Nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất nhóm silymarin trong thực phẩm chức năng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

62 
Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học – Tập 22, Số 4/2017 
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM 
SILYMARIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG 
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 
Đến tòa soạn 15 - 9 – 2017 
Nguyễn Thị Thu Hằng, Cao Công Khánh, Lê Thị Hồng Hảo 
Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia 
Lê Huyền Trâm 
Trường đại học Bách khoa Hà Nội 
SUMMARY 
DETERMINATION OF SILYMARIN IN DIETARY 
SUPPLEMENT BY HPLC 
Seeds of milk thistle, Silybum marianum (L.) Gaertn., are used for treatment and 
prevention of liver disorders and were identified as a high priority ingredient 
requiring a validated analytical method. A method of simultaneous determination 
of silymarin content in dietary supplement by reverse phase - high performance 
liquid chromatography was developed. The method was adapted to analyze 07 
active compounds in forms: materials, tablets, capsules and softgel. The photo 
diode array detector was used as a tool for peak identification and purity 
confirmation especially that silymarin have several reported peaks. The method 
was validated according to the AOAC guidelines (Appendix K: Guidelines for 
Dietary Supplements and Botanicals) with respect to specificity, linearity, 
detection and quantitation limits, recovery and precision. This method showed 
high reliability and can be implemented in practical application. 
Keywords: Silymarin, dietary supplement, HPLC. 
I. MỞ ĐẦU 
Silymarin là h n hợp của m t số chất 
flavonoid polyphenolic được phân lập 
từ cây kế sữa, Silybum marianum, họ 
Cúc (Asteraceae). Kế sữa vốn mọc 
hoang dã ở vùng Ðịa Trung Hải và 
được phát triển chủ yếu ở châu Âu, 
châu Phi, Nam Mỹ, Trung v Đông 
Á. Môi trường sinh trưởng của cây kế 
sữa là ở những vùng khô ráo, nhiều 
ánh nắng mặt trời. Hiện nay, cây kế 
sữa đ được du nhập vào trồng ở Việt 
Nam v đang phát triển tốt t i các 
vùng cao có đất tốt và khí hậu mát mẻ 
63 
như: Tam Đảo, Sapa,.... B phận 
được sử d ng chính là quả kế sữa với 
h m lượng Silymarin từ 1,5-3,0%. 
Các thành phần chính của silymarin là 
silybinin (silybin A và silybin B), 
isosilybinin (isosilybin A và 
isosilybin B), silydianin, silychristin. 
Trong đó, Silybin l th nh phần chính 
và chiếm khoảng 70-80%. 
Từ thời Hy L p cổ đ i và La Mã, h t 
giống của cây kế sữa đ được sử d ng 
để bảo vệ gan. Nó đ trở thành m t 
lo i thuốc chuyên dùng để điều trị các 
bệnh gan mật vào thế kỷ 16 và vào 
năm 1960 ở châu Âu. Đến nay, đ có 
nhiều nghiên cứu hiện đ i đánh giá 
hiệu quả của Silymarin để điều trị 
m t lo t các bệnh về gan, túi mật và 
rối lo n đường ru t. Từ đó, các sản 
phẩm thực phẩm chức năng TPCN) 
chứa thành phần kế sữa ngày càng 
phát triển, đặc biệt là ở Hoa Kỳ và 
Ch u Âu Để tăng hiệu quả sử d ng, 
phần lớn các sản phẩm n y đều chứa 
thành phần kế sữa dưới d ng cao thảo 
dược đ được tiêu chuẩn hóa về hàm 
lượng các ho t chất Silymarin và 
được bào chế chủ yếu dưới d ng viên 
nang cứng và viên nang mềm. Nhằm 
bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng, 
cũng như h trợ các c quan chức 
năng trong việc kiểm soát tốt vấn đề 
an toàn và chất lượng thực phẩm, 
nghiên cứu này sẽ khảo sát tối ưu v 
đánh giá phư ng pháp ph n t ch h m 
lượng Silymarin trong nguyên liệu 
cao thảo dược, sản phẩm TPCN d ng 
viên nang cứng và viên nang mềm. 
Trong đó, phư ng pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) 
kết hợp detector PDA được sử d ng 
với ưu điểm: đ n giản, dễ sử d ng, 
hiệu quả cao, dễ triển khai, chuyển 
giao cho các phòng thí nghiệm khác. 
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG 
PHÁP NGHIÊN CỨU 
 Đối tƣợng nghiên cứu: 
- D ng nguyên liệu cao thảo dược, 
viên nang cứng, viên nang mềm chứa 
kế sữa. 
- Đối tượng ph n t ch được lấy ngẫu 
nhiên trên thị trường Hà N i. 
 Dụng cụ, trang thiết bị: 
- Hệ thống HPLC Alliance (Waters) 
với detector PDA sử d ng phần mềm 
Empower. 
- C t Symmetry (150mm x 4,6mm; 
50 µm) (Waters) và tiền c t tư ng 
ứng 
- Các d ng c phòng thí nghiệm và 
m t số thiết bị ph trợ. 
 Hóa chất, chất chuẩn: các hóa 
chất, chất chuẩn sử d ng đều thu c 
lo i tinh khiết phân tích (p.a). 
- Silybinin (A+B), Isosilybinin 
(A+B), Silydianin, Silychristin, 
Taxifolin (Sigma Aldrich). 
- Methanol, acid phosphoric, n-
hexan v nước cất 2 lần đ t yêu cầu 
HPLC. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
1. Nghiên cứu xây dựng phƣơng 
pháp phân tích 
 Khảo sát và lựa chọn các điều 
kiện phân tích Silymarin bằng 
HPLC 
64 
 Qua tham khảo tài liệu [4, 5] kết hợp 
với tiến hành thử nghiệm, chúng tôi 
đ lựa chọn được các điều kiện phân 
tích các chất Silymarin trên hệ thống 
HPLC như sau: 
+ C t sắc kí C18 Symmetry (150mm 
x 4,6mm; 5,0µm) (Waters) và tiền c t 
tư ng ứng 
+ Thể tích tiêm mẫu 20µl; nhiệt đ 
buồng c t: 400C; tốc đ dòng: 1,0 
ml/phút. 
+ Khoảng quét phổ: 200-400nm, 
bước sóng định lượng: 288nm. 
+ Pha đ ng: kênh A: methanol/acid 
phosphoric/nước cất (20:0,5:80) và 
kênh B: methanol/acid 
phosphoric/nước cất (80:0,5:20) 
theo chư ng trình gradient như 
trong bảng 1: 
Bảng 1: Chương trình gradient 
pha động 
Thời gian 
(phút) 
Kênh A (%) Kênh B (%) 
Bắt đầu 85 15 
5,0 85 15 
20 55 45 
40 55 45 
45 85 15 
55 85 15 
 Nghiên cứu quy trình xử lí mẫu: 
Silymarin không có tính chất thân dầu 
mặc d đ tan trong nước của nó thấp. 
Silymarin h a tan được trong các dung 
môi phân cực EtOH, MeOH,) v 
không hòa tan trong các dung môi 
không phân cực (chloroform, ether 
petroleum,) Do đó chúng tôi tiến 
hành khảo sát các dung môi chiết phù 
hợp với từng lo i mẫu, sử d ng kết 
hợp m t số kỹ thuật ph trợ như: lắc 
Vortex, si u m, ly t m, 
Khảo sát dạng mẫu bột (viên nang 
cứng, nguyên liệu): 
- Thử nghiệm các dung môi hữu 
c ph n cực thường được sử d ng là 
aceton, methanol, ethanol trên mẫu 
viên nang cứng, m i dung môi chiết 
thử nghiệm 04 lần, kết quả thu được 
như trong bảng 2: 
Bảng 2: Kết quả thử nghiệm mẫu 
dạng bột với các dung môi 
chiết khác nhau 
Dung môi 
chiết 
Methanol Ethanol Acetone 
Hàm 
lượng 
Silymarin 
trung bình 
(mg/g) 
169 172 174 
 Kết quả định lượng Silymarin thu 
được khi sử d ng các dung môi chiết 
như trong bảng 2 không có sự khác 
biệt đáng kể. Tuy nhiên, trong quá 
trình phân tích sắc ký, mẫu chiết bằng 
aceton cho thấy có lẫn rất nhiều t p, 
ảnh hưởng đến việc phân tích 
Silymarin. So sánh giữa methanol và 
ethanol, sắc đồ của mẫu chiết bằng 
methanol có chân pic gọn h n, hình 
d ng pic đẹp h n v tách tốt hai đồng 
phân silybin A và silybin B, t o thuận 
lợi cho việc xác định h m lượng và 
phân lập chất phân tích. Do vậy, 
chúng tôi lựa chọn dung môi để chiết 
mẫu nang cứng là methanol và quy 
trình xử lý mẫu d ng b t khi phân 
tích Silymarin gồm các bước như sau: 
+ Xác định khối lượng trung bình 
lượng b t trong m t vi n nang, đồng 
nhất mẫu. 
+ C n ch nh xác lượng mẫu khoảng 
0,5g vào ống ly tâm 50 mL. 
65 
+ Thêm khoảng 25 mL methanol, lắc 
Vortex 1 phút, siêu âm 15 phút. 
+ Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 
phút, g n dịch trong v o bình định 
mức 50mL. 
+ Phần cặn chiết lặp l i lần 2 với 15 
ml methanol. 
+ G p dịch chiết, định mức bằng 
methanol, lắc đều. 
+ Lọc qua màng lọc 0,45µm, pha 
loãng (nếu cần) rồi phân tích trên 
HPLC. 
Quy trình xử lý mẫu với dung môi 
chiết methanol khá đ n giản, dễ thực 
hiện v cũng được sử d ng trong 
nhiều nghiên cứu khác [3, 4, 5]. 
Khảo sát dạng mẫu nhiều lipid (viên 
nang mềm): 
- Điểm đặc trưng của đối tượng mẫu 
này là nền mẫu có rất nhiều lipid như 
dầu thực vật, các ho t chất có tính 
thân dầu, kết hợp với b t cao dược 
liệu Do đó cần phải có giai đo n lo i 
béo (lipid) trong quá trình xử lý mẫu. 
Trong các dung môi không phân cực 
thường dùng, chúng tôi lựa chọn sử 
d ng n-hexan để lo i béo vì tính kinh 
tế v t đ c h i với con người, môi 
trường. Chúng tôi tiến hành thử 
nghiệm 02 quy trình: chiết lo i lipid 
bằng n-hexan trước, sau đó chiết mẫu 
bằng methanol (lo i lipid trước) và 
ngược l i (lo i lipid sau). M i quy 
trình tiến hành 04 lần. Kết quả thu 
được cho thấy với quy trình lo i lipid 
trước v sau thì h m lượng Silymarin 
thu được tư ng ứng là 6,11 mg/g và 
5,87 mg/g. Từ đó cho thấy, khi thực 
hiện lo i lipid trước bằng n-hexan, 
sau đó chiết mẫu bằng methanol có 
hiệu quả h n so với cách chiết mẫu 
bằng methanol sau đó lo i lipid bằng 
n-hexan Như vậy, quy trình xử lý 
mẫu d ng viên nang mềm (mẫu nhiều 
lipid) khi phân tích silymarin gồm các 
bước như sau: 
+ Xác định khối lượng trung bình 
lượng dịch trong 1 vi n nang, đồng 
nhất mẫu. 
+ C n lượng mẫu khoảng 1,0g vào 
ống ly tâm 50 mL. 
+ Thêm khoảng 25 mL n-hexan, lắc 
Vortex 1 phút. 
+ Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 
phút, lo i bỏ lớp n-hexan. 
+ Phần cặn để cho bay h i hết n-
hexan, tiến hành chiết như với mẫu 
d ng b t. 
2. Xác nhận giá trị sử dụng của 
phƣơng pháp: 
Độ đặc hiệu, độ chọn lọc: 
Tiến h nh ph n t ch theo các điều 
kiện sắc ký đ lựa chọn với mẫu dung 
dịch chuẩn h n hợp làm việc, mẫu 
trắng và mẫu trắng có thêm dung dịch 
chuẩn h n hợp làm việc. Kết quả thu 
được như sau: 
- Trên sắc đồ của mẫu trắng không 
xuất hiện các pic của các chất 
Silymarin. 
- Trên sắc đồ của mẫu dung dịch 
chuẩn h n hợp làm việc và mẫu trắng 
có thêm dung dịch chuẩn h n hợp làm 
việc thì thời gian lưu của các chất 
Silymarin là giống nhau, đồng thời 
các pic n y cũng có phổ giống nhau. 
- Thời gian lưu tư ng đối của 
Taxifolin, Silychristin, Silydianin, 
Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, 
Isosilybin B lần lượt là: 0,480; 0, 678; 
66 
0,725; 1,00; 1,057; 1,262; 1,317 (hình 
2) Như vậy so với phư ng pháp 
phân tích kế sữa của USP 38 thì 
nghiên cứu của chúng tôi có phần tốt 
h n, đặc biệt là khả năng tách giữa 
các đồng phân của Silybin và 
Isosilybin. 
Như vậy, phư ng pháp đ x y d ng 
có đ đặc hiệu, đ chọn lọc cao, phù 
hợp để ph n t ch đồng thời các ho t 
chất Silymarin trong thực phẩm chức 
năng Sắc đồ phân tích mẫu viên nang 
cứng thêm chuẩn Silymarin được thể 
hiện trong hình 1. 
Hình 1: Sắc đồ mẫu trắng (viên nang cứng) thêm chuẩn Silymarin 
Tính thích hợp của hệ thống: 
Tiến hành phân tích lặp l i 06 lần 
dung dịch chuẩn trên hệ thống HPLC 
với các điều kiện đ chọn ở trên, tính 
đ lệch chuẩn tư ng đối (RSD) của 
thời gian lưu v diện tích pic của các 
chất phân tích. Kết quả thu được cho 
thấy: Giá trị RSD (%) của thời gian 
lưu v diện t ch pic đều nhỏ h n 2%, 
phù hợp với quy định của AOAC. 
Như vậy, hệ thống HPLC thích hợp 
để ph n t ch đồng thời các chất nhóm 
Silymarin trong thực phẩm chức 
năng 
Khoảng tuyến tính: 
Pha các chuẩn nhóm Silymarin trong 
methanol và phân tích dãy dung dịch 
chuẩn h n hợp trên hệ thống HPLC. 
Xây dựng đồ thị biểu thị mối tư ng 
quan tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích pic 
chuẩn với nồng đ chất phân tích 
tư ng ứng. Kết quả thu được thể hiện 
trong bảng 3. 
Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Silybin 
C µg/ml Area C' µg/ml Bias (%) 
121 21144045 121,1 0,07 
48,4 8356436 48,18 -0.47 
12,1 2049351 12,21 0,90 
4,84 732314 4,699 -2,91 
2,42 335600 2,437 0,70 
1,21 148534 1,370 13,3 
- Các chất phân tích có khoảng tuyến 
tính từ 1,21 µg/ml đến 121 µg/ml. 
- Phư ng trình đường chuẩn của tất cả 
các chất ph n t ch đều có giá trị R2 > 
0,999. 
- Kết quả kiểm tra l i đường chuẩn 
cho thấy đ lệch (bias) t i các điểm 
tr n đường chuẩn đều có giá trị < ± 
15%, đ t theo yêu cầu của AOAC. 
15
.1
07
 - 
19
63
78
21
.3
37
 - 
89
30
88
22
.7
96
 - 
26
44
42
31
.4
63
 - 
48
53
32
33
.2
83
 - 
94
22
12
39
.6
89
 - 
31
10
75
41
.4
34
 - 
14
64
45AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
y = 175380x - 91784 
R² = 1 
67 
- Điểm thấp nhất của đường chuẩn 
theo USP 38 đối với Silybin là 4,0 
µg/ml Như vậy phư ng pháp n y có 
đường chuẩn phù hợp để phân tích 
các chất Silymarin. 
Giới hạn phát hiện và giới hạn định 
lượng: 
Trong nghi n cứu n y, chúng tôi xác 
định giới h n phát hiện LOD và giới 
h n định lượng LOQ dựa tr n đ lệch 
chuẩn (SD) bằng cách tiến hành phân 
tích song song với 10 mẫu thử. Từ kết 
quả thu được tính giá trị trung bình ̅ 
v đ lệch chuẩn SD, từ đó t nh LOD 
= 3× SD v LOQ = 10 × SD Việc 
đánh giá thực hiện dựa v o hệ số R = 
 ̅/LOD ( ̅ l giá trị trung bình của 
mẫu) Kết quả thực nghiệm thu được 
cho thấy: LOD v LOQ của các chất 
Silymarin lần lượt l 0,24 mg/g v 
0,80 mg/g. Các giá trị R của các chất 
ph n t ch đều nằm trong khoảng > 4 
v < 10 n n các giá trị về LOD v 
LOQ thu được tin cậy v đ t y u cầu 
so với AOAC 
 Độ lặp lại của phương pháp: 
Theo quy định của USP 38 về cao 
khô kế sữa, tổng h m lượng 
Silymarin phải có 20-45% silychristin 
+ silidianin, 40-65% silybinin (A+B), 
10-20% isosilybinin (A+B) [6]. Các 
nhà sản xuất cao chiết kế sữa cũng 
công bố chất lượng sản phẩm theo 
quy định n y Do đó, khi tiến hành 
thẩm định đ chính xác của phư ng 
pháp đ lặp l i v đ thu hồi), chúng 
tôi tiến hành tính tổng Silybinin và 
Isosilybinin theo đúng chất chuẩn h n 
hợp của Sigma. 
 Tiến hành phân tích lặp l i 06 lần 
đối với m i nền mẫu theo quy trình 
ph n t ch đ được xây dựng tư ng 
ứng, c thể: ph n t ch h m lượng các 
chất taxifolin, silychristin, silydianin, 
silybinin (A+B), isosilybinin (A+B) 
trong các mẫu nguyên liệu, mẫu viên 
nang cứng và viên nang mềm. Kết 
quả cho thấy: nền mẫu nguyên liệu 
cho đ lặp l i tốt nhất (với RSD từ 
1,28% đến 2,41%). Nền mẫu viên 
nang cứng và viên nang mềm cho đ 
lặp l i giống nhau (trong khoảng 2-
3%). Các giá trị này phù hợp với quy 
định của AOAC [6]. Các kết quả phân 
t ch đ lặp l i trong phư ng pháp n y 
tư ng đồng với nghiên cứu của E. 
Mudge và c ng sự [4 Cũng từ kết 
quả này cho thấy trong mẫu nguyên 
liệu của nghiên cứu này thì thành 
phần Isosilybinin thấp h n m t chút 
so với quy định. Các mẫu viên nang 
cứng và viên nang mềm đ sử d ng 
các nguyên liệu để sản xuất phù hợp 
với tiêu chuẩn của USP 38 [5]. Kết 
quả cũng cho thấy, h m lượng 
Taxifolin chiếm khoảng 5-6% tổng 
h m lượng Silymarin Tuy nhi n cũng 
chưa có quy định về ho t chất này 
trong thành phần silymarin trong 
dược liệu cũng như trong cao nguy n 
liệu. Hình ảnh minh họa sắc đồ phân 
tích mẫu viên nang cứng 
68 
Hình 2: Sắc đồ phân tích độ lặp lại trên nền mẫu viên nang cứng 
Độ thu hồi của phương pháp: 
Đ đúng của phư ng pháp được đánh 
giá bằng cách thêm chuẩn h n hợp 
silymarin vào nền mẫu thực phẩm 
chức năng không chứa silymarin qua 
đánh giá s b v xác định tỷ lệ (%) 
thu hồi của chuẩn silymarin khi xử lý 
mẫu v ph n t ch theo quy trình đ 
xây dựng. Kết quả cho đ thu hồi của 
các chất Taxifolin, Silychristin, 
Silydianin, Silybinin (A+B), 
Isosilybinin (A+B) trong các nền mẫu 
nguyên liệu, viên nang cứng và viên 
nang mềm nằm trong khoảng 96,02 – 
102,1%, đ t yêu cầu của AOAC. 
Trong đó, nền mẫu nguyên liệu cho 
đ thu hồi tốt nhất, sau đó đến nền 
mẫu viên nang cứng và nền mẫu viên 
nang mềm. So sánh với m t số nghiên 
cứu khác : đ thu hồi của phư ng 
pháp n y cao h n so với nghiên cứu 
của E. Mudge và c ng sự [4 nhưng 
thấp h n m t chút so với nghiên cứu 
của Mohamed A. Korany và c ng sự 
[3 Điều này có thể là do ảnh hưởng 
của nền mẫu trắng tới các chất phân 
tích trong các nghiêu cứu chưa giống 
nhau. 
3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU 
THỰC 
Tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên trên thị 
trường Hà N i, ph n t ch theo phư ng 
pháp đ x y dựng và thẩm định. Kết 
quả phân tích cho thấy: h m lượng 
silymarin trong 07 mẫu nguyên liệu: 
từ 5,91 g/100g đến 98,1 g/100g; trong 
06 mẫu viên nang mềm: từ 6,64 
mg/vi n đến 32,8 mg/viên; trong 10 
mẫu viên nang cứng: từ 11,1 mg/viên 
đến 126 mg/viên; trong 03 mẫu viên 
nén: từ 41,5 mg/vi n đến 116 
mg/vi n Tuy nhi n, đ y mới chỉ là 
các kết quả ph n t ch ban đầu, cần 
tiếp t c nghiên cứu tiếp để có đánh 
giá tốt h n về chất lượng của các lo i 
nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm 
chức năng tr n thị trường. 
Hình 3: Sắc đồ phân tích mẫu viên nén VN01 
13
.27
9 -
 87
83
9
18
.17
1 -
 36
99
09
19
.49
6 -
 11
07
04
31
.76
2 -
 19
11
16
7
40
.12
7 -
 24
61
99
AU
0.000
0.010
0.020
Minutes
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00
69 
V. KẾT LUẬN 
HPLC là m t phư ng pháp ph n t ch 
hiện đ i, phổ biến v đáp ứng rất tốt 
các yêu cầu về phân tích chất lượng 
thực phẩm chức năng ở cả trong và 
ngo i nước. Sự kết hợp của chư ng 
trình gradient pha đ ng giúp tách tốt 
các ho t chất nhóm Silymarin và 
detector PDA đ giúp tăng đ đặc 
hiệu của phư ng pháp Các kết quả 
thẩm định cho thấy phư ng pháp 
được xây dựng trong nghiên cứu này 
có khoảng tuyến tính r ng, đ nh y 
tốt, đ lặp l i v đ thu hồi phù hợp 
yêu cầu Phư ng pháp n y dễ thực 
hiện, đ tin cậy cao và có khả năng 
triển khai áp d ng r ng rãi t i các 
phòng thí nghiệm ở Việt Nam. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. L. Abenavoli, R. Capasso, et al. 
(2010), "Milk thistle in liver diseases: 
past, present, future", Phytother 
Research, 24(10), pp. 1423-1432. 
2. S. AbouZid (2012), "Silymarin, 
Natural Flavonolignans from Milk 
Thistle", Phytochemicals - A Global 
Perspective of Their Role in Nutrition 
and Health, (12), pp. 255-272. 
3. Mohamed A. Korany, et al. (2017), 
"A validated stability-indicating 
HPLC method for simultaneous 
determination of Silymarin and 
Curcumin in various dosage forms ", 
Arabian Journal of Chemistry, 10, 
S1711–S1725. 
4. E. Mudge, L. Paley, et al. (2015), 
"Optimization and single-laboratory 
validation of a method for the 
determination of flavonolignans in 
milk thistle seeds by high-
performance liquid chromatography 
with ultraviolet detection", Analytical 
and Bioanalytical Chemistry, 
407(25), pp. 7657-7666. 
5. The United States Pharmacopeia 
(2015), "Powdered Milk Thistle 
Extract Monograph", United States 
Pharmacopeia 38 - NF33. 
6. AOAC OFFICIAL METHODS 
OF ANALYSIS (2013), Appendix K: 
Guidelines for Dietary Supplements 
and Botanicals.