Phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng trong lên men rượu vang trái giác

55
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
xuất vang chính là nguồn nấm men. Đối với 
nấm men, nhiệt độ là một trong những yếu tố 
ảnh hưởng đến quá trình lên men chuyển hóa 
đường thành ethanol (Lương Đức Phẩm, 2006). 
Hiện nay, nhiệt độ trái đất đang ấm dần lên do 
hiện tượng biến đổi khí hậu, đặc biệt đối với 
các nước nằm ở vùng nhiệt đới và vào khoảng 
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rượu vang là một loại thức uống có độ cồn 
nhẹ, giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm 
ngon đặc trưng và có lợi cho sức khỏe khi 
chúng ta biết sử dụng một cách điều độ. Một 
trong những yếu tố quan trọng nhất trong sản 
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT 
ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC 
(Cayratia trifolia L.)
ISOLATION AND SELECTION OF THERMOTOLERANT YEASTS FOR WINE PRODUCTION 
FROM THREE-LEAF CAYRATIA (Cayratia trifolia L.) 
Đoàn Thị Kiều Tiên1,2, Lữ Hằng Nghi1, Nguyễn Ngọc Thạnh1, Huỳnh Xuân Phong1,
Hà Thanh Toàn1, Ngô Thị Phương Dung1
1Trường Đại học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ
2Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Cần Thơ, Tp. Cần Thơ
Email: hxphong@ctu.edu.vn
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt có khả 
năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.). Kết quả đã phân lập được 55 chủng nấm 
men từ 20 mẫu trái giác thu thập ở 5 tỉnh vùng đất mặn ven biển vùng Đồng bằng Sông Cửu Long 
gồm Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh. Dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh 
lý và sinh hóa, các chủng nấm men được phân loại sơ bộ thuộc ba giống bao gồm Saccharomyces, 
Pichia và Candida. Các chủng nấm men được khảo sát khả năng phát triển ở các mức nhiệt độ 
(30, 35, 37, 39, 41, 43, 45 và 47°C) và nồng độ ethanol (3, 6, 9, 12 và 15% v/v) khác nhau, qua 
đó đã sơ tuyển được 19 chủng nấm men có khả năng phát triển ở 37-45°C và chịu ethanol ở mức 
9-12% (v/v). Kết quả thử nghiệm khả năng lên men rượu vang trái giác ở 37°C cho thấy chủng 
Saccharomyces sp. CM3.2 có khả năng lên men cao nhất với hàm lượng ethanol đạt 8,95% (v/v).
Từ khóa: Cayratia trifolia, khả năng chịu ethanol, nấm men chịu nhiệt, rượu vang trái giác, 
Saccharomyces sp. CM3.2.
ABSTRACT
The aims of this study were to isolate and to evaluate the thermotolerant yeasts that have the 
fermentation ability for the production of three-leaf cayratia (Cayratia trifolia L.) wine. Fifty-
five newly isolated yeasts were obtained from 20 samples of three-leaf cayratia collected from 5 
provinces in the coastal saline soil in Mekong Delta region, including Ca Mau, Bac Lieu, Soc Trang, 
Ben Tre, and Tra Vinh. All isolated yeasts were grouped as follow: Sacccharomyces, Pichia, and 
Candida, based on their basically morphological, physiological, and biochemical characteristics. 
These isolated yeasts were tested for their growth at diferent temperatures (30, 35, 37, 39, 41, 43, 
45, and 47°C) and ethanol concentrations (3, 6, 9, 12, and 15% v/v). Nine-teen selected isolated 
yeasts that could grow at 37-45°C and tolerate 9-12% (v/v) ethanol were further evaluated for the 
fermentation ability of three-leaf cayratia at 37°C. Saccharomyces sp. CM3.2 was the promising 
yeast for three-leaf cayratia wine production as this thermotolerant yeast could produce ethanol 
concentration of 8.95% (v/v).
Keywords: Cayratia trifolia, ethanol tolerant ability, Saccharomyces sp. CM3.2, thermotolerant 
yeast, three-leaf cayratia wine.
56
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU
Nguyên vật liệu và môi trường
Hai mươi mẫu trái giác chín được thu thập 
tại 20 huyện thuộc 5 tỉnh vùng đất mặn vùng 
Đồng bằng Sông Cửu Long (Cà Mau, Bạc Liêu, 
Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh). Trái giác sau 
khi được thu thập sẽ được giữ trong bọc kín và 
vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được 
dùng trong ngày để phân lập nấm men hoặc trữ 
trong tủ lạnh (nhiệt độ 4ºC).
Môi trường YPD agar (yeast extract 0,5%, 
peptone 0,5%, glucose 2,0%, agar 2%); môi 
trường Chistensen urea broth (urea 20 g, yeast 
extract 0,1 g, Na
2
HPO
4 
9,5 g, K
2
HPO
4 
9,1 g, 
phenol red 0,01 g, pH 6,7 ± 0,2); môi trường 
gelatine (peptone 8,3 g, yeast extract 5,0 g, 
gelatine 120 g, pH 7,7 ± 0,2). Môi trường được 
chuẩn bị và khử trùng nhiệt ướt ở 121°C trong 
15 phút.
Phân lập các chủng nấm men từ dịch quả
Quy trình phân lập: Cho 5 g trái giác chín 
vào môi trường YPD lỏng (yeast extract 5 g/L, 
peptone 5 g/L, D-glucose 20 g/L, tetracycline 
10%) đã được khử trùng (121°C trong 15 phút). 
Tiến hành ủ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 
nhiệt độ 30°C. Mẫu dịch tăng sinh (100 µL) 
được cấy trải trên môi trường YPD agar (yeast 
extract 5 g/L, peptone 5 g/L, D-glucose 20 g/L, 
tetracycline 10%, agar 20 g/L). Chọn các khuẩn 
lạc nấm men khác nhau để tiếp tục cấy chuyền 
đến khi thu được khuẩn lạc nấm men thuần 
nhất. Kiểm tra độ thuần của tế bào nấm men 
dưới kính hiển vi.
Phân loại sơ bộ 
Phân loại sơ bộ đến mức độ giống các chủng 
nấm men phân lập dựa vào các đặc điểm như: 
hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, kiểu nẩy 
chồi, đặc điểm bào tử, hoạt tính phân giải urea 
và gelatin, khả năng đồng hóa đường (glucose, 
saccharose và maltose) (Kurtzman và ctv, 2011). 
Bào tử nấm men được quan sát sau khi nấm men 
được nuôi cấy trong môi trường thạch nước đến 
6 tuần (Lương Đức Phẩm, 2006). 
thời gian mùa hè, trong đó có Việt Nam. Nhiệt 
độ tăng cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng lên men 
của nấm men trong quá trình sản xuất ethanol 
cũng như phải tiêu tốn một phần năng lượng 
để giữ ổn định nhiệt độ cho các hệ thống lên 
men (Limtong và ctv, 2007; Yuangsaard và 
ctv, 2013). Vì vậy, việc lựa chọn nấm men chịu 
nhiệt để lên men rượu là một giải pháp hữu hiệu 
mang nhiều lợi ích đáng kể như tận dụng được 
nhiệt độ cao để lên men, làm cho quá trình lên 
men diễn ra nhanh, nguy cơ nhiễm vi sinh vật 
giảm và giảm chi phí đầu tư cho thiết bị làm 
mát mang lại nhiều lợi ích kinh tế trong sản 
xuất (Roehr, 2001; Limtong và ctv, 2007).
Theo truyền thống, rượu vang được sản xuất 
từ nho chín, sử dụng nấm men Saccharomyces 
cerevisiae để nâng cao hiệu quả lên men (Bùi 
Ái, 2005). Nhưng với nhu cầu ngày càng cao 
của con người hiện nay trên thế giới nói chung 
và Việt Nam nói riêng, vẫn luôn có nhiều nghiên 
cứu thử nghiệm để tìm ra hương vị mới lạ và 
nâng cao chất lượng cho loại thức uống được 
ưa chuộng này. Tuy nhiên, hiện nay những công 
trình nghiên cứu lựa chọn trái giác làm nguyên 
liệu lên men rượu vang, đặc biệt là việc kết hợp 
sử dụng nấm men chịu nhiệt để hỗ trợ quá trình 
lên men hầu như vẫn còn rất ít và hạn chế.
Giác (Cayratia trifolia L.) là một loại cây 
dại cũng thuộc họ nho (Vitaceae), sinh trưởng 
rất nhiều tại vùng ĐBSCL, nhất là các vùng đất 
nhiễm mặn như vùng Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc 
Trăng, Trà Vinh, Bến Tre,... Đặc biệt, đây là 
một loại trái cây đặc trưng và mọc tự nhiên rất 
phong phú ở vùng rừng U Minh thuộc tỉnh Cà 
Mau. Trong trái giác có chứa các hợp chất như 
flavonoid, resveratrol, có khả năng ngăn chặn 
quá trình oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, 
chống ung thư và các hoạt động lợi tiểu, 
(Gupta, 2007; Kumar và ctv, 2011; Perumal và 
ctv, 2015). Với những lợi ích thiết thực về mặt 
dinh dưỡng, sức khỏe và dược tính mà trái giác 
mang lại cùng với đặc điểm nguồn nguyên liệu 
dồi dào và dễ tìm có thể nói trái giác rất có tiềm 
năng để sản xuất rượu vang ở nước ta. Mục tiêu 
của nghiên cứu là nhằm phân lập và tuyển chọn 
nấm men từ trái giác có khả năng chịu nhiệt, 
chịu ethanol và lên men mạnh để có thể ứng 
dụng trong lên men rượu vang trái giác.
57
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
ngược tại các thời điểm 12, 18, 24, 32, 36, 42 
và 48 giờ ủ (Nguyễn Hữu Tường và ctv, 2013).
Thử nghiệm khả năng lên men rượu vang 
trái giác
Nuôi cấy nấm men trong môi trường YPD 
lỏng đến khi mật độ tế bào nấm men đạt 108 
tế bào/mL. Chủng 1 mL nấm men đã nuôi cấy 
vào các bình tam giác chứa 99 mL dịch trái giác 
được điều chỉnh về 22ºBrix, ủ lên men 5-7 ngày 
trong điều kiện kỵ khí ở 37ºC (Nguyễn Hữu 
Tường và ctv, 2013). Thí nghiệm được lặp lại 
3 lần. Chưng cất và đo nồng độ ethanol, quy về 
nồng độ ethanol ở 20ºC (Nguyễn Đình Thưởng 
và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). 
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft 
Excel 2010 (Micrsoft Corporation, USA). Kết 
quả phân tích phương sai và kiểm định LSD 
sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV 
(Manugistics Inc., USA).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập nấm men từ trái giác
Kết quả phân lập được 55 chủng nấm men 
thuần chủng từ 20 mẫu nguyên liệu trái giác 
được thu ở 20 địa điểm thuộc 5 tỉnh vùng 
ĐBSCL (Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến 
Tre và Trà Vinh). Nấm men phân lập từ trái 
giác có 6 hình dạng bao gồm hình cầu nhỏ, hình 
ovan lớn, hình ovan nhỏ, hình elip dài, hình elip 
ngắn và hình elip nhọn được thể hiện ở Bảng 1.
Thử khả năng chịu nhiệt của nấm men phân 
lập
Cấy ria các chủng nấm men phân lập lên 
môi trường YPD agar và ủ ở các nhiệt độ khác 
nhau (30, 35, 37, 39, 41, 43, 45 và 47ºC) trong 
48 giờ. Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của 
các chủng nấm men khác nhau trên đĩa thạch 
(Phong và ctv, 2016; Techaparin và ctv, 2017). 
Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng 
phát triển mạnh trên môi trường ở nhiệt độ cao. 
Thử khả năng chịu ethanol của nấm men 
chịu nhiệt
Cấy ria các nấm men phân lập trên môi 
trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết 
(3, 6, 9 12 và 15% v/v). Ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 
24-48 giờ và quan sát sự tạo thành khuẩn lạc 
của các chủng nấm men (Dung và ctv, 2012; 
Phong và ctv, 2016). Tuyển chọn các chủng 
nấm men có khả năng phát triển mạnh trên môi 
trường có nồng độ ethanol cao.
Đánh giá sơ bộ khả năng lên men ethanol 
của các chủng nấm men tuyển chọn
Nuôi sinh khối các chủng nấm men tuyển 
chọn trong môi trường YPD lỏng đến khi mật 
độ nấm men đạt 107 tế bào/mL (xác định bằng 
phương pháp đếm trên buồng đếm hồng cầu). 
Chủng 1 mL dung dịch nấm men vào ống 
nghiệm chứa 9 mL dung dịch glucose 2% (w/v) 
và chuông Durham úp ngược, thực hiện 3 lần 
lặp lại. Ủ ở nhiệt độ 37°C và ghi nhận chiều cao 
cột khí CO
2
 sinh ra trong chuông Durham úp 
Bảng 1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men phân lập từ trái giác
Nhóm Chủng nấm men
Hình dạng, kích 
thước (µm) tế bào
Tế bào nấm men dưới 
kính hiển vi ở vật kính 
X100
Nhóm 1 CM1.1, CM1.2, ST1.3 Hình cầu nhỏ;
3,71-3,98
Nhóm 2 CM2.2, CM3.1, CM4.2, BL1.2, BL2.2, 
ST1.2, BT1.3, BT2.1, BT3.2, BT3.3, 
TV1.2, TV4.4
Hình ovan lớn; 
(9,4-10,82) x 
(7,40-7,99)
58
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
nhóm 3 hình ovan nhỏ tế bào xuất hiện 1-2 bào 
tử hình tròn, nhóm 4 hình elip dài tế bào xuất 
hiện 1-3 bào tử hình tròn, nhóm 5 hình elip 
ngắn tế bào xuất hiện 1-3 bào tử hình tròn và 
nhóm 6 nấm men hình elip nhọn tế bào không 
xuất hiện bào tử.
Khả năng lên men đường glucose, 
saccharose, maltose: Kết quả đánh giá khả năng 
lên men các loại đường khác nhau thông qua sự 
hình thành bọt khí trong chuông Durham cho thấy 
hầu hết các chủng nấm men phân lập đều có 
khả năng lên men chuyển hóa glucose thành 
ethanol, một số chủng có khả năng lên men 
đường saccharose và có khá ít chủng có khả 
năng lên men đường maltose sau 48 giờ. Các 
chủng nấm men thuộc nhóm hình cầu và hình 
ovan đều có khả năng chuyển hóa 3 loại đường 
(glucose, saccharose và maltose) thành ethanol. 
Đối với các chủng nấm men hình elip, đa số 
chỉ có thể lên men chuyển hóa đường glucose 
nhưng không lên men được trên 2 loại đường 
còn lại.
Khả năng đồng hóa urea và gelatin: Kết quả 
sau 7 ngày ủ ở 30°C, tất cả các chủng nấm men 
thuộc nhóm 1 hình cầu nhỏ, nhóm 2 hình ovan 
lớn, nhóm 3 ovan nhỏ, nhóm 6 hình elip nhọn 
và một số chủng nấm men nhóm 4 hình elip 
dài (CM4.4, BL3.2, BT1.1, TV2.3 và TV3.1) 
Phân loại ở mức độ giống các chủng nấm 
men phân lập
Đặc điểm nẩy chồi: Quan sát hình thức tế 
bào nẩy chồi của 55 chủng nấm men với đại 
diện là 6 nhóm hình dạng, kết quả có hai hình 
thức nẩy chồi là nẩy chồi nhiều hướng và nẩy 
chồi lưỡng cực. Tế bào nẩy chồi nhiều hướng 
gồm 5 hình dạng: nhóm 1 nấm men có hình 
cầu nhỏ (CM1.1, CM1.2 và ST1.3), nhóm 2 
nấm men có hình ovan lớn (CM2.2, CM3.1, 
CM4.2, BL1.2, BL2.2, ST1.2, BT1.3, BT2.1, 
BT3.2, BT3.3, TV1.2, TV4.4), nhóm 3 nấm 
men có hình ovan nhỏ (CM1.3, CM2.1, CM3.2, 
CM3.3, CM4.1, CM4.3, BL1.1, BL2.1, BL2.3, 
BL3.1 BL4.3, ST2.1 ST2.3, ST3.1, ST4.3, 
BT1.2 BT3.1, TV2.1, TV2.2, TV3.2, TV4.2), 
nhóm 4 hình elip dài (CM4.4, BL3.2, ST3.3, 
BT1.1, TV2.3, TV3.1, TV4.1) và nhóm 5 hình 
elip ngắn (BL4.2, ST1.1, ST2.2, BT4.2). Tế bào 
nảy chồi lưỡng cực gồm 1 nhóm nấm men là 
nhóm 6 nấm men hình elip nhọn (BL4.1, ST3.2, 
ST4.1, ST4.2, BT2.2, BT4.1, TV1.1 và TV4.3). 
Khả năng tạo bào tử trên môi trường thạch 
nước: Kết quả cho thấy 6 nhóm nấm men đều 
hình thành bào tử trong môi trường nghèo dinh 
dưỡng gồm: nhóm 1 nấm men hình cầu nhỏ tế 
bào xuất hiện 1-2 bào tử hình tròn, nhóm 2 hình 
ovan lớn tế bào xuất hiện 1-2 bào tử hình tròn, 
Nhóm Chủng nấm men
Hình dạng, kích 
thước (µm) tế bào
Tế bào nấm men dưới 
kính hiển vi ở vật kính 
X100
Nhóm 3 CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.1, 
CM4.3, BL1.1, BL2.1, BL2.3, BL3.1 
BL4.3, ST2.1 ST2.3, ST3.1, ST4.3, BT1.2 
BT3.1, TV2.1, TV2.2, TV3.2, TV4.2
Hình ovan nhỏ; 
(3,71-4,20) x 
(2,86-3,42)
Nhóm 4 CM4.4, BL3.2, ST3.3, BT1.1, TV2.3, 
TV3.1, TV4.1
Hình elip dài; 
(6,84-10,77) x 
(3,93-4,57)
Nhóm 5 BL4.2, ST1.1, ST2.2, BT4.2 Hình elip ngắn; 
(2,86-3,13) x 
(1,15-1,42)
Nhóm 6 BL4.1, ST3.2, ST4.1, ST4.2, BT2.2, BT4.1, 
TV1.1, TV4.3
Hình elip nhọn; 
(4,28-4,57) x 
(1,71-2,27)
59
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
BT4.2) và 2 chủng nấm men thuộc nhóm 4 hình 
elip dài (ST3.3 và TV4.1) có khả năng đồng hóa 
urea phân giải thành CO
2
 và NH
3
. 
không có khả năng phân giải urea (Bảng 2). 
Sáu chủng nấm men, trong đó 4 chủng thuộc 
nhóm 5 hình elip ngắn (BL4.2, ST1.1, ST2.2 và 
Bảng 2. Tổng hợp đặc điểm hình thái và sinh lý các các chủng nấm men phân lập
Chủng nấm men
Đặc điểm hình thái Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Giống (phân 
loại sơ bộ)
Hình 
dạng 
nấm men
Kiểu 
nẩy 
chồi
Đặc 
điểm 
bào tử
Khả năng lên 
men đường
Phân 
giải 
urea
Phân 
giải 
gelatinGlu Sac Mal
CM1.1, CM1.2 
ST1.3
Cầu nhỏ
Nhiều 
hướng
1-2 bào 
tử hình 
tròn
+ + + - - Saccharomyces
CM2.2, CM3.1, 
CM4.2, BL1.2, 
BL2.2, ST1.2, 
BT1.3, BT2.1, 
BT3.2, BT3.3, 
TV1.2, TV4.4
Ovan lớn
Nhiều 
hướng
1-4 bào 
tử hình 
tròn
+ + + - - Saccharomyces
CM1.3, CM2.1, 
CM3.2, CM3.3, 
CM4.1, CM4.3, 
BL1.1, BL2.1, 
BL2.3, BL3.1 
BL4.3, ST2.1 
ST2.3, ST3.1, 
ST4.3, BT1.2 
BT3.1, TV2.1, 
TV2.2, TV3.2, 
TV4.2
Ovan nhỏ
Nhiều 
hướng
1-2 bào 
tử hình 
tròn
+ + + - - Saccharomyces ... chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
khuẩn lạc. Đến mức nhiệt độ khảo sát 47°C 
không có chủng nấm men phân lập nào có thể 
sống và phát triển. Khi nhiệt độ tăng cao làm 
ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng 
và lên men của nấm men. Kết quả về khả năng 
chịu nhiệt cũng tương đồng với một số công 
trình công bố gần đây trên nấm men chịu nhiệt 
được phân lập từ đất, ca cao, trái cây, phụ phẩm 
nông nghiệp,... (Dung và ctv, 2012; Nuanpeng 
và ctv, 2016; Phong và ctv, 2016; Techaparin và 
ctv, 2017). 
Kết quả cho thấy các chủng nấm men phân 
lập phần lớn có khả năng chịu nhiệt tốt (94,5% 
chủng nấm men phân lập chịu được nhiệt độ từ 
37°C trở lên). Trong số các chủng nấm men có 
khả năng chịu được nhiệt độ cao phần lớn thuộc 
giống Saccharomyces. Các chủng nấm men 
chịu nhiệt kém chỉ phát triển ở mức nhiệt độ từ 
35°C trở xuống chủ yếu thuộc nhóm Candida 
và Pichia. Kết quả chọn được 52 chủng nấm 
men, ngoại trừ 3 chủng ST3.3, BT4.1 và TV1.1, 
có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 37°C trở 
lên để đánh giá khả năng chịu ethanol.
(Kurztman và ctv, 2011). Những chủng nấm 
men được cho là có enzyme phân giải gelatin 
sẽ có phản ứng dương tính, làm môi trường hóa 
lỏng ở 4°C. Kết quả tổng hợp ở Bảng 2 cho thấy 
chỉ có 5 chủng nấm men có hoạt tính phân giải 
gelatin, những chủng nấm men này thuộc nhóm 
5 hình elip dài (ST3.3 và TV4.1) và nhóm 7 
hình elip ngắn (ST1.1, ST2.2 và BT4.2). Các 
chủng nấm men còn lại không có khả năng 
phân giải gelatin.
Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men
Tất cả 55 chủng nấm men phân lập đều có 
thể phát triển ở nhiệt độ 30 và 35°C sau 48 giờ 
nuôi cấy (Hình 1). Ngoại trừ 3 chủng ST3.3, 
BT4.1 và TV1.1, 52 chủng nấm men còn lại có 
khả năng phát triển ở mức 37°C và cao hơn. 
Ở 39°C, có 38 chủng vẫn có khả năng phát 
triển, tuy nhiên khi tăng đến 41°C, chỉ có 20 
chủng có khả năng phát triển được. Ở nhiệt độ 
43°C, chỉ còn 8 chủng có khả năng phát triển 
và khi tăng đến nhiệt độ 45°C thì chỉ còn duy 
nhất chủng BT2.1 có thể phát triển được thành 
sự phát triển ở các nồng độ ethanol được minh 
họa ở Hình 2. Ở mức 0 và 3% (v/v) ethanol, 
tất cả các chủng nấm men khảo sát đều phát 
triển tốt; khi tăng nồng độ lên 6%, có 41 chủng 
nấm men có thể phát triển thành khuẩn lạc và 
Khả năng chịu ethanol của các chủng nấm 
men
Năm mươi hai chủng nấm men chịu nhiệt 
được nuôi cấy 48 giờ ở 37°C trong môi trường 
có bổ sung ethanol 3, 6, 9, 12 và 15% và kết quả 
30°C 35°C 37°C 39°C 
41°C 43°C 45°C 47°C 
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2 BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2 BL2.1
TV4.4BT2.1
CM3.2
Hình 1. Khuẩn lạc nấm men phát triển trên môi trường YPD ở các nhiệt độ khác nhau
61
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Nhìn chung, các chủng nấm men phân lập 
từ dịch trái giác có khả năng chịu cồn ở mức 
trung bình, chỉ có khoảng 34,5% (19 chủng) 
có khả năng chịu cồn ở mức 9% (v/v) ethanol. 
Trong số các chủng nấm men có khả năng chịu 
cồn tốt, hầu hết thuộc nhóm Saccharomyces. Từ 
kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt và chịu 
ethanol, tuyển chọn được 19 chủng (CM1.1, 
CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.2, 
CM4.3, CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.1, ST1.3, 
ST2.1, ST4.3, BT1.2, BT2.1, BT3.1, BT3.3 và 
TV4.2) có khả năng chịu nhiệt từ 37°C và chịu 
ethanol từ 9% (v/v) trở lên để đánh giá khả năng 
lên men dịch trái giác. 
ở mức 9% thì có 19 chủng có thể phát triển. 
Tuy nhiên, khi tăng nồng độ ethanol lên 12%, 
chỉ có 3 chủng có thể phát triển và hình thành 
khuẩn lạc trên môi trường YPD, trong đó có 
2 chủng phát triển mạnh là CM3.3 và BT3.3, 
chủng TV4.2 phát triển yếu hơn. Ở mức 15% 
ethanol thì không có chủng nấm men nào có 
thể sống và phát triển thành khuẩn lạc được. 
Kết quả này cũng tương tự như công bố của 
Nguyễn Hữu Tường và ctv (2013) và Phong và 
ctv (2016) khi đánh giá khả năng chịu ethanol 
của nấm men chịu nhiệt. 
0% 3% 6% 
9% 12% 15% 
BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2 BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2 BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2
BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2 BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2 BL2.1
TV4.2BT3.3
CM3.2
Hình 2. Khuẩn lạc nấm men phát triển trên môi trường YPD bổ sung ethanol 
ở các nồng độ (% v/v) khác nhau
Đánh giá sơ bộ khả năng lên men dịch trái 
giác
Trong quá trình lên men rượu có hai sản phẩm 
chính là ethanol và CO
2
, để xác định hoạt lực 
lên men của nấm men có thể dựa trên khả năng 
thoát khí CO
2
 trong quá trình lên men (Nguyễn 
Đức Lượng và ctv, 2003). Chiều cao cột khí sinh 
ra trong ống Durham tăng theo thời gian, các 
chủng nấm men khác nhau có chiều cao cột khí 
CO
2
 sinh ra khác nhau (Bảng 3). Cụ thể, sau 6 
giờ lên men, có 6 chủng làm đầy cột khí trong 
ống Durham nhanh nhất là CM2.1, CM3.2, 
CM4.2, BL2.1, BL4.3, ST2.1 và BT1.2. Ba 
chủng CM1.1, CM2.1 và ST1.3 có khả năng 
làm đầy cột khí (30,0 mm) sau 12 giờ lên men. 
Sau 18 giờ lên men, có thêm 2 chủng làm đây 
cột khí (BT2.1 và BT3.3) và các chủng CM1.3, 
CM3.3, CM4.3, BT3.1 và TV4.2 mất 24 giờ để 
làm đầy cột khí trong ống Durham. Sau 30 giờ, 
hầu hết các chủng nấm men đều sinh khí chiếm 
đầy thể tích ống Durham (trừ chủng ST1.1). 
Chủng nấm men ST1.1 có thời gian làm đầy 
cột khí khá chậm, cụ thể trong thời gian từ 36-
48 giờ chiều cao cột khí của ST1.1 không thay 
đổi, sau 36 giờ lên men chủng nấm men này đã 
ngừng làm tăng lượng khí CO
2 
sinh ra. 
Tuy nhiên, chiều cao ống Durham tối đa chỉ 
có 30 mm nên không thể đánh giá chính xác 
được khả năng lên men của các chủng nấm 
men khi trung bình chiều cao cột khí khi đã 
62
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Durham 30 mm trong 48 giờ) để tiến hành thử 
nghiệm khả năng lên men rượu vang trái giác. 
Như vậy, 18 chủng nấm men (CM1.1, CM1.3, 
CM2.1, CM3.2, CM3.3, CM4.2, CM4.3, 
CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.3, ST2.1, ST4.3, 
BT1.2, BT2.1, BT3.1, BT3.3 và TV4.2) được 
chọn cho thử nghiệm này, các chủng này đều 
thuộc giống Saccharomyces.
đạt mức tối đa. Do đó, phải tiến hành lên men 
trong bình tam giác, các chủng nấm men có thời 
gian lên men dài hơn, giúp cho việc đánh giá 
chủng nấm men có hoạt tính lên men tốt một 
cách chính xác hơn. Từ kết quả thí nghiệm ở 
các thí nghiệm trên, tuyển chọn những chủng 
nấm men có khả năng chịu nhiệt từ 37oC trở lên, 
chịu ethanol từ 9% trở lên và lên men tốt (có 
khả năng sinh khí chiếm đầy thể tích chuông 
Bảng 3. Chiều cao cột khí CO
2
 (mm) trong chuông Durham sau 48 giờ lên men
Stt Chủng nấm men
Thời gian lên men trên dịch trái giác (giờ)
6 12 18 24 30 36 42 48
1 CM1.1 13,0 30,0 - - - - - -
2 CM1.3 9,33 23,3 29,3 30,0 - - - -
3 CM2.1 17,3 30,0 - - - - - -
5 CM3.2 30,00 - - - - - - -
4 CM3.3 9,33 15,7 19,0 30,0 - - - -
6 CM4.2 30,0 - - - - - - -
7 CM4.3 2,33 4,67 25,3 30,0 - - - -
8 CM4.4 0,0 5,67 7,33 15,7 19,0 30,0 - -
9 BL2.1 30,0 - - - - - - -
10 BL4.3 30,0 - - - - - - -
11 ST1.1 5,00 10,0 11,7 16,7 19,3 23,3 23,3 23,3
12 ST1.3 27,3 30,0 - - - - - -
13 ST2.1 30,0 - - - - - - -
14 ST4.3 1,33 4,00 7,33 17,7 30,0 - - -
15 BT1.2 30,0 - - - - - - -
16 BT2.1 7,33 10,0 30,0 - - - - -
17 BT3.1 6,00 10,3 15,0 30,0 - - - -
18 BT3.3 8,00 18,7 30,0 - - - - -
19 TV4.2 5,33 11,3 28,3 30,0 - - - -
Ghi chú: “-”: chiều cao cột khí trong chuông Durham đạt mức tối đa 30 mm. Giá trị ghi trong bảng 
là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Khả năng lên men rượu vang trái giác
Khả năng lên men được khảo sát với mật độ 
nấm men 107 tế bào/mL trong 7 ngày ở 37oC, 
dịch ép được điều chỉnh về pH 4,5 và 22oBrix. 
Kết quả khảo sát khả năng lên men của 18 chủng 
nấm men trong 100 mL dịch trái giác được thể 
hiện ở Bảng 4. Sau khi lên men, pH và Brix ở 
các nghiệm thức đều giảm do nấm men sử dụng 
đường làm nguồn carbon. Hàm lượng ethanol 
là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để 
đánh giá khả năng lên men rượu của các chủng 
nấm men. Kết quả thống kê từ Bảng 4 cho thấy, 
trong 18 chủng nấm men lên men rượu vang 
trái giác thì hàm lượng ethanol trung bình sau 
lên men cao nhất là chủng CM3.2 (8,95% v/v), 
kế đến là chủng CM3.3 (7,01% v/v) và BT1.2 
(6,79% v/v). Các chủng nấm men (CM1.1, 
ST1.3 và BT3.1) có độ rượu sinh ra thấp nhất 
chỉ trong khoảng từ 3,19-3,79% (v/v). 
Kết hợp so sánh với kết quả đo chiều cao cột 
khí CO
2
 trong ống Durham (Bảng 3) trong dung 
63
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
thích thời gian thí nghiệm trong ống Durham 
khá ngắn, các chủng nấm men CM1.1, CM4.3, 
BL4.3 và ST1.3 ban đầu tốc độ lên men nhanh 
tạo ra lượng CO
2
 nhưng quá trình lên men lại 
kết thúc sớm. Ngược lại, một số chủng nấm 
men (như CM3.3, CM4.4 và BT2.2) lên men 
chậm hơn nhưng thời gian lên men kéo dài nên 
có khả năng tạo được lượng ethanol cao hơn. 
dịch đường glucose và dịch trái giác, các chủng 
CM1.1, CM4.3, BL4.3 và ST1.3 tuy có thời 
gian làm đầy cột khí trong ống Durham nhanh 
(sau 12-18 giờ) nhưng hàm lượng ethanol sau 
lên men lại rất thấp (chỉ từ 3,65-4,58% v/v), còn 
các chủng CM3.3, CM4.4 và BT2.2 tuy thời 
gian làm đầy cột khí ống Durham lâu hơn (24-
36 giờ) nhưng hàm lượng ethanol sau lên men 
lại cao hơn nhiều (6,61-7,01% v/v). Có thể giải 
Bảng 4. Kết quả khả năng lên men của các chủng nấm men
Stt Chủng nấm men pH sau lên men Độ Brix sau lên men
Hàm lượng ethanol
(% v/v ở 20oC)
1 CM1.1 3,41 15,7 3,79 ± 0,24i
2 CM1.3 3,44 16,3 4,88 ± 0,13fg
3 CM2.1 3,43 16,0 5,02 ± 0,12f
5 CM3.2 3,52 11,0 8,95 ± 0,40a
4 CM3.3 3,35 15,0 7,01 ± 0,38b
6 CM4.2 3,49 17,3 5,02 ± 0,12f
7 CM4.3 3,34 14,7 4,50 ± 0,10h
8 CM4.4 3,33 14,3 6,56 ± 0,01cd
9 BL2.1 3,32 14,0 6,61 ± 0,11cd
10 BL4.3 3,46 16,3 4,58 ± 0,13gh
11 ST1.3 3,49 17,7 3,65 ± 0,13i
12 ST2.1 3,34 14,0 6,48 ± 0,27cd
13 ST4.3 3,40 16,7 4,65 ± 0,13gh
14 BT1.2 3,34 14,7 6,79 ± 0,02bc
15 BT2.1 3,35 14,7 6,09 ± 0,01e
16 BT3.1 3,46 17,7 3,19 ± 0,15j
17 BT3.3 3,38 15,0 6,09 ± 0,02e
18 TV4.2 3,40 16,0 6,32 ± 0,40de
Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại. Các ký hiệu trên các số liệu giống nhau thì không khác 
biệt ý nghĩa với độ tin cậy 95%.
Từ các thí nghiệm trên, có thể thấy chủng 
nấm men Saccharomyces sp. CM3.2 có nhiều 
đặc điểm vượt trội như khả năng chịu nhiệt cao 
(43°C), thời gian làm đầy cột khí trong ống 
Durham sớm nhất đạt 30 mm (6 giờ cả trong 
dịch đường glucose 2% (w/v) và trong dịch 
trái giác 22°Brix) và tạo ra hàm lượng ethanol 
cao nhất (8,95% v/v) trong các chủng nấm men 
phân lập. Do đó, chủng nấm men Sacchromyces 
sp. CM3.2 là chủng có khả năng lên men cao 
nhất được tuyển chọn để thử nghiệm và ứng 
dụng trong lên men men rượu vang trái giác.
KẾT LUẬN
Kết quả phân lập được 55 chủng nấm men 
thuần chủng từ 20 mẫu nguyên liệu trái giác 
được thu thập ở 5 tỉnh thuộc vùng đất mặn ven 
biển vùng Đồng bằng Sông Cửu Long (Cà Mau, 
Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh). 
Các chủng nấm men phân lập được phân loại 
thuộc 3 giống bao gồm Saccharomyces, Pichia 
và Candida. Tuyển chọn được 19 chủng nấm 
men (CM1.1, CM1.3, CM2.1, CM3.2, CM3.3, 
CM4.2, CM4.3, CM4.4, BL2.1, BL4.3, ST1.1, 
ST1.3, ST2.1, ST4.3, BT1.2, BT2.1, BT3.1, 
64
Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2/2018 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Chí Minh: 260-291.
Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, 
2005. Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn 
etylic. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 
Hà Nội: 67-70.
Nguyễn Hữu Tường, Phạm Hồng Quang, Ngô 
Thị Phương Dung, Huỳnh Xuân Phong, 
Nguyễn Minh Đời, 2013. Thử nghiệm lên 
men ethanol ở nhiệt độ cao bằng nấm men 
chịu nhiệt. Tạp chí Khoa học Đại học Cần 
Thơ 27: 17-23.
Nuanpeng S., Thanonkeo S., Yamada M., and 
Thanonkeo P. (2016). Ethanol production 
from sweet sorghum juice at high temperatures 
using a newly isolated thermotolerant yeast 
Saccharomyces cerevisiae DBKKU Y-53. 
Energies 9(4): 253.
Perumal P.C., Sowmya S., Pratibha P., Vidya 
B., Anusooriya P., Starlin T., Ravi S., 
and Gopalakrishnan V.K., 2015. Isolation, 
structural characterization and in silico drug-
like properties prediction of a natural 
compound from the ethanolic extract 
of Cayratia trifolia (L.). Pharmacognosy 
Reviews 7(1): 121-125.
Phong H. X., Giang N.T.C., Nitiyon S., 
Yamada M., Thanonkeo P., & Dung N.T.P. 
(2016). Ethanol production from molasses 
at high temperature by thermotolerant yeasts 
isolated from cocoa. Can Tho University 
Journal of Science 3: 32-37.
Roehr M., (2001). The Biotechnology of 
Ethanol: Classical and Future Applications. 
Federal Republic of Germany: 203-210.
Techaparin A., Thanonkeo P., & Klanrit P., 
2017. High-temperature ethanol production 
using thermotolerant yeast newly isolated 
from Greater Mekong Subregion. Brazilian 
Journal of Microbiology 48(3): 461-475.
Yuangsaard N., Yongmanitchai W., Yamada 
M., & Limtong S., 2013. Selection and 
characterization of a newly isolated 
thermotolerant Pichia kudriavzevii strain for 
ethanol production at high temperature from 
cassava starch hydrolysate. Antonie van 
Leeuwenhoek 103(3): 577-588.
BT3.3 và TV4.2) có khả năng chịu nhiệt trong 
khoảng 37-45°C và chịu ethanol ở mức 9-12% 
(v/v), trong đó chủng Saccharomyces sp. CM3.2 
được tuyển chọn khi lên men dịch trái giác ở 
37°C với hàm lượng ethanol đạt 8,95% (v/v).
LỜI CẢM ƠN 
Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn sự hỗ 
trợ một phần kinh phí từ Chương trình CCP 
(Core-to-Core Program, 2014-2019).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bùi Ái, 2005. Công nghệ lên men ứng dụng 
trong Công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản 
Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh: 220-
227.
Dung N.T.P., Thanonkeo P., and Phong H.X., 
2012. Screening useful isolated yeasts for 
ethanol fermentation at high temperature. 
International Journal of Applied Science 
and Technology 2(4): 65-71.
Gupta A.K., Shamar M., 2007. Review on 
Indian Medical Plant. New Delhi: Indian 
Council of Medical Research 7: 879-882.
Kumar D., Kumar S., Gupta J. Arya 
R., and Gupta. A. 2011. A review on chemical 
and biological properties of Cayratia trifolia 
Linn. (Vitaceae). Pharmacognosy Reviews 
10: 184-188.
Kurtzman C.P., Fell J.W., Boekhout T., and 
Robert V., 2011. Methods for isolation, 
phenotypic characterization and 
maintenance of yeasts. In C. P. Kurtzman, J. 
W. Fell, & T. Boekhout (Eds.), The Yeasts, a 
Taxonomic Study (5th ed., Vol. 1). San Diego: 
Elsevier B.V: 87-110.
Limtong S., Sringiew C., and Yongmanitchai 
W., 2007. Production of fuel ethanol at 
high temperature from sugar cane juice by 
a newly isolated Kluyveromyces marxianus. 
Bioresource Technology 98: 3367-3374.
Lương Đức Phẩm. 2006. Nấm men công nghiệp. 
Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 
9-18, 56-60. 
Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và 
Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công 
nghệ sinh học tập 2-Thí nghiệm vi sinh vật 
hoc. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ