Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

1 
MỞ ĐẦU 
Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những loại coenzyme 
tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở cả prokaryote và eukaryote. CoQ10 có vai 
trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể. 
CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải 
thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, 
chống lão hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về 
tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp... 
Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để 
đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán 
tổng hợp và công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay 
CoQ10 được sản xuất chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như 
Agrobacterium tumefaciens, Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor, 
Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans 
A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất 
CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao 
so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, 
phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp..Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực 
tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận 
Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp” 
 Mục tiêu nghiên cứu 
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10. 
- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10. 
- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức 
năng. 
 Nội dung nghiên cứu 
- Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10. 
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10. 
- Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 
từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. 
- Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực 
phẩm chức năng dưới dạng viên nang. 
 Những đóng góp mới của luận án 
- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp 
CoQ10 cao. 
2 
- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa 
khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân 
lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng 
suất sinh tổng hợp CoQ10 cao. 
- Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens. 
- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức 
năng dưới dạng viên nang. 
 Bố cục của luận án 
- Luận án được trình bày trong 123 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu 
(32 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết quả và thảo luận 
(58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận và kiến nghị 1 trang), danh mục các 
công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (9 trang với 4 tài liệu 
tiếng Việt và 107 tài liệu tiếng Anh). 
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 
1.1. Cấu tạo Coenzyme Q10 
1.2. Nguồn thu Coenzyme Q10 
1.2.1. Tổng hợp hóa học 
1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật 
1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 
1.3.Con đường tổng hợp Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 
1.4. Lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens 
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon 
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ 
1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng 
1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 
1.4.5. Ảnh hưởng của pH 
1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan 
1.5. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 
1.5.1. Lên men gián đoạn 
1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) 
1.6. Tách chiết và đặc tính Coenzyme Q10 
1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10 
1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10 
1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10 
1.7. Cải biến chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Coenzyme Q10 
1.7.1. Đột biến chủng 
1.7.2. Chủng tái tổ hợp 
1.8. Vai trò và ứng dụng của Coenzyme Q10 
1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10 
1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10 
3 
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. VẬT LIỆU 
Các mẫu nốt sần cây hoa hồng được thu thập từ Tây Tựu và Mê Linh, Hà Nội. 
Chủng A. tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST. 
Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu tách dòng và biểu hiện: 
Mồi xuôi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3’; 
Mồi ngược (DpsR): 5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’. 
Mồi xuôi (DxsF): 5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3’; 
Mồi ngược (DxsR): 5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’; 
 Cặp mồi 16 S được sử dụng trong giải trình tự: 
Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; 
 Mồi ngược 1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’. 
Các plasmid được sử dụng trong nghiên cứu: pJet1.2/Blunt (Thermo Scientific, 
Mỹ), pCAMBIA1301 (Viện Công nghệ Sinh học, VAST.) 
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp 
CoQ10 theo Islam (2010). 
- Nuôi cấy chìm chủng A. tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp Coenzyme Q10. 
- Tách chiết DNA tổng số, DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gen dps, dxs, 
16S bằng kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vào E. Coli bằng sốc 
nhiệt,...theo Sambrook và Russel (2001). 
- Phương pháp biến nạp plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung 
điện. 
- Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens theo Ranadive (2011). 
- Xác định hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp Craven. 
- Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 bằng HPLC. 
- Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - CoQ10 theo Fir và cộng sự (2009). 
- Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của CoQ10 theo Fir (2009), Hisa và 
cộng sự (2014). 
- Phương pháp điều chế viên nang cứng chứa CoQ10. 
- Phương pháp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 bằng quy hoạch bậc 
hai theo Box – Behnken. 
- Phương pháp tin sinh học. 
4 
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP 
COENZYME Q10 
Kết quả từ 13 mẫu nốt sần khác nhau thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh 
và Tây Tựu - Hà Nội đã phân lập được12 chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc 
MacConkey, bao gồm 5 chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, 7 chủng từ nốt 
sần hoa hồng huyện Mê Linh. Để chứng minh các vi khuẩn phân lập được là A. 
tumefaciens, các chủng phân lập được tiến hành sàng lọc dựa theo một số đặc điểm 
hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử. 
Kết quả từ 12 chủng phân lập đã sàng lọc được 4 chủng là A. tumefaciens. Từ các 
chủng phân lập trên và 3 chủng chuẩn A. tumefaciens tiến hành tuyển chọn thông qua 
khả năng sinh tổng hợp CoQ10. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả năng 
sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (13 mg/l) sau 96 giờ nuôi cấy so với các chủng khác. 
Từ các kết quả phân tích về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử chủng vi 
khuẩn phân lập TT4 được định danh là A. tumfaciens TT4. Chủng này sẽ được sử 
dụng cho các nghiên cứu tăng cường sự sinh tổng hợp CoQ10. 
3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH 
TỔNG HỢP COENZYME Q10 
3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4 
DNA tổng số đã tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4 được dùng làm khuôn để 
khuếch đại hai đoạn gen dps và dxs mã hóa hai enzyme chìa khóa của con đường tổng 
hợp CoQ10 là decaprenyl diphosphate synthase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate 
synthase. 
Hình 3.1. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A. 
tumefaciens TT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) 
1077 bp  
2100 bp  
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
 dps M dxs M 
A B 
5 
Kết quả phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất hiện một băng DNA xấp xỉ 1,2 
kb (hình 3.1A) và một băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.1B) khi sử dụng cặp 
mồi DpsF/R và DxsF/R tương ứng. Kích thước của các sản phẩm PCR thu được là 
hoàn toàn phù hợp với kích thước của hai đoạn gen đích cần khuếch đại. Từ kết quả 
này cho thấy hai đoạn gen dps và dxs đã được khuếch đại từ khuôn DNA tổng số của 
chủng A. tumefaciens TT4 bằng kỹ thuật PCR. 
Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và gắn 
vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA). Sản phẩm nối ghép 
được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp. Kết quả biến 
nạp cho thấy xuất hiện 10 và 7 khuẩn lạc trên môi trường LB thạch chứa ampicilin 
(100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps và dxs. Plasmid đã được tách chiết từ những 
khuẩn lạc và được sử dụng cho sàng lọc sơ bộ để chọn ra một dòng tương ứng với 
mỗi gen để nghiên cứu tiếp theo. Trước tiên, plasmid được sử dụng làm khuôn cho 
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps và dxs tương ứng. Kết quả cho thấy 
đều xuất hiện băng sản phẩm PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích 
thước của gen dps (hình 3.2A) và dxs (hình 3.2B). Kích thước sản phẩm PCR từ 
khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng 
số của chủng A. tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.2). Kết quả nhận được chứng tỏ hai 
dòng được lựa chọn mang gen đích tương ứng là dps và dxs. Tuy nhiên, để chắc chắn 
hơn DNA plasmid của hai dòng này tiếp tục được xử lý bẳng các enzyme hạn chế 
thích hợp. 
Hình 3.2. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của 
các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là 
khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA 
chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 
 C3 TT4 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
A C6 TT4 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
B 
1077 bp  
2100 bp  
6 
Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào 
đầu 5’ của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào 
cặp mồi DxsF/R. Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai 
clone 3 và 6 đều văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps 
khoảng 1077 bp (hình 3.3A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.3B). Từ các kết quả 
thu được có thể khẳng định rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai 
gen đích tương ứng là dps và dxs. 
Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 
mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; 
đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương 
ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 
Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng 
hai plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự. Trình 
tự nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps và dxs đã được xác định. Kết quả 
cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp 
một protein nguyên vẹn. 
3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs 
Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử 
dụng làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A. tumefaciens. Hai gen dps và dxs sẽ 
được đưa độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo ra các cấu trúc biểu 
hiện pCAM-dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs. 
3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập 
Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt 
hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai gen dps và dxs thu được đã 
được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme 
 1 2 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
A 3 4 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
B 
 2100 bp 
 1077 bp 
7 
cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn 
dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps 
và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các 
dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen 
dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR 
sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI 
(hình 3.4B). Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb 
tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B). 
Hình 3.4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa 
chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm 
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản 
phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA 
chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 
Hình 3.5. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa 
chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm 
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 
100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 
 1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
 1 2 3 4 5 6 7 8 + - M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
A B 
 1 2 ĐC M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
 1 2 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
A B 
2100 bp  
2100 bp  
1077 bp  
8 
Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen 
đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) và xử lý bằng cặp 
enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng 
DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 
3.5B). Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành 
công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu 
pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng. 
3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs 
Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps 
thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và 
BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm 
nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả 
PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho 
sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 
3.6A). Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó 
chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để 
kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng 
DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được 
gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng 
thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs. 
Hình 3.6. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R  ... A 
B 
16 
thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với CoQ10 chuẩn (hình 3.15), điều đó chứng tỏ 
trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh 
CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10 tách chiết cao hơn 2,59 lần so 
với CoQ10 chuẩn. 
Hình 3.15. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh 
khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn 
3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng 
dung môi 
Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh sạch CoQ10 là ethanol:hexane 
theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được 
phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả so 
sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ 
phổ hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết 
và 1,62 lần so với 2 lần chiết (hình 3.16A). Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3 
lần chiết sạch hơn so với 1 và 2 lần chiết. 
Hình 3.16. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau (A). So sánh độ sạch của dịch 
tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, 
dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (B) 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 S
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 L2 L3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 L3 S
A 
B 
17 
Tiến hành phân tích phổ hấp thụ của dịch tinh sạch và so sánh với phổ hấp thụ 
CoQ10 chuẩn. Kết quả phổ hấp thụ ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3 
lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương đương như cường độ hấp thụ của dịch 
CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 
lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối với dịch chiết 3 lần chiết) 
so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống 
1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả thu được cho 
thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch hơn đặc 
biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương pháp 
này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp 
dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10. 
3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc 
gel qua cột silica 
Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch 
sử dụng sắc ký cột silica gel. Kết quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10 
sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm 
và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 
13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 109 – 
800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm đi khoảng 24 
% trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.17). 
Hình 3.17. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ 
sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, 
dịch CoQ10 chuẩn 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L3 S E
18 
Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ của dịch tinh sạch chỉ còn cao 
hơn là 1,46 lần và thấp hơn nhiều so với dịch CoQ10 chiết 1 lần (2,59) và dịch chiết 3 
lần chiết (1,91). 
3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 
 Dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách 
chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp luận án đã xây dựng quy trình thu nhận 
CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp như hình 3.18. 
Hình 3.18. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 
A. tumefaciens tái tổ hợp 
Lên men 
(28
oC, pH đầu 8, cấp giống OD 
giống 0.8, thời gian 96 giờ 
Ly tâm 
thu sinh khối 
Phá vỡ tế bào 
Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g, 
đồng hóa 3 phút, ủ 37o trong 3 giờ 
Tách chiết 
n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v) 
Ly tâm thu dịch 
Cô đặc chân không, áp suất 260 
mbar, nhiệt độ 45oC 
n –hexan 
tỷ lệ 1:1 
Ethanol 
100% 
Chế 
phẩmCoQ10 
Tinh sạch 
 Chiết bằng ethanol:hexane, cô đặc, tinh 
sạch bằng cột silica 
Cô đặc chân không, áp suất 260 
mbar, nhiệt độ 45oC 
19 
3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 
Nghiên cứu đặc tính cho thấy CoQ10 CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng 
pH 6 – 9, bị phá hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang (hình 3.39, 3.40, 
3.41). 
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ(A), pH (B), ánh sáng (C) đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ 
tế bào A. tumefaciens tái tổ hợp. 
3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 
3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 
Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác định thông qua việc làm 
giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 
517 nm trên máy quang phổ. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của Coenzyme 
Q10 tăng khi nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần. Dựa trên kết quả tính toán, tại nồng 
độ 0,18 mM Coenzyme Q10 có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH 
(EC50 = 0,18 mM). 
3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ của CoQ10 
Ảnh hưởng của CoQ10 đến tế bào ung thư được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào 
còn sống sau khi xử lý với CoQ10. Kết quả hình 3.20 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng ít 
đến sự sinh trưởng của cả hai dòng tế bào ung thư ở nồng độ dưới 20 µM sau 72 giờ 
xử lý. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn 40 và 80 µM, CoQ10 đã có sự ảnh hưởng rõ rệt 
0
20
40
60
80
100
120
0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h
Đ
ộ
 b
ề
n
tư
ơ
n
g
 đ
ố
i (
%
)
Thời gian (giờ)
4oC 25oC 37oC 60oC
0
20
40
60
80
100
120
0h 24h 48h 72h 96h 120h
Đ
ộ
 b
ề
n
 tư
ơ
n
g
 đ
ố
i (
%
)
Thời gian (giờ)
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
0
20
40
60
80
100
120
0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h
Đ
ộ
 b
ề
n
 tư
ơ
n
g
 đ
ố
i (
%
)
Thời gian (giờ)
Che tối Chiếu sáng Leon Chiếu sáng mặt trời
A 
B 
C 
20 
lên cả hai dòng tế bào ung thư. Đối với tế bào Hep-2C, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 
giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 35,1 và 27,1%; ở nồng độ 80 µM là 29,4 và 
14,7% tương ứng. Đối với dòng tế bào FL, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ 
xử lý ở nồng độ 40 µM là 50,8 và 26,1% tương ứng; 100% tế bào bị chết ở nồng độ 
80 µM sau 48 giờ xử lý. Kết quả nghiên cứu trên dòng tế bào thận thỏ bình thường 
RK13 cho thấy tế bào sinh trưởng hoàn toàn bình thường ở các nồng độ khảo sát. 
Hình 3.20. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào 
thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10 
A 
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0h 24h 48h 72h
Số
 lư
ợn
g t
ế 
bà
o/
 gi
ến
g
Thời gian (giờ)
Control 5 uM 10 uM 20 uM 40 uM 80 uM
0 µM 20 µM 80 µM 
B 
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0h 24h 48h 72h
S
ố 
lư
ợn
g 
tế
 b
ào
/ g
iế
ng
Thời gian (giờ)
Control 5 uM 10 uM 20 uM 40 uM 80 uM
0 µM 20 µM 80 µM 
C 
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0h 24h 48h 72h
Số
 lư
ợn
g 
tế
 b
ào
/ g
iến
g
Thời gian (giờ)
Control 5 uM 10 uM 20 uM 40 uM 80 uM
0 µM 20 µM 80 µM 
21 
3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM 
CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG 
3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin 
Cyclodextrin là một chất có bề mặt ưa nước ở phía ngoài và phần kỵ nước nằm 
bên trong, do đó nó có thể hình thành phức với các hợp chất ưa béo và làm tăng độ 
hòa tan trong nước, độ bền, hoạt tính sinh học của chúng. Dạng hòa tan trong nước 
của CoQ10 sẽ tăng khả năng hấp thu vào tế bào và đồng thời tăng cường quá trình hô 
hấp của ty thể. Vì vậy, CoQ10 đã được tạo phức với β-cyclodextrin với các tỷ lệ mol 
khác nhau (1:1, 1:3, 1:5, 1:10). Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích hợp tiến 
hành đánh giá tỷ lệ thu hồi của CoQ10 từ các công thức thông qua hàm lượng CoQ10 
trước và sau khi sấy phun. Kết quả cho thấy tỷ lệ CoQ10: β-CD 1:5 và 1:3 cho khả 
năng thu hồi CoQ10 cao hơn đáng kể so với các tỷ lệ khác. Trong đó, tỷ lệ 1:5 khả 
năng thu hồi CoQ10 là cao nhất đạt 99%. 
3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin 
3.8.2.1. Khả năng hòa tan của phức CoQ10- β- Cyclodextrin 
 Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan trong nước của phức β-CDQ10 cho thấy 
khả năng hòa tan tăng lên khi tỷ lệ tạo phức giữa CoQ10 và β-CD tăng. Với tỷ lệ 1:1 
và 1:3, dung dịch β-CDQ10 xuất hiện kết tủa sau 60 phút, trong khi đó tỷ lệ 1:5 – 
1:20 không thấy xuất hiện sự lắng cặn này. 
Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong các pH khác 
nhau cho thấy mức độ hòa tan là phụ thuộc vào pH và tỷ lệ giữa CoQ10: β-CD. Ở pH 
thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan kém hơn so với ở pH 6 và 7. Mức độ hòa tan của tỷ lệ 
1:1 và 1:3 kém trong tất cả các pH khảo sát (pH 2-7). Tỷ lệ 1:5 có khả năng hòa tan 
tốt ở pH 6-7, giảm đi ở pH 2-5. 
3.8.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin 
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), ánh sáng (B) đến độ bền của CoQ10 
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
C
o
Q
1
0
 c
ò
n
 lạ
i (
%
)
Thời gian (giờ)
4oC 25oC 37oC 60oC
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 144
C
o
Q
1
0
 c
ò
n
 lạ
i (
%
) 
Thời gian (giờ) 
Che tối 
Chiếu sáng Leon 
Chiếu sáng mặt trời 
A 
B 
22 
Kết quả hình 3.21A cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144 
giờ ở điều kiện nhiệt độ từ 4 – 60oC. Từ kết quả thu được có thể thấy phức CoQ10-
CD có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa cho quá trình tạo chế phẩm CoQ10, 
bảo quản cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này. 
3.8.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin 
Kết quả cho thấy khi bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 45,4 % 
sau 144 giờ chiếu sáng (hình 3.21B). Tuy nhiên mức độ giảm thấp hơn khoảng 2 lần 
so với CoQ10 tự do. Khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời theo ngày đêm hàm 
lượng CoQ10 giảm đến 45% sau 96 giờ. Tương tự, sự tổn thất của CoQ10 trong phức 
β-CDQ10 thấp hơn CoQ10 ở trạng thái tự do. Như vậy, việc tạo phức với β-CD làm 
tăng đáng kể độ bền của CoQ10 dưới tác dụng của ánh sáng. 
3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 
 Dựa vào các kết quả nghiên cứu tạo phức CoQ10 với β-cyclodextrin. Quy 
trình công nghệ điều chế thực phẩm chức năng bổ sung dưới dạng viên nang cứng 
chứa CoQ10 được thể hiện trên hình 3.22. 
Hình 3.22. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10 
CoQ10 
Tạo phức với β – cyclodextrin 
tỷ lệ 1:5 (mol/mol) 
Khuấy trộn trong 60 phút, nhiệt độ 60oC 
Phối trộn, đóng viên nang, 
bao gói 
β – cyclodextrin 
Maltodextrin 
Sản phẩm viên 
nang cứng 
CoQ10 
Sấy phun 
Nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC 
23 
3.8.4. Kiểm nghiệm viên nang chứa CoQ10 
 Các kết quả thu được khi tiến hành kiểm nghiệm viên nang thực phẩm chức năng 
CoQ10 về các tiêu chí: độ đồng đều khối lượng, độ tan rã, độ ẩm, độ đồng đều hàm 
lượng đều đạt tiêu chuẩn yêu cầu của viên nang theo dược điển Việt Nam IV. 
 Kiểm tra phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: Viên nang thực phẩm 
chức năng chứa CoQ10 từ sinh khối A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp đã được Viện 
Dinh dưỡng phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Kết quả được trình bày trong 
bảng 3.2 cho thấy sản phẩm đạt chỉ tiêu chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm. 
Bảng 3.2. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 
TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Phương pháp 
1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g KPH TCVN 4884:2005 
2 Coliforms CFU/g KPH TCVN 6848:2007 
3 E. coli CFU/g KPH TCVN 7924-
2:2008 
4 S. aureus CFU/g KPH TCVN 4830-
1:2005 
5 Shigella spp CFU/25g KPH TCVN 7902:2008 
6 B. cereus CFU/g KPH TCVN 4992:2005 
7 Salmonella CFU/25g KPH TCVN 4829:2005 
8 Tổng số bào tử nấm men, 
mốc 
CFU/g KPH TCVN 8275-
2:2010 
9 Aflatoxin G1 μg/kg KPH 
AOAC 990.33 
10 Aflatoxin B1 μg/kg KPH 
11 Aflatoxin G2 μg/kg KPH 
12 Aflatoxin B2 μg/kg KPH 
13 Chì μg/kg 0,120 
AOAC 991.10 
14 Thủy ngân μg/kg 0,040 
15 Cadimi μg/kg 0,028 
Thử nghiệm độc tính cấp của viên nang thực phẩm chức năng Coenzyme Q10 
trên chuột. Cho chuột uống mẫu thử với mức liều từ 5 – 20 viên/kg chuột. Kết quả 
không nhận thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng, không nhận thấy có biểu 
hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn 
uống, hoạt động và tăng trọng bình thường. Không xác định được liều gây chết 50% 
động vật thí nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều 
tối đa nhất có thể cho uống. 
24 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
Luận án đã thu được những kết quả chính như sau: 
1. Từ 12 chủng vi khuẩn phân lập được từ nốt sần cây hoa hồng huyện Tây Tựu – 
Hà Nội đã tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 có khả năng sinh tổng 
hợp CoQ10 cao cho nghiên cứu tiếp theo. 
2. Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dxs và dps mã hóa cho 2 enzyme chìa 
khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân 
lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp mang 2 gen 
trên cho năng suất sinh tổng hợp CoQ10 cao. 
3. Xác định được điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng A. tumefaciens DPXS12 tái 
tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: sucrose 5 %, CSL: 1%, nhiệt độ 28oC, pH đầu 8, 
OD cấp giống 0.8, thời gian 96 giờ, hàm lượng CoQ10 thu được đạt 127,18 
mg/l. 
4. Xây dựng được quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp: 
Ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt 
độ 37oC trong 3 giờ, chiết bằng hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 
45
o
C, tinh sạch bằng hệ dung môi ethanol:hexane và cột silica. 
5. Đã xác định được một số đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của CoQ10 từ 
A. tumefaciens tái tổ hợp. CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9, 
không bền bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang, có khả năng chống 
oxy hóa thông qua khử gốc tự do DPPH (EC50 = 0,18 mM). Bước đầu chứng 
minh được CoQ10 có khả năng ức chế hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-
2C và FL. 
6. Đã tạo được phức CoQ10 - β-cyclodextrin để hòa tan tốt trong nước và ứng 
dụng trong chế tạo viên nang dạng thực phẩm chức năng. 
Kiến nghị: 
Tiếp tục khảo sát một số hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng của 
CoQ10 trong thực phẩm chức năng như sữa tươi và đồ uống có bổ sung 
CoQ10.