Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc chính có năng suất cao và giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống hơn 30% dân số thế giới. Ngày nay trên thế giới cây ngô đứng thứ ba về diện tích, đứng thứ hai về sản lượng và đứng đầu về năng suất. Ngô đã được dùng để sản xuất ra khoảng 650 mặt hàng khác nhau trong các ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp nhẹ. Ngô góp phần vào việc ổn định sản lượng ngũ cốc trên thế giới và có vai trò quan trọng trong kinh tế và thương mại quốc tế. Ở Việt Nam, việc phát triển cây ngô trong thời gian qua đã đạt được nhiều thành tựu, tăng nhanh cả về diện tích, năng suất và sản lượng; tuy nhiên cũng gặp nhiều thách thức, trong đó có vấn đề sâu hại. Đã có nhiều giống ngô lai mới có năng suất cao được đưa vào sản xuất, song xuất hiện những hạn chế về khả năng bảo quản, như dễ bị nấm, mọt  xâm hại trong khi nhiều giống ngô địa phương truyền thống tuy năng suất thấp những khả năng bảo quản sau thu hoạch lại tốt hơn.
	Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác. Thức ăn thích hợp nhất với mọt ngô là hạt ngô. Năng suất và chất lượng ngô bị ảnh hưởng nhiều bởi mọt ngô, chúng làm giảm sản lượng sau thu hoạch trung bình là 20%, có những trường hợp sự phá hại của chúng lên đến 90% trong vòng sáu tháng. Ngăn chặn sự tấn công của mọt với ngô hiện nay đang là vấn đề cấp bách để bảo đảm an ninh lương thực trên toàn thế giới. Một số biện pháp bảo quản ngô sau thu hoạch hiện nay dùng phổ biến là sấy ở nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, dùng thảo mộc, Tuy vậy, các biện pháp này tốn nhiều công sức, hiệu quả thấp, giá thành cao. Mặt khác, biện pháp dùng thuốc hoá học thì gây ra nhiều mối lo ngại về ô nhiễm môi trường, độc hại tới vật nuôi và con người.
	Defensin thực vật phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có cấu trúc không gian nhỏ, hình cầu với thành phần cơ bản khoảng 45-54 amino acid giàu cysteine. Defensin là protein đa chức năng, ức chế quá trình dịch mã, ảnh hưởng đến chức năng của kênh màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả năng chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxy hoá khử ascorbic acid, ức chế protease và đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase của côn trùng. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, defensin phân lập từ đậu xanh, đậu đũa có khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh và đậu đũa. Nhưng sự ức chế của các defensin này với α-amylase từ động vật có xương sống là thấp. Vì vậy, đã có nhiều tác giả tập trung nghiên cứu tăng cường khả năng kháng mọt ở đậu đỗ bằng sử dụng protein defensin và đạt kết quả cao. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có những công trình nghiên cứu mở rộng ứng dụng protein defensin với nhiều đối tượng nông sản khác cũng bị thiệt hại lớn bởi mọt hại như ngô.
Trong những năm gần đây, biến đổi di truyền đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu về quá trình cơ bản ở thực vật và trong cải tiến giống cây trồng. Kỹ thuật tạo cây chuyển gen đang phát triển nhanh chóng kể từ thành công đầu tiên trong việc đưa gen ngoại lai vào trong thực vật nhờ A. tumefaciens. Cây chuyển gen có những đặc điểm đặc biệt, có thể cải tiến về giá trị về dinh dưỡng, tăng sản lượng, tăng khả năng chống chịu và nhiều đặc tính ưu việt khác. Việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống ngô có khả năng kháng mọt cao là vấn đề thực tiễn được đặt ra trong nghiên cứu bảo quản ngô hạt sau thu hoạch.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài luận án là: “Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
	Xác định được đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ một số giống ngô có khả năng kháng mọt ngô khác nhau. Biểu hiện được protein tái tổ hợp ZmDEF1 (rZmDEF1) ở cây chuyển gen.
3. Nội dung nghiên cứu
(i) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu trong điều kiện lây nhiễm mọt ngô nhân tạo.
(ii) Phân tích đặc điểm gen ZmDEF1 của các giống ngô có khả năng kháng mọt ngô khác nhau.
(iii) Thiết kế vector chuyển gen chứa ZmDEF1 và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 và T1, phân tích khả năng ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protetin rZmDEF1.
(iv) Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen ZmDEF1 từ giống LC1 và LVN99. Phân tích sự biểu hiện gen ZmDEF1 trên cây ngô chuyển gen ở thế hệ T1 và đánh giá hoạt động ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein rZmDEF1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ đánh giá khả năng kháng mọt ngô của các giống ngô đến sự phân lập, tách dòng, giải trình tự gen, thiết kế vector chuyển gen và phân tích biểu hiện gen ZmDEF1 trên cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen. 
Cụ thể là:
1) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu đã xác định được giống ngô SL có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất và hai giống LC1 và LVN99 có khả năng kháng mọt ngô kém.
2) Gen ZmDEF1 (DNA) phân lập từ các giống ngô nghiên cứu có 345 bp, cấu trúc bởi hai exon và một intron ở giữa với 102 bp; gen ZmDEF1 (cDNA) có 243 bp mã hóa cho 80 amino acid.
3) Gen ZmDEF1 được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen. Protein rZmDEF1 tách chiết từ cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen có khối lượng phân tử gần10 kDa đã biểu hiện chức năng ức chế hoạt động của α-amylase của ấu trùng mọt ngô.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu tăng cường khả năng kháng mọt ngô bằng kỹ thuật chuyển gen.
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô địa phương và giống ngô lai LVN99, góp phần xác định được cấu trúc gen ZmDEF1 ở ngô thông qua so sánh trình tự nucleotide phân lập từ cDNA và DNA. 
Phát triển thành công cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 và sự biểu hiện chức năng ức chế hoạt động của α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein rZmDEF1 ở cây chuyển gen là cơ sở khoa học cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng kháng mọt ngô của cây ngô. 
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học-công nghệ quốc tế và trong nước cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.
Về mặt thực tiễn
Dịch chiết protein của hạt các dòng cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen ZmDEF1 có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase từ ấu trùng mọt ngô đã góp phần giải quyết cơ sở lý luận của vấn đề nâng cao khả năng kháng mọt bằng tăng cường biểu hiện gen ZmDEF1 bằng phương pháp chuyển gen. Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nâng cao khả năng kháng mọt của ngô, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn tạo giống ngô kháng mọt cao. 
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 126 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (23 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (45 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (17 trang). Luận án có 30 bảng, 33 hình và tham khảo 143 tài liệu.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
	Luận án đã tham khảo 8 tài liệu tiếng Việt; 135 tài liệu tiếng Anh để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) (2) Đăc điểm của defensin thực vật; (3) Nghiên cứu chuyển gen ở ngô.
	Mọt ngô là loài gây hại phổ biến và là dịch hại nguyên phát, phân bố phổ biến ở hầu khắp các nước trên thế giới, gây hại lớn ở những vùng ấm áp, nhất là ở Châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ. Ở nước ta, có thể gặp mọt hại ngô ở tất cả các địa phương, chúng có mặt trong 100% kho bảo quản ngô. Tác hại của mọt hại đến sản lượng và chất lượng của ngô là rất lớn. Trung bình mọt hại làm giảm 20% khối lượng ngô sau thu hoạch. Tuy nhiên với kho bảo quản tốt thì mức độ thiệt hại thường dưới 20%, kho bảo quản thường thiệt hại trên 20% còn một số trường hợp tổn thất do mọt hại gây ra với ngô lên đến 90%. Hạt ngô có đặc điểm vỏ càng dày, độ cứng càng cao, hàm lượng phenolic acid cao, chất ức chế tripsin, ức chế α-amylsae và hàm lượng chất sơ trong hạt ngô càng cao thì khả năng kháng mọt càng cao. 
 	Defensin là peptide cation với vùng chức năng chứa từ 45- 55 amino acid với 8 phân tử cystein (Cys) tạo nên 4 cầu nối disunfide tạo nên cấu trúc không gian ba chiều ổn định với dạng CSαβ đặc trưng cho defensin thực vật. Cấu trúc không gian ba chiều của defensin gồm 3 phiến gấp β và một chuỗi xoắn α. Trong đó giữa nếp gấp β thứ 2 và thứ 3 có vùng loop 3, vùng này có chức năng quan trọng trong ức chế hoạt động của α- amylase của mọt. Do có sự liên kết gữa loop 3 (VrD1) với trung tâm hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt bằng lực hút tĩnh điện, ngăn cản tinh bột đi vào do đó quá trình tiêu hóa tinh bột của mọt bị ngừng trệ làm mọt suy yếu dần, dẫn đến chết (Feng Lin và Cs 2007). Sự ức chế này biểu hiện thấp đối với α- amylase của động vật, vì có sự sai khác về độ dài của 3 loop trung tâm hoạt động của α-amylase của động vật là dài hơn, dẫn đến ngăn cản loop 3 của defensin (VuD1) không liên kết vào trung tâm hoạt động của α-amylase (Pelegrini và cs (2008).
	Phôi non đã chứng tỏ là một nguồn nguyên liệu vượt trội cho chuyển gen ở ngô nhờ A. tumefaciens. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của ngô ngày càng được tăng lên vì đã sử dụng các giống ngô chuyển gen vào sản xuất. Đến nay, hàng loạt gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại như gen Cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chuyển thành công vào ngô (Liliana và cs 2013). Các giống ngô có khả năng chịu hạn cao cũng đã được đưa vào sản xuất (Qiudeng và cs 2014). Nhiều giống ngô chuyển gen cho năng suất cao bởi tăng số lượng hạt ngô trên bắp hay tăng trọng lượng của hạt (Zhang và cs 2016). Ngô chứa đa vitamin cũng đã được tạo ra bằng chuyển đa gen (Shaista và cs 2009)Tuy nhiên, trong các thành tựu quan trọng của cây ngô chuyển gen, hướng nghiên cứu tạo ngô chuyển gen nhằm tăng cường khả năng kháng mọt hại chưa được quan tâm nhiều.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
	Sử dụng 4 giống ngô địa phương và giống ngô lai LVN99 do Trung tâm giống cây trồng Lào Cai, Sơn La cung cấp 
Giống thuốc lá Nicotinana tabacum C9-1 do Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá Việt Nam cung cấp.
	Các chủng vi khuẩn và các loại vector sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, A. tumefaciens CV58; vector pBT tách dòng gen, p201- SLHEP- HA, pBetaPhaso-dest.
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen...; Các thí nghiệm đánh giá khả năng kháng mọt và kiểm tra chức năng sinh học của gen chuyển được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Sinh Hoá - Trường Đại học Tây Bắc. Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen vào cây thuốc lá và phân tích cây chuyển gen,... được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thí nghiệm chuyển gen vào cây ngô được thực hiện tại phòng Tế bào và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
	Các phương pháp nghiên cứu chia thành 5 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu, (2) nhóm phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (4) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen, (5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen. Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.2. 
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt
	Hạt các giống ngô nghiên cứu, loại bỏ các hạt sâu, bệnh, được sấy khô đến khi đo độ ẩm trên máy đạt 13%, tiến hành chia thành lô thí nghiệm và lô đối chứng. Lô thí nghiệm, cân 50g hạt ngô và thả 15 cặp mọt ngô vào bình có nắp, còn lô đối chứng thì không thả mọt. Các chỉ tiêu đánh giá tại các thời điểm 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày gây nhiễm mọt nhân tạo, xác định các chỉ tiêu: Khối lượng ngô hao hụt ở lô thí nghiệm, tỷ lệ nhiễm mọt, tỷ lệ tạo bột ngô, hệ số gia tăng quần thể (r) mọt.
2.3.2. Phương pháp tách dòng và giải tự trình tự gen ZmDEF1
	Phân lập gen ZmDEF1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế ZmDEF1F_SalI /ZmDEF1R_HindIII và khuôn mẫu từ DNA tổng số tách chiết ở lá; từ RNA tổng số tách chiết ở lá khi hạt đã ngâm ủ với ABA qua tổng hợp cDNA.
Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác định và phân tích trình tự nucleotide. Kết quả nghiên cứu về các trình tự gen, amino acid được xử lý bằng phần mềm BioEdit, DNA Star.
2.3.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang chuyển ZmDEF1
	Vector chứa gen ZmDEF1 chuyển gen vào thực vật được phát triển theo hai bước cơ bản: (1) Tạo cấu trúc mang gen chuyển pDON201-SLHEP-ZmDEF1 (2) Gắn cấu trúc gen mang gen chuyển ZmDEF1 vào vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1.
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
Biến nạp pBetaPhaso-ZmDEF1 vào tế bào A. tumefaciens CV58 bằng xung điện, chọn lọc bằng colony PCR và nhân dòng vector chuyển gen để tạo chủng vi khuẩn mang vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 phục vụ biến nạp.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào cây thuốc lá N. tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào phôi ngô giống LC1 và LVN99 nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình tạo cây đậu tương chuyển gen được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Frame và cs 2002 và tham khảo quy trình tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen của Trần Thị Lương và cs 2014.
Hiệu suất chuyển gen (%) = × 100
2.3.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII, kỹ thuật lai Southern. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm phiên mã gen ZmDEF1 bằng RT-PCR. Đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã của gen chuyển bằng Real-time RT-PCR theo phương pháp R=2-∆∆Ct của Livak - 2001. Kiểm tra sự có mặt của  ...  bởi enzyme giới hạn Hind III để kiểm tra sự có mặt của ZmDEF1 trong vector tái tổ hợp (Hình 3.8-A). Kết quả cắt plasmid và cắt bởi enzyme giới hạn Hind III thu được 3 băng DNA với kích thước khoảng 1,85 kb, 2,4 kb và 11,5 kb. Các kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán theo lý thuyết.
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng Hind III (A) và hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII từ khuẩn lạc A. tumefaciens CV58 (B)
 (M1: Thang DNA chuẩn 1kb; M2: Thang DNA chuẩn 1kb plus; 1, 2: Sản phẩm cắt HindIII plasmid tái tổ hợp của 2 dòng khuẩn lạc; 1, 2, 3: Sản phẩm PCR của 3 dòng khuẩn lạc A.tumefaciens; (-):Đối chứng âm dòng khuẩn lạc không biến nạp; (+): Đối chứng dương sản phẩm PCR gen ZmDEF1; ĐC: plasmid tái tổ hợp không cắt bởi HindIII).
	Sau khi kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens CV58 bằng kỹ thuật xung điện. Phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII được thực hiện (Hình 3.8-B) cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 đều mang vector chứa cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 và chúng được sử dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật qua lây nhiễm.
3.3.2. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens
	Tiến hành chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá N. tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens với hai lần biến nạp qua các giai đoạn: đồng nuôi cấy, tái sinh đa chồi, chọn lọc ở các giai đoạn kéo dài chồi, ra rễ, ra bầu đất và ra nhà lưới (hình 3.10).	
Hình 3.10. Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá C9-1
(A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi được tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; C: Các chồi màu xanh được tách ra trên môi trường chọn lọc; D: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ của cây thuốc lá chuyển gen trên môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen ra hoa)
	Sau 2 lần biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào các mảnh lá thuốc lá với 30 mảnh lá/lần, kết quả được trình bày ở bảng 3.9 với 18 dòng cây chuyển gen ra nhà lưới.
Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh lá thuốc lá C9-1 
Lô thí nghiệm
Số mảnh lá biến nạp
Số mảnh lá sống sót
Số cụm chồi tạo thành
Số cây sống sót
Số dòng cây ra bầu đất
Số dòng cây trồng tại nhà lưới
Thí nghiệm
2 x 30 = 60
32
68
98
36
18
ĐC0
30
0
-
-
-
-
ĐC1
30
30
72
102
10
10
 (ĐC0: thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1: thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh)
3.3.3. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen
3.3.3.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0
	Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở 18 dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0. Chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số lá của 18 dòng cây chuyển gen đã trồng ở nhà lưới để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở hình 3.11 với 13/18 dòng dương tính với phản ứng PCR. Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn này là 13/60= 21,67%.
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen ZmDEF1 trong các cây thuốc lá chuyển gen
(M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 18: các dòng thuốc lá chuyển gen; (-): cây đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ cấu trúc chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1)
3.3.3.2. Phân tích biểu hiện ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển gen T1
Phân tích biểu hiện ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển gen T1 ở mức độ phiên mã bằng phản ứng RT- PCR. Hạt các dòng cây dương tính với phản ứng PCR được sử dụng thực hiện phản ứng RT- PCR (Hình 3.12). 
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 của dòng cây thuốc lá chuyển gen
(M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 18: các dòng cây thuốc lá chuyển gen;
 (-): cây đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1).	
Hình 3.14. Biểu đồ biểu hiện mức độ biểu hiện của gen ZmDEF1 từ các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 
(T1-1, T1-3, T1-10, T1-17: các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1;Thanh đứng trên mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn)
Đánh giá mức độ phiên mã gen ZmDEF1 trên cây thuốc lá chuyển gen T1 bằng Real-time RT-PCR: Hạt các cây thuốc lá các dòng T1-1, T1-3, T1-10, T1-17 và cây không chuyển gen (đối chứng âm) được sử dụng thực hiện phản ứng Real-time RT-PCR với cặp mồi qDEF1-F/ qDEF1-R. Chu kỳ ngưỡng (Ct) của đối chứng âm gen ZmDEF1 sau chu kỳ thứ 40, nghĩa là giống kiểm tra không có gen ZmDEF1. Kết quả phân tích cho thấy, tỷ lệ biểu hiện của gen ZmDEF1 ở các dòng cây chuyển gen số T1-1, T1-10,T1-17 cao hơn dòng cây T1-3 tương ứng 1,17 lần, 1,22 lần và 1,44 lần (Hình 3.14)
	Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp bằng lai Western: 
Hình 3.15. Kết quả lai Western cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1
(M: thang chuẩn protein; 1, 3, 10, 17: protein các cây thuốc lá chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17; (+): đối chứng dương là protein có kích thước khoảng 35 kDa có chuỗi c-myc phía đầu C; (-): đối chứng âm là protein cây thuốc lá không chuyển gen)
	Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose của các dòng thuốc lá chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17 xuất hiện băng protein ở vị trí kích thước khoảng10 kDa. Điều đó chứng tỏ, cả 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen đều có protein rZmDEF1. 
3.2.3. 4. Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen ZmDEF1 trên hạt cây thuốc lá ở thế hệ T1
	Kiểm tra chức năng sinh học protein rZmDEF1 bằng xác định khả năng ức chế hoạt động của α -amylase của mọt. 
Bảng 3.11. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1
Mẫu
Chỉ có 
α -amylase
ĐC
Hỗn hợp α-amylase của mọt và protein hạt của các dòng thuốc lá chuyển gen T1
T1-1 
T1-3 
T1-10 
T1-17 
Hoạt độ α- amylase (ĐVHĐ/mg)
7,18 ± 0,29
7,13 ± 0,36
2,26 ± 0,46
2,01 ± 0,58
 2,68 ± 0,73
 2,15 ± 0,68
Hiệu suất hoạt động α-amylase (%) 
100
31,69
28,19
37,58
30,15
	ĐC: Hỗn hợp α -amylase của mọt và protein của cây không chuyển gen
	Bảng 3.11 cho thấy, với hiệu suất hoạt động α-amylase của hỗn hợp gồm α-amylase từ ấu trùng mọt và protein của cây không chuyển gen thì hoạt độ α-amylase của các mẫu gồm hỗn hợp protein các dòng cây thuốc lá chuyển gen giảm, chỉ còn 28,19 % đến 37,58%. 
3.4. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
3.4.1. Kết quả chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99
	Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn, tuổi phôi ngô đến hiệu quả chuyển gen gus và ngưỡng chọn lọc phôi mang gen chuyển của kanamycin ở giống ngô LVN99 đã được xác định, để làm cơ sở cho chuyển thành công gen đích ZmDEF1 vào phôi ngô. Các kết quả được trình bày ở bảng 3.12, 3.13, 3.14 ở luận án cho thấy, quy trình chuyển gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens chủng C58 đã được xây dựng và tối ưu với mật độ vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp ở giá trị OD660nm=0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tối ưu là 30 phút, AS bổ sung là 150mM và tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi (tương ứng với kích thước 0,9– 1,3 mm) là tuổi phôi tối ưu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh. Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối với phôi chuyển gen là 50mg/l. 
3.4.2. Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A. tumefaciens
	Giống ngô lai LVN99 và giống ngô địa phương LC1 làm vật liệu để nhận gen chuyển ZmDEF1. Quá trình biến nạp, tái sinh tạo cây ngô chuyển gen được minh hoạ ở hình 3.17.
Hình 3.17. Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống LVN99 vụ hè - thu năm 2016
(A1: Phôi sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy; A2: Phôi nuôi trên trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 50mg/l, chọn phôi mang gen chuyển lần 1; A3: Phôi nuôi trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 25mg/l, chọn lọc phôi mang gen chuyển lần 2; A4: Phôi nuôi trên môi trường phục hồi mô sẹo; A5: Phôi nuôi trên môi trường tái sinh chồi; A6: Phôi nuôi trên môi trường ra rễ; Ra cây: Cây được trồng ngoài trời).
	Sau hai lần biến nạp sử dụng phôi non ngô ở vụ đông - xuân (tháng 11 năm 2015 đến 2 năm 2016) và vụ hè - thu (tháng 5- tháng 8 năm 2016) chúng tôi thu được kết quả biến nạp và tái sinh cây chuyển gen của hai giống ngô LC1 và LVN99 ở bảng 3.15 với 5 cây chuyển gen từ giống LC1, 4 cây chuyển từ giống LVN99 ra bầu đất.
Bảng 3.15. Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1 và LVN99
Lô thí nghiệm
Số phôi biến nạp
Số mô sẹo được chọn lọc
Số mô sẹo tái sinh
Số cây ra bầu đất
Số cây kết hạt
Vụ đông-xuân (2015-2016)
LC1
136
7
1
0
0
LVN99
147
8
1
0
0
Vụ hè - thu (2016)
LC1
158
22
8
5
3
LVN99
167
23
7
4
2
ĐC0- LC1
30
3
0
0
0
ĐC0- LVN99
30
4
0
0
0
ĐC1- LC1
30
22
16
10
10
ĐC1- LVN99
30
20
13
10
10
	(ĐC0- LC1: phôi ngô giống ngô LC1 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC0- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1- LC1: phôi ngô giống LC1 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC1- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh)
3.3.3. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô chuyển gen T0
3.3.3.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô chuyển gen T0 bằng phản ứng PCR
	DNA tổng số từ lá của 9 cây ngô chuyển gen của hai giống LC1 (5 cây) và LVN99 (4 cây) sau khi được tinh sạch, thực hiện phản ứng PCR hình 3.18. Kết quả cho thấy, cả 5 cây chuyển gen giống LC1 đều cho kết quả có 2 băng DNA với kích thước khoảng 0,25 kb và 0,35 kb tương ứng với kích thước ước tính cho gen ZmDEF1 nội tại và gen ZmDEF1 ngoại lai. Hiệu suất chuyển gen của giống LC1 đến giai đoạn đánh giá là 5/158=3,16%. Các cây chuyển gen giống LVN99 có 3 cây dương tính. Hiệu suất chuyển gen của giống LVN99 đến giai đoạn xác định sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR là 3/167= 1,79%. 
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 trong các cây ngô chuyển gen
 (C1- C5: các cây ngô chuyển gen của giống LC1thế hệ T0; L1- L4: Các cây ngô chuyển gen của giống LVN99 thế hệ T0; M: thang chuẩn DNA 1kb; (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen ZmDEF1; (-): sản phẩm PCR từ nước cất; WT: sản phẩm PCR từ DNA cây ngô không chuyển gen)
3.3.3.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô chuyển gen T0 bằng lai Southern
	Các cây ngô chuyển gen cả hai giống LC1 và LVN99 dương tính với phản ứng PCR được tiến hành kiểm tra sự có mặt của gen chuyển và số bản copy trong genome bằng phương pháp lai Southern, kết quả thể hiện ở hình 3.19.
Hình 3.19. Kết quả lai Southern các cây ngô chuyển gen ZmDEF1
(M: Marker 1kb, (+): vector pBetaPhaso-ZmDEF1 mang gen nptII; (-): cây ngô LVN99 không chuyển gen; C1- C5: Các cây ngô chuyển gen giống LC1 thế hệ T0; L1, L3, L4: Các cây ngô chuyển gen giống LVN99 thế hệ T0)
	Kết quả cho thấy, 5 cây chuyển gen giống LC1 đều dương tính với lai Southern. Hiệu suất chuyển gen của giống đến thời điểm phân tích lai Southern là 5/158=3,16%. Giống LVN99 có 3 cây dương tính với PCR (T0-L1, T0-L3, T0-L4) được lai Southern kết quả cho thấy cả 3 cây chuyển gen đều dương tính với lai Southern, với mỗi cây có 1 bản copy. Hiệu suất chuyển gen của giống LVN99 là 3/167= 1,79%.
3.3.4. Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1
	Cây ngô chuyển gen giống LC1 có 3 cây kết hạt (T1-C1, T1-C3, T1-C5). Giống LVN99 có 2 cây kết hạt là cây T1-L1 và T1-L3 và cây số 2 không mang gen chuyển. Hạt các cây ngô chuyển gen được tách protein để thức hiện lai Western kiểm tra hoạt động của gen chuyển ở mức độ dịch mã, hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quả lai Western trên các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 thế hệ T1
(M: thang chuẩn protein 10- 250 kDa; C1,C3,C5: Các cây ngô chuyển gen giống LC1ở thế hệ T1; L1, L3: Các cây ngô chuyển gen giống LVN99 ở thế hệ T1 ; (+): protein chứa đuôi c myc kích thước khoảng 35 kDa; (-): protein cây ngô LVN99 không chuyển gen)
	Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã với giống LC1 là 3/158 = 1,89% còn giống LVN99 = 2/167 = 1,19%. 
3.3.4. Kiểm tra chức năng sinh học của protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1
	Đánh giá khả năng ức chế hoạt động của α -amylase ấu trùng mọt của hạt ngô chuyển gen thế hệ T1 ở bảng 3.16
	So với cây không chuyển gen giống LC1, protein rZmDEF1 ở cây T1-C1 có hiệu suất ức chế α-amylase của ấu trùng mọt ngô là 63,09%, cây T1-C3 là 56,45% và cây T1-C5 với 58,79%. Ở giống LVN99 protein rZmDEF1 ở cây T1-L1 với hiệu suất ức chế α-amylase của ấu trùng mọt ngô là 54,52%, cây T1-L3 đạt 55,20%. 
Bảng 3.16. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây ngô chuyển gen T1
Mẫu
Chỉ có 
α -amylases của mọt
Hỗn hợp gồm α -amylase của mọt và protein của giống ngô LC1
Hỗn hợp α -amylase của mọt và protein của giống LVN99
Cây không chuyển gen
Cây chuyển gen 
Cây không chuyển gen
Cây chuyển gen
T1-C1
T1-C3
T1-C5
T1-L1
T1-L3
Hoạt độ 
 α-amylase (ĐVHĐ/mg)
7,98 ± 0,67
5,12± 0,59
1,89 ± 0,62
2,23 ± 0,37
2,11 ± 0,47
5,87 ± 0,65
2,67± 0,29
2,63± 0,43
Hiệu suất hoạt động α - amylase (%)
100
36,91
43,55
41,21
100
45,48
44,80
Hiệu suất ức chế hoạt động α - amylase của rZmDEF1 (%)
0
63,09
56,45
58,79
0
54,52
55,20
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Giống ngô địa phương SL có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn cảm mọt là 1754,19; giống LVN99, LC1 có khả năng kháng mọt kém, chỉ số mẫn cảm với mọt lần lượt là 6088,71 và 3515,75.
1.2. Gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu đã được tách dòng thành công và xác định trình tự nucleotide. Gen ZmDEF1 có hai exon có kích thước 243 bp, mã hóa cho 80 amino acid và một intron chứa 102 bp.
1.3. Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được thiết kế và chuyển vào cây thuốc lá N. tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens CV58. Protein rZmDEF1 được biểu hiện ở 4 dòng chuyển gen (T1-1, T1-3, T1- 10, T1-17) và có khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt ngô.
1.4. Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được chuyển thành công và tạo được cây ngô chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống ngô địa phương LC1 và LVN99 với hiệu suất chuyển gen lần lượt là 1,89% và 1,19%.
1.5. Protein rZmDEF1 có kích thước gần 10 kDa được biểu hiện 3 dòng cây từ giống LC1 (T1-C1, T1-C3, T1-C5) và 2 dòng từ giống LVN99 (T1-L1, T1-L3). Protein rZmDEF1 biểu hiện ức chế hoạt động của α-amylase của ấu trùng mọt ngô. So với protein cây không chuyển gen, protein rZmDEF1 ở các dòng chuyển gen có hiệu suất ức chế α-amylase cao hơn từ 54,52% đến 63,09%.
2. Đề nghị
	Tiếp tục phân tích các cây ngô chuyển gen của hai giống LC1 và LVN99 chuyển gen qua các thế hệ T2, T3,... nhằm chọn, tạo được dòng cây ổn định về khả năng ức chế hoạt độ của α-amylase của mọt ngô, bồi dưỡng tạo giống ngô chuyển gen kháng mọt.