Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (glycine max (l.) merrill)

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 
 LÒ THANH SƠN 
 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN 
GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ 
 CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) 
 Chuyên ngành: Di truyền học 
 Mã số: 62.42.01.21 
 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH ỌH C 
 THÁI NGUYÊN - 2015 
Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện 
đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái 
Nguyên; Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào 
thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ 
Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. 
Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Chu Hoàng Mậu 
 2. PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh 
 Phản biện 1: ................................................................................... 
 Phản biện 2: ................................................................................... 
 Phản biện 3: .................................................................................. 
 Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học 
 Họp tại trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 
 Vào hồi ...... giờ ......, ngày ...... tháng ...... năm 201.... 
Có thể tìm hiều luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, 
Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia 
Việt Nam. 
 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
1. Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang 
 Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1 
 Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”, 
 International Journal of Bioscience, Biochemistry and 
 Bioinformatics (IJBBB), 4 (3), pp.191 - 194. 
2. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh 
 Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và 
 chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp 
 chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52. 
3. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh 
 Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen 
 GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ một số giống đậu 
 tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị 
 Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196. 
4. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu 
 Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến 
 sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai mẫu đậu tương địa 
 phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 
 Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134. 
Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế 
 Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005, 
 HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010, 
 LN681352, LN681353. 
 Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916. 
 - 1 - 
 MỞ ĐẦU 
1. Đặt vấn đề 
 Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều 
quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Đậu tương rất có 
giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế. Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều 
amino acid không thay thế và các vitamin cần thiết cho cơ thể người và động 
vật. Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi 
khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử 
dụng bền vững nguồn tài nguyên đất. 
 Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu gây khó khăn lớn cho sản xuất nông 
nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ... và thu hẹp diện tích sản 
suất nông nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên 
thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với 
nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Cây đậu tương có thời gian sinh 
trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu 
cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô 
hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn 
của cây đậu tương. Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% 
năng suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. 
Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp 
thiết và mang tính thời sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam. 
 Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và 
sự phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất 
sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật. 
Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới 
những lớp đất sâu sẽ có cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện 
khô hạn. Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những 
cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng 
cường hô hấp và trao đổi ion... cũng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng 
nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt 
các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn 
như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường 
tích nước tế bào Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới 
 - 2 - 
điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát 
triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên... được xem là biện pháp 
hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương. 
 Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem 
là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay. 
Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã 
được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, 
đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công 
nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống 
đậu tương có khả năng chịu hạn cao. 
 Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc 
điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu 
tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
2.1. Mục tiêu tổng quát 
 Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự 
kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. 
2.2. Mục tiêu cụ thể 
 (i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về 
trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số 
giống đậu tương địa phương. 
 (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên 
quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương. 
 (iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 
biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. 
 (iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên 
quan đến sự phát triển kéo dài rễ. 
3. Nội dung nghiên cứu 
(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông 
qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ... và phân 
nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ. 
(2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế 
cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen từ cây đậu tương. 
 - 3 - 
(3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen 
GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ. 
(4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự 
kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện 
của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. Phân tích, so 
sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế 
hệ T1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ. 
 (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan 
đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương. 
4. Những đóng góp mới của luận án 
 Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân 
lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen 
GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương 
Việt Nam. 
 Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được 
mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được 
dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1. 
 Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong 
tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển 
bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 
Về mặt khoa học 
 Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen 
GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu 
quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây 
trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển 
gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển 
gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng. 
 Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên 
cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương 
ở Việt Nam. 
 Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong 
nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư 
liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. 
 - 4 - 
Về mặt thực tiễn 
 Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so 
với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng 
kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và 
những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn. 
 Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự 
phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết 
quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải 
thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong 
thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam. 
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được 
chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài 
liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang); 
Chương 3: Kết quả nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết 
quả nghiên cứu (09 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình 
công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ 
lục (8 trang). Luận án có 25 bảng, 31 hình và tham khảo 150 tài liệu. 
 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
 Luận án đã tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh và 2 tài 
liệu từ internet để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò của 
bộ rễ thực vật và của cây đậu tương đối với tác động của hạn; (2) Một số gen 
liên quan đến sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương; (3) Chuyển 
gen liên quan đến hoạt động của bộ rễ cây đậu tương nhờ A. tumefaciens. 
 Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, là cơ quan hấp thu nước chủ yếu 
cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể. Những cây có bộ rễ 
phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu và lan toả rộng sẽ có nhiều cơ hội thu nhận 
được nước và dinh dưỡng do vậy có thể dễ dàng vượt qua điều kiện khô hạn 
(Huck và cs, 1983). Sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương 
được quy định bởi nhiều gen liên quan đến các đặc điểm hình thái, sinh 
trưởng phát triển, trao đổi chất... (Taylor và cs, 1978; Uga và cs, 2013). Cho 
đến nay, gen chìa khoá xác định sự phát triển kéo dài rễ chưa được tìm ra. Ở cây 
 - 5 - 
đậu tương, gen EXP1 xác định protein expansin hoạt động chủ yếu ở vùng sinh 
trưởng của cả rễ chính và rễ bên được cho là có liên quan đến hoạt động phát triển 
kéo dài rễ (McQueen-Mason và cs, 1994; Choi và cs, 2003; Lee và cs, 2003). 
 Protein expansin là một liên họ bao gồm 4 phân họ là α-expansin (EXPA), 
β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) và expansin-like B (EXLB) có 
tác động kéo giãn, nới lỏng thành tế bào thực vật. Protein expansin được mã 
hoá bởi đa họ gen (multi-gene family) được phát hiện ở nhiều thực vật như 
lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây.... Riêng ở cây đậu tương có tới 75 
gen EXP khác nhau nằm trên 18 cặp NST tương đồng, trong đó gen GmEXP1 
thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm 3 exon và 2 intron xen kẽ. Trình 
tự mã hoá của gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255 
amino acid (Kende và cs, 2004; Zhu và cs, 2014). Protein tương ứng gồm 3 
vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức năng DPBB xúc tác dạng enzyme 
endoglucanase và vùng Pollen allerg bám dính cơ chất (Wu và cs, 2001). Khi 
thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 và tỷ lệ khối lượng expansin với 
thành tế bào đạt 1 : 10.000 thì expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế 
bào bằng cách len lỏi, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các thành phần 
polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng 
lưới polymer. Áp lực sức trương của tế bào làm khoảng cách giữa các vi sợi mở 
rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc (Cosgrove và cs 2000, 2005). 
 Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin (theo Cosgrove - 2000) 
 A: Expansin bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ 
 gãy các liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng 
 trượt và đẩy giãn khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào. 
 Ngoài ra tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin còn gây hiệu quả gián 
tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với cơ chất, đẩy nhanh hiệu quả 
tăng kích thước tế bào. Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động và phân bố 
của expansin trong tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng của rễ đậu tương cho thấy 
 - 6 - 
vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật 
hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu (Cosgrove và cs 1998). 
 Những tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen thực vật nhờ A. tumefaciens mở 
ra khả năng tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến sự phát triển kéo 
dài rễ nhằm cải thiện khả năng chịu hạn. Sự tiến bộ thể hiện ở các khâu: hoàn 
thiện quy trình tái sinh; chọn lọc hiệu quả bằng các gen chỉ thị, gen sàng lọc; 
ứng dụng thành công và có hiệu quả các kỹ thuật phân tử trong phân tích thể 
chuyển gen như PCR, Real-time RT-PCR, Western blot; đánh giá chính xác 
sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển... Nhờ đó, Việt Nam và Thế 
giới đã đạt được những thành tựu chuyển gen ở cây đậu tương rất đáng khích 
lệ (Zhang 2010; Li 2013; de Paiva Rolla 2014; Trần Thị Cúc Hoà 2007; Nguyễn 
Thị Thuý Hường 2011; Nguyễn Thu Hiền 2014; Lò Thị Mai Thu 2014...). 
 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu nghiên cứu 
 Sáu giống đậu tương địa phương Sơn La được Trung tâm Nghiên cứu ...  
là như nhau, đồng đều và ổn định với mức độ tin cậy 99,9%. 
 Các cây T126-4, T130-3, T130-4 có mức độ biểu hiện gen chuyển cao hơn 
cây T026 từ 1,32 đến 1,79 lần. Nguyên nhân của sự biến động trong biểu hiện 
phiên mã của gen chuyển GmEXP1 ở mỗi cá thể có thể xuất phát từ sự tương 
tác của các nhân tố bên trong tế bào như: hiệu quả vị trí của gen chuyển trong 
bộ NST cây đích; sự thay đổi số lượng copy qua sinh sản hữu tính; hiệu quả 
biểu hiện gen đích có sự thay đổi trong hệ thống biểu hiện mới ở thế hệ sau. 
 Phân tích protein ngoại lai trên các dòng cây thuốc lá chuyển gen T1 
bằng western blot 
 Protein tổng số từ lá các cây thuốc lá T1 dương tính với RT-PCR được 
điện di biến tính trên SDS-Page; được chuyển lên màng lai nitrocellulose; 
bloking bằng sữa tách béo 5% trong PBS; lai kháng thể 1; lai kháng thể 2 và 
hiện màu với cơ chất DAB. Kết quả trên màng lai cho thấy các cây thuốc lá 
chuyển gen được kiểm tra đều có protein kích thước khoảng 30 kDa tương 
ứng với kích thước protein cây đối chứng dương T0. 
 - 18 - 
 Như vậy có thể nói, gen ngoại lai GmEXP1 phân lập từ giống đậu tương 
SL1 đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá, di truyền và biểu hiện ổn 
định đến mức độ dịch mã qua hai thế hệ T0 và T1. 
 Hình 3.19. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) các đòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 
1 - 4: Các cây chuyển gen dòng số 26; 5 - 8: Các cây chuyển gen dòng số 30; wt: Cây thuốc 
 lá không chuyển gen làm đối chứng âm; (+): Protein cây chuyển gen T026 làm đối chứng 
 dương; M: thang chuẩn protein 10 - 180 kDa 
 Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên 
cây thuốc lá ở thế hệ T1 
 Sự biểu hiện chức năng sinh học của gen GmEXP1 được đánh giá qua các 
đặc điểm phát triển bộ rễ cây T1 trong điều kiện hạn so với đối chứng. Kết quả 
so sánh về thể tích, khối lượng khô bộ rễ và chiều dài rễ chính được trình bày 
trong các bảng 3.10, 3.11 và 3.12 của luận án. 
Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuốc lá (A) và so sánh hình thái 
 rễ có tưới nước và cây không tưới nước (B) ở giai đoạn 5 ngày gây hạn 
 WT: Cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen; 26, 30: Các dòng thuốc lá chuyển gen 
 Kết quả phân tích cho thấy, thể tích bộ rễ cây chuyển gen so với đối 
chứng tăng mạnh trong khoảng 7 ngày đầu gây hạn (29,82 - 41,15%) và sau 
đó giảm dần do mất nhiều nước; khối lượng khô bộ rễ cây chuyển gen tăng từ 
30,64 đến 39,69% so với cây đối chứng không chuyển gen. 
 Chiều dài rễ chính qua các giai đoạn gây hạn ở cây không chuyển gen chỉ 
tăng từ 1,59 đến 9,82% so với đối chứng trong khi các cây chuyển gen tăng từ 
4,85 đến 22,27%. So với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện 
hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có chiều dài rễ chính tăng từ 31,07 đến 
41,23% chứng tỏ mối liên quan giữa gen chuyển GmEXP1 đối với sự thay đổi 
chiều dài rễ chính cây thuốc lá chuyển gen. 
 - 19 - 
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 
3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A. 
tumefaciens 
 Hạt đậu tương được khử trùng bằng khí Clo, nảy mầm 4-5 ngày trên GM 
và thu nhận nách lá mầm làm vật liệu nhận gen. Biến nạp cấy trúc gen 
GmEXP1 thông qua lây nhiễm của vi khuẩn A.tumefaciens vào nách lá mầm 
kết hợp gây tổn thương bằng vật nhọn. Quá trình biến nạp, tái sinh tạo cây đậu 
tương chuyển gen được minh hoạ ở hình 3.21. 
 A B C D E F 
 Hình 3.21. Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen 
 A: Mẫu biến nạp trên CCM; B: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 1; C: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 2; 
 D: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; E: Tạo rễ RM; F: Cây ra giá thể. 
 Qua hai lần biến nạp với 380 mảnh lá mầm (Bảng 3.13) thu được 103 mẫu 
tạo chồi, 34 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 
21 chồi ra rễ khoẻ mạnh và thu được 9 cây T0 phát triển trên giá thể. Lô ĐC1 
tạo được 3 cây khoẻ mạnh trên giá thể làm đối chứng. 
 Bảng 3.13. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84 
 Lô thí Số mẫu thí Số mẫu tạo Số chồi Số chồi Số cây sống 
 nghiệm nghiệm chồi kéo dài ra rễ trên giá thể 
TN1 180 50 16 9 4 
TN2 200 53 18 12 5 
ĐC0* 30 0 0 0 0 
ĐC1* 30 11 8 6 3 
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; 
* ĐC1 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 
3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 
3.5.2.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong hệ gen đậu tương 
 Tách chiết DNA tổng số từ lá của 9 cây đậu tương chuyển gen và PCR 
với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để xác định sự có mặt của gen 
chuyển GmEXP1. Sản phẩm điện di trên gel agarose (hình 3.22) cho thấy cây 
số 4 và 7 xuất hiện hai băng DNA kích thước khoảng 0,79 (tương ứng kích 
thước gen chuyển) và 1,51 kb (tương ứng với kích thước của gen nội tại). 
 - 20 - 
Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển 
 GmEXP1 trong các cây đậu tương chuyển gen 
 M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 9: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển 
 gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA cây đậu tương không chuyển gen. 
 Điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây đậu tương chuyển gen số 4 và số 7 (ký 
hiệu là cây DT04 và cây DT07) có mặt của gen ngoại lai GmEXP1. Hiệu suất 
chuyển gen GmEXP1 ở giai đoạn đánh giá này đạt 2/380 = 0,53%. 
3.5.2.2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 dựa trên sự có mặt 
của protein expansin ngoại lai trên cây đậu tương chuyển gen 
 Điện di protein tổng số từ lá hai cây đậu tương DT04 và DT07 và thực hiện lai 
hai loại kháng thể sau khi chuyển lên màng lai nitrocellulose. Kết quả hiện màu 
với cơ chất DAB (hình 3.23) cho thấy, cây DT04 xuất hiện băng màu ở vị trí 
khoảng 30 kDa tương đương kích thước protein expansin ở đối chứng dương. 
Hình 3.23. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 
 M: thang chuẩn protein 10-180 kDa; DT04, DT07: mẫu cây chuyển gen số 4 và 7; (-): mẫu 
 cây đậu tương không chuyển gen; (+): protein cây thuốc lá chuyển gen 
 Kết quả cho thấy, cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 đã biểu hiện đến mức 
độ dịch mã cho protein expansin ngoại lai. 
 Như vậy có thể thấy, vector chuyển gen pCB301_GmEXP1 đã thiết kế 
không chỉ phù hợp với cây thuốc lá mô hình mà còn có khả năng chuyển được 
gen đích GmEXP1 vào cây đậu tương. Cây đậu tương chuyển gen biểu hiện 
được protein expansin ngoại lai chính là kết quả khẳng định sự thành công của 
quy trình chuyển gen GmEXP1 vào cây đậu tương. 
 - 21 - 
 Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
Chọn tạo giống cây trồng chịu hạn mang tính thời sự 
 - Biến đổi khí hậu toàn cầu, mưa không đồng đều, khô hạn kéo dài gây 
hoang hoá, thu hẹp diện tích canh tác nông nghiệp, giảm năng suất và chất 
lượng sản phẩm nông nghiệp. 
 - Xây dựng bộ giống cây trồng ổn định về năng suất, phẩm chất thích ứng 
với điều kiện hiện tại là vấn đề mang tính chiến lược trong phát triển kinh tế 
nông nghiệp của nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. 
 - Khoa học sinh học nghiên cứu cơ sở phân tử đặc tính di truyền, sinh lý, 
hoá sinh... có thể tìm được lời giải cho vấn đề mang tính thời sự nói trên. 
Một số phương pháp đã được ứng dụng và triển vọng ứng dụng công 
nghệ gen trong cải thiện đặc tính chịu hạn cây đậu tương ở Việt Nam 
 - Đậu tương là cây trồng quan trọng và chiến lược của nhiều quốc gia 
nhưng thuộc nhóm chịu hạn kém, đòi hỏi áp dụng những tiến bộ khoa học 
nhằm cải thiện đặc tính này. 
 - Chọn tạo giống đậu tương chống chịu tốt với điều kiện khô hạn đã được 
tiến hành từ lâu với các biện như pháp lai giống truyền thống, gây tạo đột biến 
thực nghiệm đã thu được những thành quả nhất định như: DT2008 (Viện Di 
truyền Nông nghiệp); các giống ML48, ML61 (Chu Hoàng Mậu 2001)... 
 - Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen và A.tumefaciens đã được thực 
hiện thành công từ 1988 (Hinchee) và ngày càng có nhiều thành tựu về cây đậu 
tương chuyển gen; ở Việt Nam cũng có ộm t số tác giả thực hiện chuyển gen và 
tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen chống chịu sâu hại; chống chịu 
hạn; sản xuất vaccin thực vật; kháng bệnh do virus... đã minh chứng tiềm năng 
của kỹ thuật này trong chọn tạo giống đậu tương cải thiện khả năng chịu hạn. 
Lựa chọn gen đích phù hợp nhằm cải tiến bộ rễ - cải thiện khả năng chịu 
hạn ở đậu tương 
 Gen đích được lựa chọn trong đề tài luận án là GmEXP1 cho hiệu quả cải 
tiến bộ rễ dẫn đến làm tăng khả năng chịu hạn ở đậu tương vì các lý do: 
 - 22 - 
 - Gen chuyển GmEXP1 được lấy từ giống đậu tương có khả năng chịu hạn 
tốt, xác định protein expansin cho hiệu quả giãn thành tế bào vùng sinh trưởng 
dẫn đến kéo dài rễ, làm tăng khả năng nhận nước của cây đậu tương từ lớp đất 
sâu và vùng ngoại vi trong điều kiện khô hạn, cải thiện khả năng chịu hạn. 
 - Sử dụng gen GmEXP1 từ giống đậu tương chịu hạn tốt chuyển vào 
giống đậu tương chịu hạn kém sẽ tránh được những khó khăn trong biểu hiện 
chức năng sinh học của protein ngoại lai trong hệ thống biểu hiện mới vì: 
 + Expansin hoạt động độc lập, không nằm trong chuỗi phản ứng trao đổi 
chất nên không bị giới hạn về cơ chất cũng như ựs ức chế của sản phẩm xúc tác. 
 + Expansin không phải protein điều hoà nên không gặp trở ngại trong biểu 
hiện như sự tương quan về số lượng vị trí tương tác trên DNA; vấn đề ức chế 
phản hồi; vấn đề kiểm soát vị trí đích... 
Thiết kế cấu trúc chứa đoạn gen chuyển và phát triển vector chuyển gen 
 - Cấu trúc chứa đoạn gen chuyển GmEXP1 phải là cấu trúc biểu hiện độc 
lập trong tế bào chủ và phải dễ sàng lọc, đánh giá sự biểu hiện. Promoter 35S, 
c-myc và polyA là những thành phần cần thiết cho cấu trúc này. 
 - Vector pCB301 được dùng để chuyển cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào 
thực vật bởi cung cấp đủ các thành phần cần thiết cho chuyển gen như: LB, 
RB, OriV, nptII, operon TrfA... 
Những khó khăn trong chuyển gen đậu tương nhờ A. tumefaciens và giải 
pháp khắc phục 
 - Hiệu suất tạo cây đậu tương chuyển gen phụ thuộc nhiều yếu tố: vi 
khuẩn, vector chuyển gen, mô tiếp nhận, khả năng tái sinh của giống đậu 
tương nhận gen... 
 - Nách lá mầm hạt chín được sử dụng làm mô tiếp nhận nhờ hệ số tạo chồi 
cao và dễ thu nhận nguyên liệu biến nạp với số lượng lớn. 
 - Khó khăn đặc trưng ở chuyển gen đậu tương như dễ nhiễm khuẩn vệ tinh 
do hàm lượng protein trong mô bào cao có thể giải quyết bằng điều chỉnh kháng 
sinh; khó khăn về mùa vụ sinh thái có thể lựa chọn giải pháp tính toán thời gian 
biến nạp và tái sinh trùng khớp chu kỳ sinh học của mỗi giống hoặc giải pháp sử 
dụng buồng sinh trưởng điều khiển chủ động nhiệt độ và ánh sáng. 
 - 23 - 
Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong phân tích và chọn lọc dòng cây chuyển gen 
 Một số kỹ thuật phân tử cho phép phân tích chính xác cơ thể chuyển gen ở 
từng giai đoạn. Từ đó chọn lọc chính xác và rút ngắn thời gian chọn tạo dòng 
cây chuyển gen. Các kỹ thuật được ứng dụng trong đề tài luận án như: 
 - Kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho phép kiểm tra nhanh chóng sự 
có mặt của gen chuyển trong thể chuyển gen. Hiệu suất tạo cây chuyển gen 
khi kiểm tra bằng kỹ thuật này đối với cây thuốc lá đạt 32/60 = 53,33%; cây 
đậu tương đạt 2/380 = 0,53%. Tuy nhiên kết quả phân tích có thể dương tính 
giả do nhiều nguyên nhân đến từ các trạng thái tồn tại của gen chuyển không 
gắn trên hệ gen tế bào nhận (Nguyễn Đức Thành 2003). 
 - Kỹ thuật RT-PCR cho phép kiểm tra nhanh sản phẩm biểu hiện phiên 
mã (mRNA) của gen chuyển qua hai bước: tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 
với mồi ngẫu nhiên và PCR khuếch đại cDNA đích với cặp mồi đặc hiệu. Kỹ 
thuật này cho kết quả nhanh chóng, tuy nhiên chỉ định tính, không định lượng. 
 - Kỹ thuật Real-time RT-PCR kết hợp phương pháp tính của Livak (Livak 
và cs 2001) cho kết quả về mức độ biểu hiện phiên mã của gen chuyển ở các 
cây thuốc lá chuyển gen T0 có sự khác biệt nhau; thế hệ T1 của dòng 26 và 30 
có mức độ biểu hiện trung bình tương đương nhau, ổn định và đồng đều. Qua 
đó cho thấy, Real-time RT-PCR có thể sử dụng làm công cụ đắc lực trong 
phân tích mức độ biểu hiện phiên mã của gen chuyển, mở ra một hướng mới 
trong phương pháp phân tích cây chuyển gen ở Việt Nam. 
 - Kỹ thuật lai Western đã phát hiện sự biểu hiện dịch mã của gen chuyển 
GmEXP1 ở các dòng cây chuyển gen cho thấy gen chuyển hoạt động dịch mã 
và di truyền ổn định qua hai thế hệ T0 và T1. 
 Sự biểu hiện chức năng sinh học gen chuyển GmEXP1 đánh giá qua các 
chỉ tiêu phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn và không gây hạn cho thấy 
mối liên quan về vai trò và ý nghĩa của gen GmEXP1 đối với một số tính trạng 
phát triển bộ rễ thực vật. 
 Từ năm 2003, Lee và cs đã chứng minh được vai trò của gen GmEXP1 
bằng cách biểu hiện thành công gen ngoại lai trên cây thuốc lá mô hình. Tuy 
nhiên cho tới nay chưa thấy công bố nào về việc biểu hiện gen này trên cây đậu 
tương. Có thể nói, kết quả thử nghiệm tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 
và biểu hiện thành công protein expansin tái tổ hợp trên giống đậu tương DT84 
là một trong các nghiên cứu đầu tiên trên Thế giới và ở Việt Nam. 
 - 24 - 
 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 
1. Kết luận 
1.1. Sự phát triển bộ rễ của 6 giống đậu tương địa phương Sơn La và giống 
DT84 trong điều kiện gây hạn nhân tạo đã được đánh giá dựa trên chỉ tiêu 
chiều dài rễ chính, thể tích và khối lượng khô của bộ rễ. Giống đậu tương SL1 
có bộ rễ phát triển tốt nhất, tiếp đến các giống SL4, SL6 và bộ rễ phát triển 
kém là các giống SL2, SL3, SL5 và DT84. 
1.2. Gen GmEXP1 của các giống đậu tương nghiên cứu đã được tách dòng 
thành công và xác định trình tự nucleotide; vùng mã hoá của gen có kích 
thước 768 nucleotide mã hoá 255 amino acid. 
1.3. Vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 đã được phát triển và 
chuyển thành công vào cây thuốc lá N. tabacum K326 nhờ A.tumefaciens và 
tạo được 44 cây thuốc lá chuyển gen T0 trồng trong nhà lưới. 
1.4. Gen chuyển GmEXP1 được xác định tồn tại trong hệ gen của 32 cây thuốc lá 
ở thế hệ T0 và 3/32 cây có gen chuyển được biểu hiện ở giai đoạn phiên mã và 
dịch mã, hiệu suất chuyển gen đạt 5%. Mức độ biểu hiện phiên mã của gen 
chuyển GmEXP1 ở thế hệ T1 của dòng 26 và dòng 30 là tương đương. Gen 
chuyển được di truyền ổn định và biểu hiện protein expansin tái tổ hợp qua thế hệ 
T0 và T1. Trong điều kiện hạn và không gây hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T1 
có khả năng kéo dài rễ chính cao hơn so với đối chứng từ 34,56% đến 41,23%. 
1.5. Cấu trúc mang gen GmEXP1 đã được chuyển thành công vào giống đậu 
tương DT84 nhờ A.tumefaciens và tạo được hai cây đậu tương chuyển gen T0 
dương tính với PCR. Protein expansin tái tổ hợp được biểu hiện ở một dòng cây 
đậu tương chuyển gen và hiệu suất chuyển gen đạt 0,27%. 
2. Đề nghị 
Tiếp tục phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen qua các thế hệ T1, T2, 
T3... nhằm chọn tạo được dòng cây ổn định về tính trạng phát triển kéo dài rễ 
và có khả năng chịu hạn cao.