Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 
TRỊNH THỊ QUẾ 
NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A NåNG §é FOLAT, 
HOMOCYSTEIN HUYÕT THANH Vµ MéT Sè §A H×NH GEN 
MTHFR ë PHô N÷ Cã BÊT TH¦êNG SINH S¶N 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
HÀ NỘI – 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 
TRỊNH THỊ QUẾ 
NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A NåNG §é FOLAT, 
HOMOCYSTEIN HUYÕT THANH Vµ MéT Sè §A H×NH GEN 
MTHFR ë PHô N÷ Cã BÊT TH¦êNG SINH S¶N 
Chuyên ngành : Hóa sinh Y học 
Mã số: 62720112 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. GS.TS. Tạ Thành Văn 
2. TS. Đoàn Thị Kim Phượng 
HÀ NỘI – 2021 
LỜI CẢM ƠN 
Để hoàn thành luận án này, trước hết, tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới 
GS. TS. Tạ Thành Văn, Chủ tịch Hội đồng Trường, Trưởng Bộ môn Hóa sinh 
Trường Đại học Y Hà Nội và TS. BS. Đoàn Thị Kim Phượng, Phó chủ nhiệm 
Bộ môn Y sinh học - Di truyền, PGĐ Trung tâm Di truyền lâm sàng và hệ gen, 
Trường Đại học Y Hà Nội, những người thầy đã tận tụy giúp đỡ, động viên và 
hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo 
Sau Đại Học, cùng toàn thể quý Thầy Cô, cán bộ trong Bộ môn Hóa Sinh, 
Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực 
hiện luận án này. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy Cô, các bác sỹ nội trú tại Bộ môn 
Y sinh học – Di Truyền, Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong việc thu 
thập và phân tích mẫu tại bộ môn. 
 Đồng thời, tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Đốc, các cán bộ tại 
Trung tâm xét nghiệm Bệnh viện đa khoa MEDLATEC đã hỗ trợ giúp đỡ tôi 
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 
 Xin được gửi lời cảm ơn đến các đối tượng tham gia nghiên cứu cùng gia 
đình của họ đã giúp tôi có được số liệu trong luận án này. 
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu 
thương của bố mẹ cùng sự ủng hộ, động viên của chồng, hai con và các anh 
chị em trong gia đình, những người đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để 
tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. 
Xin trân trọng cảm ơn! 
Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2021 
Học viên 
Trịnh Thị Quế 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi là Trịnh Thị Quế, nghiên cứu sinh Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên 
ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: 
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn 
của GS.TS. Tạ Thành Văn và TS. Đoàn Thị Kim Phượng 
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã 
được công bố tại Việt Nam. 
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung 
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi 
nghiên cứu. 
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. 
Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2021 
Tác giả luận án 
Trịnh Thị Quế 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Tên viết tắt Ý nghĩa 
APC Activated Protein C Protein C hoạt hóa 
AUC Area Under Cuver Diện tích dưới đường cong 
BAC Balanced Accuracy Độ chính xác cân bằng 
BM Bookmarker informedness Dự đoán cân đối giữa độ nhạy và 
độ đặc hiệu 
BTSS Bất thường sinh sản 
CI Confidence Interval Khoảng tin cậy 
CMIA Chemiluminescent 
Microparticle Immunoassay 
Miễn dịch hóa phát quang 
Cs Cộng sự 
CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên 
FAD Flavin Adenine Dinucleotide 
Hb Hemoglobin 
Hct Hematocrit 
Hcy Homocystein Là một acid amin chứa lưu huỳnh. 
IgF1 Insulin-like Growth Factor -1 Yếu tố tăng trưởng giống Insulin 
Lox1 Lectin like Oxidized LDL 
receptor-1 
Thụ thể LDL-1 bị oxy hóa 
MCH Mean Corpuscular 
Hemoglobin 
Lượng Hb trung bình hồng cầu 
MCHC Mean Corpuscular 
Hemoglobin Concentration 
Nồng độ Hb trung bình hồng cầu 
MCP1 Monocyte Chemoattractant 
Protein 1 
Chất gây xơ vữa động mạch 
MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình của một hồng 
cầu 
MTHFR Methylenetetrahydrofolate 
reductase 
 Là enzym tham gia trong quá 
trình chuyển hóa Hcy 
NCBI National Center for 
Biotechnology Information 
Trung tâm thông tin về công nghệ 
sinh học quốc gia Mỹ 
NNC Nhóm nghiên cứu 
NPV Negative Predictive Value Giá trị dự đoán âm tính 
OR Odds Ratio Tỷ suất chênh 
PKC Protein Kinase C Enzym chuyển hóa Proteine 
PPV Positive Predictive Value Giá trị dự đoán dương tính 
ROC Receiver Operating 
Characteristic 
Đồ thị biểu diễn tỷ lệ dương tính 
đúng dựa trên tỷ lệ dương tính sai 
tại các ngưỡng khác nhau 
RPL Recurrent Pregnancy Loss Mất thai tái phát 
SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn 
SNP Single Nucleotide 
Polymorphisms 
Đa hình đơn nucleotide 
SPC Speccificity Độ đặc hiệu 
TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới 
TGF Transforming Growth Factor Yếu tố thay đổi tăng trưởng 
TNF Tumor Necrosis Factor Yếu tố hoại tử khối u 
TPO-Ab Thyroperoxidase Antibodies Kháng thể kháng tuyến giáp 
TPR True Positive 
Rate (sensitivity) 
Tỷ lệ dương tính đúng (độ nhạy) 
VCAM 1 Vascular Cell Adhesion 
Molecule 1 Cell 
Phân tử kết dính tế bào mạch máu 
MỤC LỤC 
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1 
Chương 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3 
1.1. Tổng quan về bất thường sinh sản .......................................................... 3 
1.1.1. Vô sinh .............................................................................................. 3 
1.1.2. Các bất thường thai sản ..................................................................... 3 
1.1.3. Nguyên nhân của bất thường sinh sản .............................................. 9 
1.1.4. Cơ chế liên quan đến bất thường sinh sản ...................................... 12 
1.2. Vai trò của homocystein, folat và đa hình gen MTHFR ....................... 16 
1.2.1. Vai trò của homocystein ................................................................. 16 
1.2.2. Vai trò của folat .............................................................................. 22 
1.2.3. Đa hình gen MTHFR ...................................................................... 26 
1.3. Các phương pháp định lượng nồng độ homocystein, folat và xác định đa 
hình gen MTHFR .................................................................................. 30 
1.3.1. Các phương pháp định lượng nồng độ Hcy .................................... 30 
1.3.2. Các phương pháp xét nghiệm folat ................................................. 32 
1.3.3. Các phương pháp phát hiện đa hình gen MTHFR. ......................... 33 
1.4. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa homocystein, folat và đa hình gen 
MTHFR ................................................................................................. 35 
1.4.1. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ homocystein, folat 
huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở người khỏe mạnh .............. 35 
1.4.2. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ Hcy, folat và đa hình 
gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản ............................... 36 
1.4.3. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ Hcy, folat huyết thanh 
và đa hình gen MTHFR ở một số bệnh lý khác .............................. 38 
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 40 
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 40 
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu .................................... 40 
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ .......................................................................... 40 
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................. 41 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 41 
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 41 
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ......................................................................... 41 
2.3. Thu thập mẫu và biến số nghiên cứu .................................................... 44 
2.3.1. Các bước tiến hành ......................................................................... 44 
2.3.2. Biến số nghiên cứu.......................................................................... 45 
2.4. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu .................................... 46 
2.4.1. Trang thiết bị, dụng cụ .................................................................... 46 
2.4.2. Hóa chất .......................................................................................... 46 
2.5. Quy trình kỹ thuật ................................................................................. 47 
2.5.1. Quy trình xét nghiệm Hcy, folat ..................................................... 47 
2.5.2. Kiểm soát chất lượng và báo cáo kết quả ....................................... 48 
2.5.3. Phát hiện đa hình gen MTHFR ...................................................... 49 
2.6. Xử lý và phân tích số liệu ..................................................................... 52 
2.6.1. Xử lý số liệu .................................................................................... 52 
2.6.2. Xây dựng ngưỡng cắt tối ưu cho chẩn đoán tăng nồng độ 
homocystein và folat huyết thanh ................................................... 52 
2.7. Xây dựng mô hình tiên lượng ............................................................... 53 
2.8. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ......................................................... 53 
2.9. Các biện pháp tránh sai số .................................................................... 54 
2.10. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 54 
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 56 
3.1. Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu ........................................... 56 
3.2. Nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR ....... 57 
3.2.1. Nồng độ homocystein và folat huyết thanh ở nhóm nghiên cứu .... 57 
3.2.2. Đánh giá đa hình gen MTHFR ....................................................... 57 
3.2.3. Đa hình gen MTHFR trên đối tượng nghiên cứu ........................... 65 
3.3. Mối tương quan giữa nồng độ Hcy và folat huyết thanh theo đa hình gen 
MTHFR ................................................................................................. 71 
3.3.1. So sánh nồng độ Hcy theo các đa hình gen MTHFR ..................... 71 
3.3.2. So sánh nồng độ folat theo các đa hình gen MTHFR ..................... 72 
3.3.3. Mối tương quan giữa nồng độ Hcy và folat với tổ hợp đa hình 2 vị trí 
C677T và A1298C trên gen MTHFR ............................................. 72 
3.3.4. Mối tương quan nồng độ Hcy và folat huyết thanh ........................ 74 
3.3.5. Đánh giá mô hình nghiên cứu ......................................................... 75 
Chương 4: BÀN LUẬN ............................................................................................ 88 
4.1. Nồng độ folat, homocystein huyết thanh ở bệnh nhân có tiền sử thai chết 
lưu tái diễn ............................................................................................. 90 
4.2. Sự liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và đa hình gen 
MTHFR ở bệnh nhân có tiền sử thai chết lưu tái diễn ........................ 113 
KHUYẾN NGHỊ ...................................................................................................... 126 
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ............................................................... 127 
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ... 128 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1. Quy định về thai chết lưu ở một số nước ............................................ 5 
Bảng 2.1: Hằng số C liên quan đến sai sót loại I và II ...................................... 42 
Bảng 2.2: Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen liên quan đến thai chết lưu tái phát 
theo mức sai sót loại I và II ................................................................ 42 
Bảng 2.3: Ước tính cỡ mẫu theo sự biến thiên của homocystein liên quan đến 
sẩy thai và/hoặc thai chết lưu tương ứng với các mức sai sót loại I và 
II ............................................................................................................ 43 
Bảng 2.4. Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β ......... 43 
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng ......................................................................... 49 
Bảng 2.6. Chu kì nhiệt của phản ứng realtime PCR.......................................... 49 
Bảng 2.7. Trình tự mồi của phản ứng sequencing ............................................. 51 
Bảng 2.8. Chu kì nhiệt của sequencing .............................................................. 51 
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu ............................................ 56 
Bảng 3.2. So sánh nồng độ Hcy và folat huyết thanh theo tuổi ....................... 56 
Bảng 3.3. So sánh kết quả Hcy và folat của nhóm bệnh và nhóm chứng ....... 57 
Bảng 3.4. Tỷ lệ xuất hiện của alen C và T vị trí 677 ......................................... 65 
Bảng 3.5. Phân bố kiểu gen MTHFR C677T trong nhóm nghiên cứu ........... 65 
Bảng 3.6. Nguy cơ thai chết lưu tái diễn theo đa hình gen MTHFR vị trí 677 ... 66 
Bảng 3.7. Tỷ lệ xuất hiện alen C ở vị trí 1298 ................................................... 68 
Bảng 3.8. Phân bố kiểu gen MTHFR A1298C trong nhóm nghiên cứu ........ 68 
Bảng 3.9. Nguy cơ có bệnh theo đa hình MTHFR vị trí 1298 ......................... 69 
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của đa hình gen khi kết hợp cả 2 vị trí đa hình trên gen 
MTHFR ................................................................................................ 70 
Bảng 3.11. Nồng độ Hcy (μmol/L) theo các đa hình gen MTHFR ................... 71 
Bảng 3.12. Nồng độ folat (ng/mL) theo các đa hình gen MTHFR .................... 72 
Bảng 3.13. So sánh nồng độ Hcy và folae huyết thanh theo các tổ hợp đồng hợp 
tử kiểu dại và dị hợp tử kép ................................................................ 72 
Bảng 3.14. So sánh nồng độ homocystein và folat huyết thanh theo tổ hợp gen 
dị hợp tử kép và đa hình đồng hợp tử kép ........................................ 73 
Bảng 3.15. So sánh nồng độ homocystein và folae huyết thanh theo tổ hợp gen 
đồng hợp tử kiểu dại kép với đa hình đồng hợp tử kép ........... 73 
Bảng 3.16. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ................................................. 75 
Bảng 3.17. Xác định ngưỡng cắt tối ưu theo d-distance, BM, F1 score, BAC . 79 
Bảng 3.18. Xác định mô hình tối ưu dựa trên các biến nghiên cứu ................... 82 
Bảng 3.19. Đánh giá tỷ suất chênh OR của các biến trong mô hình ................. 85 
DANH MỤC BIỂU ...  mẫu xét nghiệm lấy từ bệnh nhân đã nhận các chế phẩm từ các kháng thể 
đơn dòng chuột cho chẩn đoán hoặc điều trị có thể chứa các kháng thể kháng chuột 
ở người (HAMA).Những mẫu này có thể cho giá trị thay đổi tăng hoặc giảm giả khi 
xét nghiệm với các bộ xét nghiệm như ARCHITECT Folate có sử dụng các kháng 
thể đơn dòng chuột 
- Kháng thể dị hình trong huyết thanh người có thể phản ứng với 
immunoglobulins thuốc thử, gây nhiễu với xét nghiệm miễn dịch in vitro. Bệnh nhân 
thường phơi nhiễm với động vật hay các sản phẩm huyết thanh động vật có thể dễ 
gây nhiễu và cho kết quả bất thường 
- Mẫu huyết thanh hay huyết tương chứa tế bào hồng cầu có thể làm nồng độ 
folate tăng giả 
- Methotrexate, aminopterin, và folinic acid (Leucovorin) là các tác nhân hóa 
học cho điều trị có cấu trúc phân tử tương tự như folate. Những tác nhân này có phản 
ứng chéo với protein gắn với folate trong các xét nghiệm folate 
XII. Lưu trữ hồ sơ/biểu mẫu 
- Kết quả phân tích được lưu trữ online trên mạng LIS. 
XIII. Tài liệu liên quan: 
- Quy trình: MED.QTQL.25, MED.QTQL.34, MED.QTQL.35 
- Hướng dẫn: MED.HD.STAT, MED.HD.05, MED.HD.06, MED.HD.07, 
MED.HD.08, MED.HD.HS.15 
- Biểu mẫu: MED.BMQL.27.04 
Sổ sách: 
+ Sổ lưu quy trình xét nghiệm Hóa sinh, Miễn dịch. 
+ Sổ lưu hướng dẫn sử dụng máy Hóa sinh, Miễn dịch. 
XIV. Tài liệu tham khảo 
- Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy Architect. 
- Tài liệu hướng dẫn sử dụng thuốc thử Folate của Abbott Architect. 
- Các xét nghiệm thường quy áp dụng trong thực hành lâm sàng - NXB Y học 
(2013). 
PHỤ LỤC 6 
Danh sách mẫu phân tích đối chứng bằng hai phương pháp realtime 
PCR và giải trình tự gen MTHFR 
Mã 
Kiểu gen Sequencing Kiểu gen realtime 
1298 677 1298 677 
Nhóm chứng 
ĐTC10 AC CC AC CC 
ĐTC12 AA TT AA TT 
ĐTC14 AA CC AA CC 
ĐTC16 AC CT AC CT 
ĐTC18 AA CC AA CC 
ĐTC20 CC CC CC CC 
ĐTC22 AC CC AC CC 
ĐTC24 AC CC AC CC 
ĐTC26 AC CC AC CC 
ĐTC28 AA CC AA CC 
Nhóm bệnh 
ĐTB56 AA CC AA CC 
ĐTB58 AC CT AC CT 
ĐTB60 AA TT AA TT 
ĐTB62 AC CT AC CT 
ĐTB64 AC CC AC CC 
ĐTB66 AA CT AA CT 
ĐTB68 CC CC CC CC 
ĐTB70 AC TT AC TT 
ĐTB72 AC CC AC CC 
ĐTB74 AA CC AA CC 
PHỤ LỤC 7 
Đánh giá ngưỡng cắt của nồng độ homocystein huyết thanh với dự đoán 
nguy cơ thai chết lưu tái diễn 
ID Cutoff TPR SPC FPR FNR BAC PPV NPV F1 d_distance BM 
1 0 1 0 1 0 0.5 0.5 NA 0.67 1 0 
2 2.59 1 0.01 0.99 0 0.5 0.51 1 0.67 0.99 0.01 
3 3.92 1 0.02 0.98 0 0.51 0.51 1 0.67 0.98 0.02 
4 4.03 1 0.02 0.98 0 0.51 0.51 1 0.68 0.98 0.02 
5 4.31 1 0.03 0.97 0 0.52 0.51 1 0.68 0.97 0.03 
6 4.74 1 0.04 0.96 0 0.52 0.51 1 0.68 0.96 0.04 
7 4.95 1 0.05 0.95 0 0.52 0.52 1 0.68 0.95 0.05 
8 5.1 1 0.06 0.94 0 0.53 0.52 1 0.68 0.94 0.06 
9 5.3 1 0.06 0.94 0 0.53 0.52 1 0.68 0.94 0.06 
10 5.43 1 0.08 0.92 0 0.54 0.52 1 0.69 0.92 0.08 
11 5.48 0.99 0.08 0.92 0.01 0.54 0.52 0.91 0.68 0.92 0.07 
12 5.53 0.99 0.09 0.91 0.01 0.54 0.52 0.92 0.69 0.91 0.08 
13 5.59 0.99 0.1 0.9 0.01 0.54 0.53 0.92 0.69 0.9 0.09 
14 5.63 0.98 0.1 0.9 0.02 0.54 0.53 0.86 0.68 0.9 0.08 
15 5.65 0.98 0.11 0.89 0.02 0.55 0.53 0.88 0.69 0.89 0.1 
16 5.68 0.98 0.11 0.89 0.02 0.54 0.53 0.82 0.68 0.89 0.09 
17 5.73 0.98 0.12 0.88 0.02 0.55 0.53 0.83 0.69 0.88 0.1 
18 5.83 0.98 0.13 0.87 0.02 0.55 0.53 0.84 0.69 0.87 0.1 
19 5.95 0.98 0.14 0.86 0.02 0.56 0.54 0.86 0.69 0.86 0.12 
20 6.01 0.98 0.15 0.85 0.02 0.56 0.54 0.86 0.69 0.85 0.13 
21 6.04 0.98 0.16 0.84 0.02 0.57 0.54 0.87 0.7 0.84 0.14 
22 6.06 0.98 0.17 0.83 0.02 0.57 0.54 0.88 0.7 0.83 0.14 
23 6.07 0.98 0.17 0.83 0.02 0.58 0.55 0.88 0.7 0.83 0.15 
24 6.09 0.98 0.18 0.82 0.02 0.58 0.55 0.88 0.7 0.82 0.16 
25 6.15 0.98 0.21 0.79 0.02 0.59 0.56 0.9 0.71 0.79 0.18 
26 6.2 0.98 0.21 0.79 0.02 0.6 0.56 0.9 0.71 0.79 0.19 
27 6.22 0.98 0.23 0.77 0.02 0.6 0.56 0.91 0.71 0.77 0.21 
28 6.25 0.97 0.23 0.77 0.03 0.6 0.56 0.88 0.71 0.77 0.2 
29 6.27 0.96 0.23 0.77 0.04 0.6 0.56 0.85 0.71 0.77 0.19 
30 6.32 0.95 0.23 0.77 0.05 0.59 0.56 0.83 0.7 0.77 0.18 
31 6.43 0.95 0.23 0.77 0.05 0.59 0.56 0.81 0.7 0.77 0.18 
32 6.51 0.94 0.23 0.77 0.06 0.58 0.55 0.78 0.7 0.77 0.17 
33 6.55 0.93 0.24 0.76 0.07 0.58 0.55 0.77 0.69 0.77 0.17 
34 6.59 0.93 0.25 0.75 0.07 0.59 0.56 0.78 0.7 0.76 0.18 
35 6.62 0.93 0.25 0.75 0.07 0.59 0.56 0.78 0.7 0.75 0.18 
36 6.69 0.93 0.27 0.73 0.07 0.6 0.56 0.79 0.7 0.73 0.2 
37 6.76 0.93 0.28 0.72 0.07 0.6 0.57 0.8 0.7 0.73 0.21 
38 6.78 0.92 0.28 0.72 0.08 0.6 0.56 0.78 0.7 0.73 0.2 
39 6.8 0.92 0.29 0.71 0.08 0.6 0.57 0.78 0.7 0.72 0.21 
40 6.84 0.92 0.29 0.71 0.08 0.61 0.57 0.79 0.7 0.71 0.22 
41 6.88 0.92 0.3 0.7 0.08 0.61 0.57 0.79 0.71 0.7 0.22 
42 6.9 0.92 0.31 0.69 0.08 0.62 0.58 0.8 0.71 0.69 0.23 
43 6.92 0.92 0.33 0.67 0.08 0.62 0.58 0.8 0.71 0.68 0.25 
44 6.95 0.92 0.33 0.67 0.08 0.63 0.58 0.81 0.72 0.67 0.26 
45 6.99 0.92 0.36 0.64 0.08 0.64 0.59 0.82 0.72 0.65 0.28 
46 7.05 0.91 0.36 0.64 0.09 0.64 0.59 0.8 0.72 0.65 0.27 
47 7.1 0.91 0.37 0.63 0.09 0.64 0.59 0.81 0.72 0.64 0.28 
48 7.11 0.91 0.37 0.63 0.09 0.64 0.6 0.81 0.72 0.63 0.29 
49 7.13 0.9 0.38 0.62 0.1 0.64 0.6 0.79 0.72 0.63 0.28 
50 7.14 0.9 0.39 0.61 0.1 0.64 0.6 0.79 0.72 0.62 0.29 
51 7.16 0.88 0.39 0.61 0.12 0.64 0.59 0.77 0.71 0.62 0.27 
52 7.19 0.88 0.4 0.6 0.12 0.64 0.6 0.77 0.71 0.61 0.28 
53 7.2 0.88 0.4 0.6 0.13 0.64 0.6 0.76 0.71 0.62 0.27 
54 7.22 0.88 0.4 0.6 0.13 0.64 0.6 0.76 0.71 0.61 0.28 
55 7.25 0.87 0.41 0.59 0.13 0.64 0.6 0.75 0.71 0.6 0.28 
56 7.28 0.86 0.42 0.58 0.14 0.64 0.6 0.75 0.71 0.6 0.28 
57 7.3 0.86 0.43 0.57 0.14 0.64 0.6 0.75 0.71 0.59 0.29 
58 7.31 0.86 0.44 0.56 0.14 0.65 0.61 0.76 0.71 0.57 0.3 
59 7.33 0.85 0.44 0.56 0.15 0.65 0.61 0.75 0.71 0.58 0.3 
60 7.35 0.84 0.45 0.55 0.16 0.65 0.61 0.74 0.71 0.57 0.3 
61 7.37 0.84 0.45 0.55 0.16 0.64 0.61 0.73 0.7 0.57 0.29 
62 7.42 0.84 0.46 0.54 0.16 0.65 0.61 0.73 0.71 0.56 0.3 
63 7.47 0.84 0.47 0.53 0.16 0.65 0.61 0.74 0.71 0.56 0.3 
64 7.48 0.84 0.48 0.52 0.16 0.66 0.62 0.74 0.71 0.55 0.31 
65 7.5 0.83 0.48 0.52 0.17 0.65 0.62 0.73 0.71 0.55 0.3 
66 7.52 0.83 0.48 0.52 0.17 0.66 0.62 0.73 0.71 0.54 0.31 
67 7.53 0.83 0.49 0.51 0.17 0.66 0.62 0.74 0.71 0.54 0.32 
68 7.56 0.83 0.5 0.5 0.17 0.66 0.63 0.74 0.71 0.53 0.33 
69 7.59 0.82 0.5 0.5 0.18 0.66 0.63 0.73 0.71 0.53 0.32 
70 7.61 0.81 0.51 0.49 0.19 0.66 0.63 0.73 0.71 0.53 0.32 
71 7.64 0.81 0.52 0.48 0.19 0.66 0.63 0.73 0.71 0.52 0.33 
72 7.65 0.81 0.52 0.48 0.19 0.67 0.63 0.73 0.71 0.51 0.34 
73 7.66 0.81 0.53 0.47 0.19 0.67 0.64 0.74 0.71 0.5 0.34 
74 7.67 0.8 0.53 0.47 0.2 0.67 0.64 0.73 0.71 0.51 0.34 
75 7.68 0.8 0.53 0.47 0.2 0.66 0.63 0.72 0.71 0.51 0.33 
76 7.71 0.8 0.54 0.46 0.2 0.67 0.64 0.72 0.71 0.5 0.34 
77 7.75 0.77 0.54 0.46 0.23 0.66 0.63 0.7 0.69 0.51 0.31 
78 7.77 0.77 0.55 0.45 0.23 0.66 0.63 0.7 0.7 0.51 0.32 
79 7.79 0.77 0.56 0.44 0.23 0.67 0.64 0.71 0.7 0.49 0.34 
80 7.82 0.77 0.57 0.43 0.23 0.67 0.65 0.71 0.7 0.48 0.34 
81 7.83 0.77 0.58 0.42 0.23 0.68 0.65 0.72 0.71 0.48 0.35 
82 7.85 0.77 0.59 0.41 0.23 0.68 0.65 0.71 0.71 0.47 0.35 
83 7.9 0.77 0.6 0.4 0.23 0.68 0.66 0.71 0.71 0.47 0.36 
84 7.95 0.76 0.6 0.4 0.24 0.68 0.66 0.71 0.7 0.47 0.35 
85 7.96 0.76 0.6 0.4 0.24 0.68 0.66 0.71 0.71 0.46 0.36 
86 7.98 0.76 0.61 0.39 0.24 0.68 0.66 0.71 0.71 0.46 0.37 
87 8.02 0.76 0.62 0.38 0.24 0.69 0.67 0.72 0.71 0.45 0.38 
88 8.05 0.76 0.63 0.37 0.24 0.7 0.68 0.72 0.72 0.44 0.39 
89 8.06 0.76 0.64 0.36 0.24 0.7 0.68 0.72 0.72 0.43 0.4 
90 8.08 0.76 0.65 0.35 0.24 0.7 0.69 0.73 0.72 0.42 0.41 
91 8.11 0.76 0.66 0.34 0.24 0.71 0.69 0.73 0.72 0.42 0.42 
92 8.14 0.75 0.66 0.34 0.25 0.7 0.69 0.72 0.72 0.42 0.41 
93 8.17 0.74 0.66 0.34 0.26 0.7 0.69 0.72 0.71 0.43 0.4 
94 8.21 0.73 0.66 0.34 0.27 0.7 0.69 0.71 0.71 0.43 0.39 
95 8.24 0.73 0.67 0.33 0.27 0.7 0.69 0.71 0.71 0.43 0.4 
96 8.26 0.72 0.67 0.33 0.28 0.69 0.69 0.7 0.7 0.44 0.39 
97 8.28 0.72 0.67 0.33 0.28 0.7 0.69 0.7 0.7 0.43 0.39 
98 8.3 0.71 0.67 0.33 0.29 0.69 0.69 0.7 0.7 0.44 0.39 
99 8.32 0.71 0.69 0.31 0.29 0.7 0.7 0.7 0.71 0.42 0.4 
100 8.34 0.71 0.7 0.3 0.29 0.7 0.71 0.7 0.71 0.42 0.41 
101 8.37 0.7 0.7 0.3 0.3 0.7 0.7 0.7 0.7 0.42 0.4 
102 8.39 0.7 0.7 0.3 0.3 0.7 0.7 0.69 0.7 0.43 0.39 
103 8.41 0.68 0.7 0.3 0.32 0.69 0.7 0.68 0.69 0.44 0.38 
104 8.42 0.68 0.71 0.29 0.32 0.69 0.7 0.68 0.69 0.43 0.39 
105 8.44 0.68 0.71 0.29 0.32 0.7 0.71 0.69 0.69 0.43 0.39 
106 8.47 0.67 0.72 0.28 0.33 0.7 0.71 0.68 0.69 0.43 0.39 
107 8.49 0.67 0.73 0.27 0.33 0.7 0.72 0.69 0.69 0.42 0.4 
108 8.51 0.66 0.73 0.27 0.34 0.7 0.71 0.68 0.69 0.43 0.39 
109 8.53 0.66 0.74 0.26 0.34 0.7 0.72 0.68 0.69 0.43 0.4 
110 8.54 0.66 0.75 0.25 0.34 0.71 0.73 0.69 0.69 0.42 0.41 
111 8.57 0.66 0.75 0.25 0.34 0.71 0.73 0.69 0.7 0.42 0.42 
112 8.6 0.66 0.76 0.24 0.34 0.71 0.74 0.69 0.7 0.41 0.43 
113 8.63 0.66 0.77 0.23 0.34 0.72 0.75 0.69 0.7 0.41 0.43 
114 8.67 0.66 0.78 0.22 0.34 0.72 0.75 0.7 0.71 0.4 0.44 
115 8.69 0.66 0.78 0.22 0.34 0.72 0.75 0.69 0.7 0.41 0.43 
116 8.71 0.65 0.78 0.22 0.35 0.71 0.75 0.69 0.69 0.42 0.43 
117 8.81 0.64 0.78 0.22 0.36 0.71 0.75 0.68 0.69 0.42 0.42 
118 8.91 0.64 0.79 0.21 0.36 0.71 0.75 0.68 0.69 0.42 0.43 
119 8.95 0.63 0.79 0.21 0.37 0.71 0.75 0.68 0.69 0.43 0.42 
120 8.97 0.63 0.79 0.21 0.38 0.71 0.75 0.67 0.68 0.43 0.41 
121 8.98 0.63 0.79 0.21 0.38 0.71 0.75 0.68 0.68 0.43 0.42 
122 9 0.63 0.8 0.2 0.38 0.71 0.76 0.68 0.69 0.42 0.43 
123 9.02 0.62 0.8 0.2 0.38 0.71 0.76 0.67 0.68 0.43 0.42 
124 9.03 0.61 0.8 0.2 0.39 0.71 0.76 0.67 0.68 0.44 0.41 
125 9.05 0.6 0.8 0.2 0.4 0.7 0.75 0.66 0.67 0.45 0.4 
126 9.07 0.6 0.81 0.19 0.4 0.71 0.76 0.67 0.67 0.44 0.41 
127 9.09 0.6 0.82 0.18 0.4 0.71 0.77 0.67 0.68 0.44 0.42 
128 9.13 0.59 0.82 0.18 0.41 0.71 0.77 0.66 0.67 0.45 0.41 
129 9.17 0.59 0.82 0.18 0.41 0.7 0.77 0.66 0.66 0.45 0.4 
130 9.21 0.59 0.83 0.17 0.41 0.71 0.78 0.66 0.67 0.45 0.42 
131 9.28 0.58 0.83 0.17 0.42 0.71 0.78 0.66 0.66 0.45 0.41 
132 9.34 0.57 0.83 0.17 0.43 0.7 0.78 0.66 0.66 0.46 0.4 
133 9.37 0.57 0.84 0.16 0.43 0.71 0.78 0.66 0.66 0.46 0.41 
134 9.42 0.56 0.85 0.15 0.44 0.71 0.79 0.66 0.66 0.46 0.41 
135 9.47 0.55 0.85 0.15 0.45 0.7 0.79 0.65 0.65 0.47 0.4 
136 9.51 0.55 0.86 0.14 0.45 0.71 0.8 0.65 0.65 0.47 0.41 
137 9.6 0.55 0.86 0.14 0.45 0.7 0.8 0.65 0.65 0.48 0.4 
138 9.66 0.53 0.86 0.14 0.47 0.69 0.79 0.64 0.64 0.49 0.39 
139 9.68 0.53 0.87 0.13 0.47 0.7 0.8 0.64 0.64 0.49 0.4 
140 9.77 0.53 0.87 0.13 0.47 0.7 0.81 0.65 0.64 0.49 0.4 
141 9.85 0.53 0.88 0.12 0.47 0.71 0.82 0.65 0.64 0.48 0.41 
142 9.91 0.53 0.89 0.11 0.47 0.71 0.83 0.65 0.65 0.48 0.42 
143 9.98 0.52 0.89 0.11 0.48 0.71 0.83 0.65 0.64 0.49 0.41 
144 10.02 0.52 0.9 0.1 0.48 0.71 0.84 0.65 0.64 0.49 0.42 
145 10.09 0.52 0.9 0.1 0.48 0.71 0.85 0.65 0.64 0.49 0.42 
146 10.14 0.51 0.9 0.1 0.49 0.71 0.84 0.64 0.63 0.5 0.41 
147 10.16 0.49 0.9 0.1 0.51 0.7 0.84 0.64 0.62 0.52 0.4 
148 10.19 0.49 0.91 0.09 0.51 0.7 0.85 0.64 0.62 0.52 0.4 
149 10.22 0.49 0.92 0.08 0.51 0.71 0.86 0.64 0.63 0.51 0.41 
150 10.29 0.48 0.92 0.08 0.52 0.7 0.86 0.64 0.62 0.52 0.41 
151 10.39 0.48 0.93 0.07 0.52 0.71 0.87 0.64 0.62 0.52 0.41 
152 10.45 0.48 0.94 0.06 0.52 0.71 0.89 0.64 0.63 0.52 0.42 
153 10.48 0.48 0.94 0.06 0.52 0.71 0.88 0.64 0.62 0.53 0.41 
154 10.52 0.48 0.94 0.06 0.52 0.71 0.9 0.64 0.62 0.53 0.42 
155 10.56 0.47 0.94 0.06 0.53 0.71 0.9 0.64 0.62 0.53 0.41 
156 10.62 0.46 0.94 0.06 0.54 0.7 0.89 0.63 0.61 0.54 0.41 
157 10.67 0.45 0.94 0.06 0.55 0.7 0.89 0.63 0.6 0.55 0.4 
158 10.71 0.45 0.94 0.06 0.55 0.69 0.89 0.63 0.59 0.56 0.39 
159 10.73 0.44 0.94 0.06 0.56 0.69 0.89 0.62 0.59 0.57 0.38 
160 10.75 0.44 0.95 0.05 0.56 0.69 0.9 0.63 0.59 0.56 0.39 
161 10.81 0.43 0.95 0.05 0.57 0.69 0.9 0.62 0.58 0.57 0.38 
162 10.9 0.42 0.96 0.04 0.58 0.69 0.92 0.62 0.58 0.58 0.38 
163 10.95 0.41 0.96 0.04 0.59 0.69 0.91 0.62 0.57 0.59 0.37 
164 10.98 0.41 0.96 0.04 0.59 0.68 0.91 0.61 0.56 0.6 0.37 
165 11.07 0.4 0.96 0.04 0.6 0.68 0.91 0.61 0.55 0.6 0.36 
166 11.17 0.4 0.97 0.03 0.6 0.68 0.93 0.61 0.56 0.6 0.37 
167 11.19 0.39 0.97 0.03 0.61 0.68 0.93 0.61 0.55 0.61 0.36 
168 11.35 0.38 0.97 0.03 0.62 0.68 0.92 0.61 0.54 0.62 0.35 
169 11.51 0.38 0.97 0.03 0.63 0.67 0.92 0.6 0.53 0.63 0.34 
170 11.62 0.38 0.98 0.02 0.63 0.68 0.94 0.61 0.54 0.63 0.35 
171 11.75 0.37 0.98 0.02 0.63 0.67 0.94 0.6 0.53 0.63 0.34 
172 11.79 0.36 0.98 0.02 0.64 0.67 0.94 0.6 0.52 0.64 0.34 
173 11.84 0.35 0.98 0.02 0.65 0.66 0.94 0.6 0.51 0.65 0.33 
174 11.95 0.35 0.98 0.02 0.65 0.67 0.96 0.6 0.51 0.65 0.34 
175 12.16 0.35 0.99 0.01 0.65 0.67 0.98 0.6 0.52 0.65 0.34 
176 12.3 0.34 0.99 0.01 0.66 0.67 0.98 0.6 0.51 0.66 0.34 
177 12.34 0.34 0.99 0.01 0.66 0.66 0.98 0.6 0.5 0.66 0.33 
178 12.37 0.33 0.99 0.01 0.67 0.66 0.98 0.59 0.49 0.67 0.32 
179 12.4 0.33 1 0 0.67 0.66 1 0.59 0.49 0.67 0.33 
180 12.43 0.32 1 0 0.68 0.66 1 0.59 0.49 0.68 0.32 
181 12.49 0.31 1 0 0.69 0.66 1 0.59 0.48 0.69 0.31 
182 12.53 0.3 1 0 0.7 0.65 1 0.59 0.47 0.7 0.3 
183 12.58 0.3 1 0 0.7 0.65 1 0.58 0.46 0.7 0.3 
184 12.65 0.29 1 0 0.71 0.64 1 0.58 0.45 0.71 0.29 
185 12.67 0.28 1 0 0.72 0.64 1 0.58 0.44 0.72 0.28 
186 12.68 0.27 1 0 0.73 0.64 1 0.58 0.43 0.73 0.27 
187 12.73 0.27 1 0 0.73 0.63 1 0.57 0.42 0.73 0.27 
188 12.82 0.26 1 0 0.74 0.63 1 0.57 0.41 0.74 0.26 
189 12.91 0.25 1 0 0.75 0.63 1 0.57 0.4 0.75 0.25 
190 13.01 0.24 1 0 0.76 0.62 1 0.57 0.39 0.76 0.24 
191 13.08 0.23 1 0 0.77 0.62 1 0.56 0.38 0.77 0.23 
192 13.15 0.23 1 0 0.77 0.61 1 0.56 0.37 0.77 0.23 
193 13.38 0.22 1 0 0.78 0.61 1 0.56 0.36 0.78 0.22 
194 13.56 0.21 1 0 0.79 0.61 1 0.56 0.35 0.79 0.21 
195 13.58 0.2 1 0 0.8 0.6 1 0.55 0.34 0.8 0.2 
196 13.85 0.2 1 0 0.8 0.6 1 0.55 0.33 0.8 0.2 
197 14.37 0.19 1 0 0.81 0.59 1 0.55 0.32 0.81 0.19 
198 14.66 0.18 1 0 0.82 0.59 1 0.55 0.3 0.82 0.18 
199 14.87 0.17 1 0 0.83 0.59 1 0.54 0.29 0.83 0.17 
200 15.63 0.16 1 0 0.84 0.58 1 0.54 0.28 0.84 0.16 
201 16.29 0.16 1 0 0.84 0.58 1 0.54 0.27 0.84 0.16 
202 16.44 0.15 1 0 0.85 0.57 1 0.54 0.26 0.85 0.15 
203 16.54 0.14 1 0 0.86 0.57 1 0.53 0.25 0.86 0.14 
204 16.68 0.13 1 0 0.87 0.57 1 0.53 0.23 0.87 0.13 
205 16.85 0.13 1 0 0.88 0.56 1 0.53 0.22 0.88 0.13 
206 16.96 0.12 1 0 0.88 0.56 1 0.53 0.21 0.88 0.12 
207 17.55 0.11 1 0 0.89 0.55 1 0.53 0.2 0.89 0.11 
208 18.31 0.1 1 0 0.9 0.55 1 0.52 0.18 0.9 0.1 
209 18.68 0.09 1 0 0.91 0.55 1 0.52 0.17 0.91 0.09 
210 19.09 0.09 1 0 0.91 0.54 1 0.52 0.16 0.91 0.09 
211 19.5 0.08 1 0 0.92 0.54 1 0.52 0.14 0.92 0.08 
212 20.07 0.07 1 0 0.93 0.54 1 0.51 0.13 0.93 0.07 
213 21.22 0.06 1 0 0.94 0.53 1 0.51 0.12 0.94 0.06 
214 22.32 0.05 1 0 0.95 0.53 1 0.51 0.1 0.95 0.05 
215 22.8 0.05 1 0 0.95 0.52 1 0.51 0.09 0.95 0.05 
216 23.27 0.04 1 0 0.96 0.52 1 0.51 0.08 0.96 0.04 
217 23.94 0.03 1 0 0.97 0.52 1 0.5 0.06 0.97 0.03 
218 27.85 0.02 1 0 0.98 0.51 1 0.5 0.05 0.98 0.02 
219 35.48 0.02 1 0 0.98 0.51 1 0.5 0.03 0.98 0.02 
220 43.97 0.01 1 0 0.99 0.5 1 0.5 0.02 0.99 0.01 
221 Inf 0 1 0 1 0.5 NA 0.5 NA 1 0