 ||||||||||||||||| 
Sbjct 153 ATAAATACACCCCTTCC 137 
Hình PL.1 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide của đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 
của chủng T6 với trình tự nucleotide của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu Quốc 
tế với mã số gbJX489381.1 
A.oryzae partial 18S rRNA gene, strain ARD 115 
144 
Sequence ID: emb|FN823241.1|Length: 950Number of Matches: 1 
Query 1 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 652 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 593 
Query 61 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 592 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 533 
Query 121 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 532 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 473 
Query 181 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 472 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 413 
Query 241 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 412 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 353 
Query 301 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 352 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 293 
Query 361 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCA-AGGCCAT 419 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| 
Sbjct 292 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCATAGGCCAT 233 
Query 420 GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCT 479 
 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| 
Sbjct 232 GCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCT 173 
Query 480 AATAAATACACCCCTTCC 497 
 |||||||||||||||||| 
Sbjct 172 AATAAATACACCCCTTCC 155 
Hình PL.2 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide của đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 
của chủng T6 với trình tự nucleotide của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu Quốc 
tế với mã số embFN823241.1 
145 
A.oryzae strain SEMCC-3.248 18S ribosomal RNA gene, partial sequence 
Sequence ID: gb|HM064501.1|Length: 1770Number of Matches: 1 
Query 1 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 60 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 668 GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACT 609 
Query 61 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 120 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 608 ACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCT 549 
Query 121 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 180 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 548 GCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTC 489 
Query 181 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 240 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 488 CAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCG 429 
Query 241 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 300 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 428 GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTC 369 
Query 301 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 360 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 368 CCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATC 309 
Query 361 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 420 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
Sbjct 308 CTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATG 249 
Query 421 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCTA 480 
 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| 
Sbjct 248 CGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTA 189 
Query 481 ATAAATACACCCCTTCC 497 
 ||||||||||||||||| 
Sbjct 188 ATAAATACACCCCTTCC 172 
Hình PL.3 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotide của đoạn ADN vùng ITS1-5,8S-ITS2 
của chủng T6 với trình tự nucleotide của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu Quốc 
tế với mã số gbHM064501.1 
146 
0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Conc.(x10)
1 
2 
3 
4 
5 
 Hình PL.4 Đường chuẩn của chất kìm hãm -
glucosydase 
22.5 25.0 27.5
0
25
50
75
mAU
5(#1) Ch1 280nm
4(#1) Ch1 280nm
3(#1) Ch1 280nm
2(#2) Ch1 280nm
2(#1) Ch1 280nm
1(#1) Ch1 280nm
Hình PL.5 Diện tích các píc trùng nhau sau khi 
chạy HPLC với các nồng độ khác nhau của chất 
kìm hãm -glucosydase 
Từ các vùng diện tích của píc này suy ra được 
đường tuyến tính: 
Y = aX + b 
a = 1.818422e-004 
b = 11.18738 
R^2 = 0.9771138 
R = 0.9884907 
External Standard 
Curve Fit Type:Linear 
Origin:Not Forced 
Weight:None 
Mean RF : 6.020700e-004 
RF SD : 5.854472e-004 
RF %RSD : 97.23906 
Bảng PL.3 Vùng diện tích các píc với nồng độ khác 
nhau của chất kìm hãm -glucosydase 
Level Conc (mg/ml) Area 
1 10 6225 
2 20 31433 
3 30 103323 
4 40 171369 
5 50 204929 
- Định lượng sản phẩm AGIs trong dịch trích ly đỗ đen lên men bằng đường chuẩn 
0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 Area
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Conc.(x10)
1 
2 
3 
4 
5 
Hình PL.6 Nồng độ của sản phẩm sau khi 
lên men bề mặt được chỉ ra trên đường 
chuẩn 
Bảng PL.4 Vùng diện tích của sản phẩm glucosydase 
so sách với đường chuẩn 
Level Conc. Mean Area SD %RSD Area 1 Area 2 
1 10 6225 6225 
2 20 38577 10102.97 26.18913 31433 29862 
3 30 103323 103323 
4 40 171369 171369 
5 50 204929 204929 
147 
Hình PL.7 Đỗ đen xanh lòng nguyên liệu 
Hình PL.8 Cám gạo nguyên liệu 
Hình PL.9 Đỗ đen xanh lòng sau lên men 
bằng A.oryzae T6 
Hình PL.10 Thiết bị chiết xuất bằng 
sóng siêu âm TJS-3000 intelligent 
Ultrasonic Generator V6 (tần số 20 
kHz và công suất tối đa 3000W) 
Hình PL.11. Thử độc tính cấp của chế phẩm 
AGIs 
Hình PL.12. Sản phẩm bột uống liền 
148 
Phụ lục KQ KP: Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ 
đen lên men (đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6) bằng khối phổ 
149 
150 
151 
152 
153 
154 
155 
156 
157 
158