Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong điều chế chất chuẩn asiaticosid

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG ĐIỀU CHẾ CHẤT 
CHUẨN ASIATICOSID 
Nguyễn Thụy Hai*, Nguyễn Minh Đức* 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: Tiến hành điều chế asiaticosid có độ tinh khiết cao từ bột trích tinh Rau má bằng phương pháp sắc 
ký lỏng hiệu năng cao. 
Phương pháp: Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích để thăm dò điều kiện thích hợp, từ đó 
áp dụng qua máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế để thu được asiaticosid.(2) 
Kết quả: Thu được asiaticosid có độ tinh khiết cao có thể sử dụng làm chất chuẩn với điều kiện sắc ký 
điều chế như sau: Cột Discovery HS C18 (250 x 21,2mm; 10µm), với pha động là hỗn hợp gồm methanol – 
nước (60:40), tốc độ dòng 20ml/phút, đầu dò SPD đặt ở 203 nm. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết được xác 
định lại bằng phương pháp NMR.(1) 
Kết luận: Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, chúng ta có thể điều chế các chất chuẩn có độ tinh khiết cao 
một cách nhanh chóng và hiệu quả. 
Từ khóa: điều chế, sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích, asiaticosid. 
ABSTRACT 
PREPARATION OF ASIATICOSIDE REFERENCE STANDARD BY HIGH PERFORMANCE LIQUID 
CHROMATOGRAPHY 
Nguyen Thuy Hai, Nguyen Minh Duc 
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 1 - 2010: 59-63 
Objective: Preparation of asiaticoside with high purity from a powder extract of Centella asiatica by 
preparative high performance liquid chromatography (HPLC) method. 
Method: Using analytical HPLC to determine the appropriate separating conditions, we carried out the 
found conditions to the preparative HPLC to obtain asiaticoside. 
Results: We obtained asiaticoside of high purity which can be used as standard with the preparative 
HPLC conditions as follows: Discovery HS C18 column (l:250 x i.d :21.2 mm; particle size: 10µm), mobile 
phase: MeOH – H2O (60: 40), flow rate 20ml/min, SPD- 20A detector set at 203 nm. Chemical structure 
and purity of asiaticoside were determined by conventional methods (analytical HPLC and NMR). 
Conclusions: By preparative HPLC, we can produce asiaticoside with standard grade, the process was 
proven more quickly and efficient than classical methods. 
Key words: preparation, analytical HPLC, asiaticoside. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Một trong những điểm yếu lớn nhất hiện 
nay của việc khai thác sử dụng cây thuốc và 
các chế phẩm từ cây thuốc là vấn đề kiểm soát 
chất lượng. Điều này làm hạn chế khả năng 
khai thác sử dụng nguồn tài nguyên cây thuốc 
dồi dào của đất nước ta. Hiện nay nhiều 
phương pháp kiểm nghiệm hiện đại như các 
phương pháp phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao . 
. . rất hữu hiệu trong việc tiêu chuẩn hoá và 
* Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp.HCM 
Địa chỉ liên hệ: DS. Nguuyễn Thụy Hai ĐT: 01696831286 Email: ngthuyhai1986@gmail.com 
kiểm định cây thuốc và thuốc từ dược liệu. 
Tuy nhiên, để áp dụng các phương pháp này, 
một trong những yêu cầu đầu tiên là phải có 
các chất chuẩn. Hơn thế nữa, các chất chuẩn 
còn rất cần thiết cho công tác nghiên cứu phát 
triển dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu. 
Tuy nhiên, một trong những khó khăn cho 
việc phân tích, kiểm nghiệm ở nước ta là thiếu 
các chất chuẩn cần thiết, vì các chất chuẩn mua 
từ nước ngoài rất đắt tiền, nhiều khi không có 
sẵn. 
Xuất phát từ các lý do trên, đề tài này được 
thực hiện nhằm mục tiêu chiết xuất, điều chế 
asiaticosid để làm chất chuẩn phục vụ công tác 
kiểm định thuốc, tiêu chuẩn hóa chất lượng 
các sản phẩm và nguyên liệu chứa asiaticosid. 
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Đối tượng 
Bột trích tinh rau má do Công ty TNHH 
ADC cung cấp. 
Dung môi, hóa chất 
Methanol, HPLC, Merck, Đức. 
Thiết bị 
Máy HPLC phân tích LC-10 AD 
(Shimadzu, Japan). 
Máy HPLC điều chế LC- 20 A (Shimadzu, 
Japan). 
Máy cô chân không R-200, Buchi, Thụy Sỹ. 
Phương pháp nghiên cứu 
Thăm dò điều kiện trên HPLC phân tích 
Chúng tôi tiến hành thăm dò điều kiện 
thích hợp để tách asiaticosid từ bột trích tinh 
rau má trên máy HPLC phân tích, từ đó áp 
dụng qua máy HPLC điều chế. Do nếu trực 
tiếp thăm dò trên máy HPLC điều chế sẽ rất 
lãng phí dung môi. 
Điều kiện sắc ký 
Cột Supelcosil LC18 250 x 4.6 mm, 5 µm + 
guard column 
Hệ dung môi: MeOH – H2O 
Bước sóng: 203 nm 
Tốc độ dòng: 0,7 ml/min 
Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với 
nồng độ 3mg/ 5ml pha động 
Thể tích bơm mẫu: 20µl 
Tiến hành tách asiaticosid trên máy HPLC 
điều chế từ bột trích tinh rau má 
Sau khi tìm được điều kiện thích hợp để tách 
asiaticosid từ bột trích tinh rau má, ta áp dụng 
điều kiện đó qua máy HPLC điều chế để bắt đầu 
tiến hành tách thu lấy asiaticosid. 
Điều kiện sắc ký 
Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 
µm + guard column 
Hệ dung môi: MeOH – H2O đã thăm dò 
được ở trên 
Bước sóng: 203 nm 
Tốc độ dòng: 20 ml/min 
Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với 
nồng độ 300mg/ 10ml pha động. 
Thể tích bơm mẫu: 10ml 
Thu nhận phân đoạn asiaticosid 
Tiến hành cô giảm áp phân đoạn asiaticosid 
tách được từ máy HPLC điều chế. 
Sau đó đem sấy chân không ở 50oC. Thu 
được asiaticosid ở dạng tinh thể màu trắng. 
Tinh chế asiaticosid lần 2 bằng máy HPLC 
điều chế để thu được asiaticosid tinh khiết 
Do ta thực hiện bơm mẫu overload nên 
phần asiaticosid thu nhận được chưa thực sự 
tinh khiết hoàn toàn, do đó ta phải tiến hành 
tinh chế lần 2 để có được asiaticosid tinh khiết 
hơn. 
Điều kiện sắc ký 
Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 µm 
+ guard column 
Hệ dung môi: MeOH – H2O 
Bước sóng: 203 nm 
Tốc độ dòng: 20 ml/min 
Mẫu: asiaticosid thu được ở trên được pha 
với nồng độ 200mg/ 10ml pha động. 
Thể tích bơm mẫu: 10 ml 
Kiểm tra phổ NMR 
Sau khi tiến hành tinh chế lần 2 xong, đem 
cô giảm áp rồi sấy chân không ở 50oC thu được 
tinh thể asiaticosid tinh khiết. 
Tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp 
NMR để xác định rõ cấu trúc. 
KẾT QUẢ 
Dựa vào các tài liệu tham khảo về asiaticosid 
và thăm dò điều kiện trên máy HPLC phân tích, 
chúng tôi đã đưa ra điều kiện sắc ký với hệ dung 
hệ dung môi MeOH – H2O (60: 40) cho kết quả 
tách tốt nhất.(2) 
Kết quả 
Hình 1. 
Sắc ký đồ của mẫu bột trích tinh rau má trên máy HPLC phân tích. 
Sau khi đã tìm được điều kiện sắc ký thích 
hợp, sẽ áp dụng qua máy HPLC điều chế để 
tiến hành điều chế asiaticosid. 
Kết quả 
Với điều kiện thích hợp nhất thăm dò được 
áp dụng qua máy sắc ký điều chế: 
Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 
µm + Guardcol 
Hệ dung môi: MeOH – H2O 
 60 40 
Bước sóng: 203 nm 
Tốc độ dòng: 20 ml/min 
Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với 
nồng độ 300mg/ 10ml pha động. 
Thể tích bơm mẫu: 10ml 
Hình 2. Sắc ký đồ của bột trích tinh rau má trên máy 
HPLC điều chế. 
Dựa trên sắc ký đồ từ máy HPLC điều chế, 
ta lần lượt thu nhận các phân đoạn 1 ở (7,754 
phút); phân đoạn 2 (8,957 phút) và phân đoạn 3 
(10,589 phút). 
Phân đoạn 3 chính là phân đoạn của 
asiaticosid cần thu nhận. 
Bơm overload để tiết kiệm thời gian và 
dung môi. 
Mẫu được pha với nồng độ 550mg/ 10ml 
pha động, thể tích bơm 10ml/ lần. 
Kết quả 
Hình 3. Sắc ký đồ của bột trích tinh rau má trên 
máy HPLC điều chế khi bơm overload. 
Sau khi thu nhận các phân đoạn chính, ta 
tiến hành cô giảm áp thu lấy tinh thể 
asiaticosid. 
Tiến hành tinh chế lần 2 vẫn với điều kiện 
sắc ký đã thăm dò được. 
Mẫu được bơm vào là lượng asiaticosid 
thu được từ lần tinh chế 1 (đã có độ tinh khiết 
khá cao) được pha với nồng độ 200 – 300mg/ 
10ml pha động. 
Kết quả 
Hình 4. Sắc ký đồ của asaticosid được tinh chế lần 2 
trên máy HPLC điều chế. 
Dựa trên sắc ký đồ từ máy HPLC điều chế 
ta dễ dàng thu nhận được asaticosid tinh khiết 
(phân đoạn 9,518 phút). 
Tiến hành cô giảm áp để thu lấy tinh thể 
asiaticosid tinh khiết 
Tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp 
NMR.(1) 
Kết quả 
Phổ 1H-NMR (pyridinD5) cho các tín hiệu 
đặc trưng sau: 
7 tín hiệu proton ở 0,85ppm (3H, s); 
0,87ppm (3H, s); 0,89ppm (3H, s); 1,04ppm 
(3H, s); 1,06ppm (3H, s); 1,11ppm (3H, s); 
1,15ppm (3H, s) có thể gán lần lượt cho các 
nhóm – CH3 ở vị trí 24, 25, 26, 27, 29, 30, 6’’’. 
Tín hiệu proton của 3 nhóm metin nối trực 
tiếp với oxigen cộng hưởng ở trường thấp 
6,15ppm (1H, d, J = 8Hz); 5,39ppm (1H, d, J = 
3,5Hz); 4,95ppm (1H, d, J = 7,5Hz) có thể gán 
cho các proton ở vị trí 1’, 1’’, 1’’’. 
1 tín hiệu proton ở vị trí 4,38ppm (1H, t, J = 
9Hz) có thể gán cho proton ở vị trí 12. 
Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu có 
thể gán cho proton các nhóm –CHOH trên 
aglycon và trên chuỗi đường. Các tín hiệu này 
bị chồng phủ nên khó xác định chính xác. 
Phổ 13C NMR, DEPT90 và DEPT135 cho 
thấy các mũi cộng hưởng ứng với 48 carbon 
bao gồm một carbon carbonyl của một nhóm 
ceton bất bão hòa cộng hưởng ở trường thấp 
[δC = 176,2; C-28]; carbon của bảy nhóm metyl 
nằm trong vùng từ 13,0 – 25,0 ppm; mười một 
nhóm metylen trong đó carbon của ba nhóm 
metylen nối trực tiếp với oxigen cộng hưởng ở 
vị trí [δC = 66,7; C-23], [δC = 69,0; C-6’], [δC = 
61,1; C-6’’], carbon của tám nhóm metylen còn 
lại nằm trong vùng từ 18,0 – 50,0 ppm; ba 
nhóm metin có carbon nối trực tiếp với oxigen 
cộng hưởng ở vị trí [δC = 95,7; C-1’], [δC = 
105,0; C-1’’], [δC = 102,6; C-1’’’]; hai carbon của 
nối đôi cộng hưởng ở vị trí [δC = 125,9; C-12], 
[δC = 138, 8; C-13]. 
Bảng 1. Bảng dữ liệu phổ 13C-NMR của SAS 
(pyridineD5) so với dữ liệu phổ 13C-NMR của 
asiaticosid 
C SAS Asiaticosid C SAS Asiaticosid 
1 48,1 47,8 25 18,0 17,6 
2 68,9 68,9 26 18,1 17,8 
3 78,3 78,1 27 23,8 23,7 
4 43,6 43,6 28 176,2 176,3 
5 48,1 48,1 29 17,8 17,3 
6 18,6 18,4 30 21,2 21,3 
7 31,1 33,1 1’ 95,8 95,6 
8 40,5 40,2 2’ 73,9 73,9 
9 48,0 48,0 3’ 77,9 77,9 
10 38,3 38,3 4’ 71,0 70,9 
11 23,4 23,8 5’ 77,1 77,1 
12 125,9 126 6’ 69,4 69,3 
13 138,8 138,5 1’’ 104,9 104,8 
14 42,9 42,5 2’’ 75,3 75,3 
15 28,9 28,7 3’’ 76,5 76,4 
16 24,9 24,5 4’’ 78,7 78,6 
17 48,4 48,4 5’’ 78,3 78,2 
18 53,3 53,2 6’’ 61,3 61,3 
19 39,2 39,3 1’’’ 102,6 102,6 
20 39,1 39 2’’’ 72,5 72,5 
21 31,1 30,8 3’’’ 72,7 72,7 
22 37,0 36,8 4’’’ 73,8 73,7 
23 66,8 66,4 5’’’ 70,3 70,2 
24 14,5 14,3 6’’’ 18,7 18,4 
Hình 5. Asiaticosid 
KẾT LUẬN 
Sau thời gian tiến hành đề tài “Ứng dụng 
sắc ký lỏng hiệu năng cao trong điều chế chất 
chuẩn asiaticosid” chúng tôi đã thu được một 
số kết quả sau: 
Điều chế được asiaticosid với lượng lớn. 
Sau khi điều chế được đã tiến hành kiểm 
tra độ tinh khiết, cấu trúc hóa học bằng NMR 
Tiết kiệm được nhiều công đoạn, dung 
môi, hóa chất, đặc biệt là thời gian. 
Không chỉ tách được asiaticosid mà đồng 
thời còn thu thêm được các chất khác như 
madecassosid 
Qua quá trình tiến hành đề tài, không chỉ 
thu được các chất chuẩn mà còn đề ra được 
một phương pháp điều chế, phân lập ổn định, 
là cơ sở để điều chế các chất chuẩn có qui mô 
lớn trong tương lai. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005). Phổ NMR sử dụng 
trong phân tích hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia 
TP. Hồ Chí Minh. 
2. Nguyễn Minh Đức (2006). Sắc ký lỏng hiệu năng cao 
và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm 
dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên. Nhà xuất 
bản Y học.