Thu nhận protein Lz - 8 từ dịch huyền phù tế bào nấm linh chi bằng kỹ thuật sắc ký cột GPC và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
31 
THU NHAÄN PROTEIN Lz-8 TÖØ DÒCH HUYEÀN PHUØ 
TEÁ BAØO NAÁM LINH CHI BAÈNG KYÕ THUAÄT SAÉC KYÙ COÄT 
GPC VAØ SAÉC KYÙ LOÛNG HIEÄU NAÊNG CAO 
Nguyeãn Baù Tö
(1)
, Nguyeãn Thanh Thuaän
(1)
, 
Nguyeãn Anh Duõng
(1)
, Taêng Coâng Tröôøng
(2) 
(1) Trường Đại học Thủ Dầu Một, (2) Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Dương 
TÓM TẮT 
Trong bài báo này chúng tôi công bố các kết quả từ việc sử dụng hệ thống sắc ký GPC và 
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC nhằm làm tăng hiệu quả thu nhận Lz-8 tự nhiên (Lz-8 là một 
protein trong họ protein điều chỉnh miễn dịch (fungal immunomodulatory protein -FIP)). Kết 
quả chỉ ra rằng, qua phân tích Deconvolution từ HPLC cho thấy có một mass với giá trị: 
12420 ±0.005 Da. Lz-8 khá giàu Asparagine (chiếm 18.37%), tiếp theo là Valin (9.79%) và 
Threonine (8.24%). Đồng thời, kết quả cũng chỉ ra Lz-8 tinh sạch từ phân đoạn 1GPC thiếu 
vắng sự có mặt của một số amino acid như Half-Cystein, Methionine. Lz-8 thu nhận được có 
phản ứng gây tan cục máu đông của cả bốn nhóm máu người, nhưng không làm tan đối với 
máu cừu, điều này chứng tỏ hoạt tính của loại protein này. Sử dụng phương pháp HPLC chúng 
tôi thấy hiệu quả ly trích Lz-8 đạt được là 30%, cao hơn phương pháp trước đây của Kino và 
cộng sự (cs) (1989) sử dụng hệ thống sắc ký lọc gel Sephadex G75 với hiệu quả thu được rất 
thấp, chỉ khoảng 5-10 mg Lz-8 từ 340 gram thể qua. 
Từ khóa: linh chi, thu nhận, sắc ký GPC, sắc ký HPLC, amino acid 
* 
1. Giới thiệu 
Họ nấm Linh chi (Ganodermataceae) 
hiện biết có hơn 200 loài với nhiều loài quý 
hiếm như Linh chi chuẩn (Ganoderma 
lucidum (Fr.) Karst) đã được sử dụng trong 
lĩnh vực y dược ở Phương Đông hơn 2000 
năm nay (Stamets, 1993) nhằm điều trị 
nhiều loại bệnh khác nhau ở người như 
bệnh viêm gan mãn tính, cao huyết áp, 
cholesteron hoá mạch máu, tiểu đường, tắc 
nghẽn động mạch vành, hen suyễn, viêm 
loét dạ dày.... (Hobbs, 1995). 
Hiện nay, việc nuôi trồng nấm linh chi 
để thu nhận sinh khối và chiết xuất các sản 
phẩm thứ cấp đang là một hướng nghiên 
cứu mũi nhọn trong lĩnh vực y - sinh học, 
tập trung tác động vào hệ miễn dịch cơ thể 
chống lại các bệnh nội sinh cũng như các 
kháng nguyên ngoại lai bất lợi [1],[2],[3]. 
Về thành phần hoá học và các hoạt 
chất, hiện nay đã xác định được trong nấm 
Linh chi có khoảng 119 loại triterpens và 
nhiều loại polysaccharide có giá trị như 1,3 
- D glucan đang được xem là yếu tố mới có 
tác dụng chống ung thư. Các nghiên cứu 
của Krcmar và cs (1999), Zhang và cs 
(2001), Tang và cs (2006), Qin và cs 
(2008), cho thấy các hoạt chất triterpens, 
polysacchrides, và protein có nguồn gốc từ 
thể quả nấm Linh chi đều có mối tương 
Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 32 
quan dương tính với các đáp ứng miễn dịch 
cơ thể. Chẳng hạn, Tang và cs (2006) đã 
chứng minh acid ganoderic T (AG-T) (một 
loại lanostane triterpenoid) ở loài Linh chi 
chuẩn với hàm lượng 50 µg/ ml đã có thể 
gây ức chế dòng tế bào ung thư phổi 95 D 
thông qua cơ chế apoptosis và gây nên sự 
nghỉ hoá chu kỳ tế bào chỉ sau 4-8 h, trong 
nghiên cứu này tác giả còn công bố AG-T 
có khả năng điều chỉnh mức biểu hiện của 
p53 và Bax (hai protein quan trọng tham 
gia kiểm soát các điểm giới hạn trong chu 
kỳ tế bào); hay Habijanic và cs (2001) đã 
chứng minh hiệu quả điều chỉnh miễn dịch 
của polysaccharide cũng từ Linh chi đỏ lên 
khả năng tăng sinh một số dòng cytokine 
(TNF- và INF-¥). 
Ngoài ra, họ protein điều chỉnh miễn 
dịch FIPs (fungal immunomodulatory pro-
tein) đang được giới khoa học hết sức chú ý 
trong việc nghiên cứu sử dụng điều trị các 
bệnh hiểm nghèo. FIP được phát hiện lần đầu 
tiên năm 1989 ở loài Linh chi chuẩn (Kino và 
cs, 1989) với tên gọi Lz-8 (FIP-glu) và cũng 
là FIP được nghiên cứu kỹ nhất với vai trò 
như một loại protein chống dị ứng phổ rộng 
và điều hoà miễn dịch, Qin và cs (2008) đã 
chứng minh với hàm lượng 5 µg/ ml protein 
Lz-8 đã có thể làm tế bào lách chuột tăng 
sinh tới 149% còn với hàm lượng 10 µg/ ml 
thì protein này đã chống được phản ứng 
ngưng kết máu ở người. Cho tới nay, FIP đã 
được tìm thấy ở nhiều loài nấm khác nhau từ 
nấm dược liệu như linh chi đến nấm ăn như 
kim châm, nấm rơm với cùng một phương 
pháp cổ điển như đã phát hiện ra Lz-8. 
Sau khi các protein FIP được phát hiện 
tồn tại tự nhiên trong các loài nấm, cho tới 
nay, các gen mã hoá đã được xác định và 
chuyển vào các thể mang bao gồm cả 
prokaryote và eukaryote theo hướng DNA 
tái tổ hợp (reDNA) nhằm nâng cao hiệu 
suất tổng hợp các protein FIP tái tổ hợp 
(reFIP). Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho 
thấy không những hiệu suất thu nhận còn 
khá thấp mà hoạt tính các reFIP cũng kém 
xa các FIP tự nhiên (Ko và cs, 1997; Lin và 
cs, 1997; Jinn và cs, 2006; Li và cs, 2010). 
Chính vì vậy, trong bối cảnh chưa tìm được 
một hệ thống hoàn hảo các sinh vật chuyển 
gen thì việc tìm môi trường thích hợp cho 
nuôi cấy huyền phù thu nhận các FIP tự 
nhiên vẫn là một hướng quan trong trọng 
trong nghiên cứu dược học. 
Sắc ký cột GPC kết hợp với hệ sắc ký 
lỏng hiệu năng cao HPLC đã trở thành một 
quy trình tối ưu cho việc tách chiết nhiều 
hợp chất thiên nhiên như polysaccharide 
hay protein. Lz-8 với bản chất là một lectin 
(dạng glyco-protein) được xem là khá phù 
hợp với hệ thống sắc ký này. Sau khi thu 
nhận hệ sợi từ kết quả nuôi cấy huyền phù, 
chúng tôi tiến hành ly trích protein đích. 
Sau đây là một số kết quả đạt được. 
2. Vật liệu và phương pháp 
– Chủng Linh chi đỏ (G. Lucidum) 
được cung cấp bởi công ty TNHH nấm 
dược liệu Phú Trường An (huyện Long 
Thành, tỉnh Đồng Nai). 
– Hệ sợi được thu nhận từ dịch lỏng, 
nghiền nhỏ và rửa nhiều lần với PBS 
10mM sau đó đem ly tâm 10.000 v/phút 
trong khoảng 10 phút. 
– Thu dung dịch và đông cô trong điều 
kiện lạnh thăng hoa làm giàu protein 
– Thu phân đoạn có khối lượng 11-
15KD bằng sắc ký cột GPC. 
• Cột Ultrahydrogel 500, kích thước 7.8 
X 300mm ( đường kính 7.8mm, dài 
300mm), kích thước hạt 10 µm. 
• Pha động: dung dịch Tris-HCl 10 mM 
pH 8 
•Tốc độ dòng 1mL/phút. 
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
33 
• Đầu dò RID (Refractive Index Detector). 
• Quy trình: mẫu sau khi đông cô được 
thêm dung dịch Tris-HCl 10mM pH 8 và 
lắc, ly tâm và hút lấy phần nước tiêm vào 
hệ GPC. 
Xác định hoạt tính LZ-8 bằng phương 
pháp gây đông máu trên máu người và máu 
cừu 5 ml máu mỗi loại đem rửa với PBS 5 
lần ly tâm 5000 v/phút trong 10 phút loại 
bỏ huyết tương, đem thử hoạt tính với 25µl 
protein (phân đoạn I GPC) trong 25µl 
gelatin 0,2%. Ủ qua đêm (12 giờ) và xem 
kết quả. 
– Xác định khối lượng protein bằng 
phương pháp HPLC-MS 
– Cột KommersiL C4, kích thước hạt 
5µm, kích thước 2.1X150mm. Pha động: 
Pha A: Tris HCl 0.01%; Pha B: acetolnitrin 
– Thành phần amino acid. 
Quy trình phân tích: 
Thông số kỹ thuật 
• Cột ZORBAX Extend C18, kích 
thước hạt 5µm, kích thước 4.6 X 250mm 
• Pha động: pha A: 90%dung dịch đệm 
pH 2.8 + 5% Acetonitril + 5% Isopropanol, 
pha B: 20% dung dịch đệm pH 1.8+ 40% 
Acetonitril +40% Isopropanol. 
• Đầu dò UV bước sóng 250 nm. 
• Tốc độ dòng 1mL/phút. 
– Tiến trình: mẫu sau khi thủy phân 
protein thành các amino acid và tạo dẫn 
xuất được hòa tan lại bằng pha A và tiêm 
vào hệ thống. Xác định thành phần amino 
acid dựa trên phương pháp đường chuẩn 
(kit amino acid) 
3. Kết quả và bàn luận 
Sau khi thu được hệ sợi với sinh khối 
cao nhất tại pH 5.0 và 300C (Nguyễn Bá Tư 
và cs, 2013) từ quá trình nuôi cấy huyền 
phù, chúng tôi tiến hành xác định sự có mặt 
của protein Lz-8 bằng các phương pháp sắc 
ký GPC và sắc ký lỏng hiệu năng cao 
HPLC sử dụng đầu dò UV và MS. 
3.1. Tinh sạch Lz-8 
Hình 1: Sắc ký cột GPC thu nhận 
protein Lz8 
Kết quả cho chạy GPC phát hiện một 
peak có khối lượng trong khoảng 11.000 
Da -15.000 Da phù hợp với khối lượng 
chung của các protein FIP đã biết. Phân 
đoạn sau khi thu nhận được đem thử hoạt 
tính hemagglutination trên máu người (A, 
B, AB, O) và máu cừu đề khẳng định 
protein đích đã thu được. Kết quả được 
trình bày trong hình 1 & 2. 
Quy trình: 5 ml máu mỗi loại đem rửa 
với PBS 5 lần ly tâm 5000v/phút trong 10 
phút loại bỏ huyết thanh, đem thử hoạt tính 
với 25µl protein (phân đoạn I GPC) trong 
25µl gelatin 0,2%. Ủ qua đêm (12 giờ) và 
xem kết quả. 
Hình 2: Kết quả thử hoạt tính 
Hemagglutination phân đoạn I GPC 
Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 34 
Kết quả thử phản ứng gây tan cục máu 
đông cho thấy phân đoạn I GPC đã có phản 
ứng dương tính làm tan tất cả các cục máu 
đông với cả bốn nhóm máu người (A, B, 
AB, O) trong khi âm tính với máu cừu. Kết 
quả này chỉ ra đây chính là protein đích cần 
thu nhận Lz-8. 
3.2. Khối lượng protein 
Sau khi xác định chính xác phân đoạn I 
GPC nhạy cảm với phản ứng hemagglu-
tination, chúng tôi tiến hành xác định trọng 
lượng phân tử protein đích bằng HPLC-
MS. Kết quả được chỉ ra trong hình 3.
Hình 3. Kết quả phổ đồ MS của Lz-8 trong giai đoạn tách GPC phân đoạn 1 
Ghi chú: Đường TIC 
Kết quả Deconvolution cho thấy có một 
mass với giá trị: 12420 ±0.005 Da. Kết quả 
cũng cho thấy mass của phân đoạn thu được 
từ HPLC MS phù hợp với khoảng mass thu 
được từ GPC (khoảng 11.000 Da -15.000 
Da) và cũng phù hợp về khối lượng chính 
xác của peotein Lz-8 theo các nghiên cứu của 
Kino và cs (1989); Ko và cs (1997) nhưng 
hơi khác so với khối lượng của reLz-8 của 
Liang và cs (2009) với khối lượng 14.000 Da 
bằng SDS-PAGE và 12.722 bằng kỹ thuật 
MALDI-TOF-MS, hay trong nghiên cứu của 
Xue và cs (2008) lại cho thấy reLz8 có khối 
lượng 17.000 Da 
Từ các kết quả trên cho thấy khối 
lượng thực tế của protein Lz-8 có sự dao 
động tuỳ theo phương pháp tinh sạch và 
loại tự nhiên hay hoang dại. Tuy nhiên, 
yếu tố quyết định khẳng định chính xác 
có phải protein này hay không chính là 
thành phần, trình tự các amino acid và 
hoạt tính sinh học. 
3.3. Thành phần amino acid 
Xác định thành phần amino acid dựa 
trên phương pháp đường chuẩn (kit amino 
acid) 
Kết quả thu được ở hình 4 và bảng 1. 
Hình 4. Sắc 
ký đồ mẫu 
protein được 
tách từ phân 
đoạn 1 của 
GPC 
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
35 
Bảng 1. Thành phần amino acid từ phân đoạn I GPC bằng phương pháp HPLC-UV 
Amino acid % (W/W) Amino acid % (W/W) 
Asparagine 
Threonine 
Glycine 
Serine 
Glutamic 
Alanine 
Half-Cystein 
Isoleucine 
Leucine 
18,37± 0.15 
8.24 ± 0.15 
7.61 ± 0.10 
5.78 ± 0.18 
5.43 ± 0.32 
6.77 ±0.15 
0.00 ±0.00 
5.31 ± 0.01 
5.56 ±0.01 
Valine 
Methionine 
Arginine 
Trptophan 
Tyrosine 
Phenylalanine 
Lysine 
Histidine 
Proline 
9.79 ±0.01 
0.00 ±0.00 
3.40 ±0.01 
2.64 ±0.07 
5.23 ±1.01 
6.00 ±0.08 
5.24 ±0.03 
0.00 ±0.00 
4.58±0.33 
Từ các kết quả phân tích cho thấy Lz-8 
khá giàu Asparagine (chiếm 18,37%), tiếp 
theo là Valin (9.79%) và Threonine (8,24%). 
Đồng thời, kết quả cũng chỉ ra Lz-8 tinh sạch 
từ phân đoạn 1GPC thiếu vắng sự có mặt của 
một số amino acid như Half-Cystein; 
Methionine (trên thực tế thì amino acid này 
vẫn tồn tại ở cấu trúc sơ cấp, nhưng khi hình 
thành cấu trúc cấp hai thì amino acid đầu tiên 
là Serine sẽ bị acetyl hoá nên không thể liên 
kết với Methionine làm tách amino acid này 
ra); và thậm chí còn vắng mặt cả Histidine. 
Kết quả này cũng phù hợp với các công bố 
của Kino và cs (1989), Tanaka và cs (1989), 
Ko và cs (1995). 
3.4. Hàm lượng đường tổng số 
Hình 5. Kết quả 
phổ MS xác định 
hàm lượng đường 
của phân đoạn 1 
từ GPC 
(mass của [M+Na]+ 203.0524 Da) 
Kết quả từ phân tích HPLC-MS thu được 
hàm lượng đường tổng số chiếm 12.46%. Từ 
kết quả này cho thấy hàm lượng đường khá 
cao trong nấm linh chi, mặt khác bản chất 
Lz-8 là một lectin (glyco protein), điều này 
góp phần giải thích tại sao việc xác định 
chính xác khối lượng Lz-8 gặp nhiều khó 
khăn. Trên thực tế đã có nhiều công bố 
không thống nhất về sinh khối Lz-8 (Kino và 
cs, 1989; Xue và cs, 2008; Li và cs, 2011). 
3.5. Hiệu quả thu nhận protein Lz-8 
Theo nhiều nghiên cứu (Kino và cs, 
1989; Ko và cs, 1995; Hsu và cs, 1997; ) 
cho thấy hiệu quả ly trích các protein tự 
nhiên thuộc họ FIPs phụ thuộc chủ yếu hai 
vấn đề: (1) nguồn vật liệu nấm là thể quả 
hay hệ sợi, do vách tế bào nấm được phủ 
bởi lớp kitin khá dày nên việc phá tế bào sẽ 
gặp nhiều khó khăn thậm chí làm biến tính 
protein đích dẫn đến hiệu quả ly trích 
không cao; (2) phương pháp ly trích protein 
FIP. Trên thực tế đã có nhiều phương pháp 
được áp dụng như sắc ký cột nhồi 
Sephadex 75, sắc ký trao đổi ion, sắc ký 
lỏng cao áp với đầu dò UV hoặc MS 
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 
phương pháp sắc ký lỏng cao áp với đầu dò 
MS và UV từ phân đoạn GPC. So với các tác 
giả khác thì phương pháp này hiệu quả hơn 
(kết quả được trình bày trong bảng 2). 
Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 36 
Bảng 2. Hiệu quả thu nhận protein FIP từ các phương pháp khác nhau 
Loại 
FIP 
Nguồn gốc Nguồn 
vật liệu 
Khối 
lượng 
mẫu 
(gram) 
Lượng 
protein 
thu nhận 
(mg) 
Hiệu quả 
thu nhận 
(%) 
Phương pháp Tác giả/năm 
FIP- glu Ganoderma lucidum Hệ sợi 340 10 13 Sephadex G-75 
Sắc ký trao đổi ion 
Kino và cs 1989 
FIP-fve Flammulina velutipes Thể quả 400 35 25 Sắc ký trao đổi ion Ko và cs, 1995 
FIP-vvo Volvariella volvacea Thể quả 3000 115 32 Sắc ký trao đổi ion Hsu và cs, 1997 
FIP- glu Ganoderma lucidum Hệ sợi 500 39 30 Sắc ký lỏng HPLC 2012 
Kết quả bảng 2 cho thấy, trên thực tế 
các phương pháp ly trích protein FIP tự 
nhiên từ các chủng nấm vẫn chưa hoàn 
thiện, biểu hiện là hiệu quả ly trích vẫn còn 
thấp mặc dù chúng ta đều biết rằng, hoạt 
tính của protein tự nhiên luôn cao hơn 
nhiều so với protein thu được từ các mô 
hình tái tổ hợp. 
Trong kết quả này, bằng việc sử dụng 
phương pháp HPLC đã góp phần cải thiện 
hiệu xuất ly trích từ 13% (Kino và cs, 1990) 
lên 30%, nhưng nhìn chung so với các 
phương pháp gần đây sử dụng sắc ký trao đổi 
in trên các loại FIP khác thì vẫn chưa cao hơn 
(FIP-vvo là 32%; FIP-fve là 25%) một cách 
đáng kể. Điều này có lẽ còn phụ thuộc nhiều 
yếu tố, chẳng hạn chủng nấm, cách phá tế 
bào, hay quy trình thiết lập hệ thống HPLC 
với các pha động khác nhau. Như vậy, để 
nâng cao hiệu quả từ HPLC thì cần thay đổi 
pha động và thậm chí cả cột sắc ký trong hệ 
GPC trước khi đưa vào HPLC. 
4. Kết luận 
Trong kết quả này, lần đầu tiên đối với 
Lz-8, hai hệ sắc ký GPC và HPLC đã được 
kết hợp và thu nhận thành công với hiệu 
quả tăng từ 13% (Kino và cs, 1989) lên 
30%. Từ kết quả phân tích trọng lượng, 
thành phần amino acid của Lz-8 cho thấy 
protein này có trọng lượng 12420 Da với 
cho thấy sự giàu Asparagine (chiếm 
18,37%), tiếp theo là Valin (9.79%) và 
Threonine (8,24%). Đồng thời, kết quả 
cũng chỉ ra Lz-8 tinh sạch từ phân đoạn 
1GPC thiếu vắng sực có mặt của một số 
amino acid như Half-Cystein; Methionine. 
RECEIVING PROTEIN LZ-8 FROM SUSPENSOID FLUID CELLS OF REISHI 
MUSHROOM (GANODERMA LUCIDUM) BY THE TWO TECHNIQUES OF 
GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC AND HIGH-PERFORMANCE 
LIQUID CHROMATOGRAPHY 
Nguyen Ba Tu
(1)
, Nguyen Thanh Thuan
(1)
, Nguyen Anh Dung
(1)
, Tang Cong Truong
(2) 
(1) Thu Dau Mot University, (2) The Department of Science and Technology of Binh 
Duong province 
ABSTRACT 
 In this paper, we are publishing the results from the application of the gel permeation 
chromatography GPC and high-performance liquid chromatography HPLC to increase 
receiving efficiency of natural Lz-8 (Lz-8 is a protein in the immune regulatory protein family 
(fungal immunomodulatory protein FIP-)). Through deconvolution analysis from HPLC, the 
results indicated a mass with value of 12420 ± 0.005 Da. Lz-8 is quite rich of Asparagine 
(accounted for 18.37%), followed by Valin (9.79%) and Threonine (8.24%). At the same time, 
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
37 
the results also indicated that Lz-8 purified from 1GPC segments is lack of the presence of 
certain amino acids such as Half-Cysteine; Methionine. The acquired Lz-8 had reactions which 
caused blood clot-dissolving in the four types of human blood, but did not dissolve clots on 
sheep blood. It showed the activity of this type of protein. Using the HPLC method, we found 
that the achieved efficiency of extracted Lz-8 was 30%, higher than the method of Kino et al 
(cs) (1989) which used the Sephadex G75 gel filtration chromatography system with very low 
performance, only about 5-10 mg of Lz-8 from 340 gram of ascomata. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Hsu HC, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1997), Fip-vvo, a New Fungal 
Immunomodulatory Protein Isolated from Volvariella volvacea, J. Biol. Chem., 323: 
557-565. 
[2] JINN et al, Functional Expression of FIP-gts, a Fungal Immunomodulatory Protein 
from Ganoderma Tsugae in Sf21 Insect Cells, 2006, Biology chemistry. 
[3] Liang, et al. (2009), Ganoderma lucidum immunomodulatory protein (Lz-8) expressed 
in Pichia pastoris and the identification of immunocompetence, Department of 
Cytobiology, Institute of Frontier Medical Science, Jilin University, Changchun, China. 
[4] Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, Watanabe J, Tanaka S, KerKry O, Shimizu K, 
Tsunoo H (1989), Isolated and characterization of a new immunomodulatory protein 
ling zhi-8 (LZ-8), from Ganoderma lucidum, J. Biol. Chem., 264: 472-478. 
[5] Ko et al (1995), A new fungal immunomodulatory protein, FIP-fve isolated from the 
edible mushroom, Flammulina velutipes and its complete amino acid sequence, Eur. J. 
Biochem. 228, 244-249. 
[6] Lin WH, Hung CH, Hsu CI, Lin JY (1997), Dimerization of the N-terminal 
Amphipathic a-Helix Domain of the Fungal Immunomodulatory Protein from 
Ganoderma tsugae (Fip-gts) Defined by a Yeast Two-hybrid System and Site-directed 
Mutagenesis, J. Biol. Chem., 272: 20044-20048. 
[7] Li QZ, Zheng SB, Wang XF, Bao TW, Zhou XW (2011), Preparation of rabbit anti-
Ganoderma sinensis immunomodulatory protein polyclonal antibody, African Journal 
of Microbiology Research., 5(12):1562-1564. 
[8] Li QZ, Wang XF, Chen YY, Lin J, Zhou XW (2010a), Cytokines expression induced by 
Ganoderma sinensis fungal immunomodulatory proteins (FIP-gsi) in mouse spleen 
cells, Appl. Biochem. Biotech., 162: 1403-1413 
[9] Li et al. 2011, Recent status and prospects of the fungal immunomodulatory protein 
family. Critical Reviews in Biotechnology, 2011; 31(4): 365–375 
[10] Liang CY, Zhang SQ, Liu ZY, Sun F (2009), Ganoderma lucidum 
immunomodulatory protein(Lz-8) expressed in Pichia pastoris and the identification 
of immunocompetence, C. J. Biotech. 25(3): 441-7. 
[11] Naszeen Z. et al., 2005, Study of different growth parameters in Ganoderma lucidum, 
Biotechnology and food research Center, PCSIR labs, USA. 
[12] Qin et al., 2008, Functional expression of LZ-8, a fungal immunomodulatory protein 
from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris, J. Gen. Appl. Microbiol., (54).