Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax dựa trên kỹ thuật recombinase polymerase amplification

760(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Đặt vấn đề
Sốt rét là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng thuộc chi 
Plasmodium gây ra [1]. Có hơn 100 loài khác nhau của chi 
Plasmodium nhưng chỉ có 5 loài (P. falciparum, P. vivax, P. 
malariae, P. ovale và P. Knowlesi) được biết là gây bệnh ở người. 
P. falciparum được tìm thấy phổ biến ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt 
đới và đặc biệt là châu Phi. P. vivax tập trung nhiều và gây bệnh 
chủ yếu ở châu Á, châu Mỹ La tinh và vài khu vực của châu Phi 
[2]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến năm 2013, 
trên toàn thế giới vẫn còn hơn 198 triệu ca mắc bệnh sốt rét và nửa 
triệu ca tử vong [3]. Bệnh sốt rét ở Việt Nam chủ yếu do 2 loài ký 
sinh trùng P. falciparum (khoảng 55%) và P. vivax (khoảng 45%) 
gây ra. Đây là bệnh lưu hành địa phương, chủ yếu ở vùng rừng, 
đồi núi, ven biển nước lợ; bệnh xảy ra quanh năm, nhưng chủ yếu 
vào mùa mưa. Ở Việt Nam, cho đến năm 2015 vẫn còn hơn 14.000 
ca mắc bệnh sốt rét và có hơn 6,3 triệu người sống trong vùng có 
nguy cơ mắc sốt rét cao. Ngoài ra, trong những năm gần đây, hiện 
tượng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc ở các vùng sốt rét lưu hành 
tại Việt Nam ngày càng phổ biến với mức độ kháng ngày càng 
tăng [4]. Do đó, mỗi người cần phải thực hiện các biện pháp phòng 
tránh bệnh sốt rét nhằm bảo vệ sức khoẻ của bản thân, gia đình, 
góp phần làm giảm gánh nặng cho xã hội.

Có nhiều phương pháp để chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét như: 
chẩn đoán lâm sàng, soi kính hiển vi, thử nghiệm miễn dịch (test 
nhanh), chẩn đoán huyết thanh, kính hiển vi huỳnh quang và các 
kỹ thuật nhân bản acid nucleic như PCR và nhân bản đẳng nhiệt. 
Các phương pháp như chẩn đoán lâm sàng, soi kính hiển vi, test 
nhanh không đòi hỏi nhiều về trang thiết bị nhưng độ nhạy và độ 
đặc hiệu không cao. Các kỹ thuật nhân bản acid nucleic như PCR 
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhưng đòi hỏi về trang thiết 
Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 
Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax 
dựa trên kỹ thuật recombinase polymerase amplification
Nguyễn Ngọc Bảo Huy1,2, Quan Quốc Đăng3, Nguyễn Hoàng Chương2*
1Công ty TBR
2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh
3Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ, Thành Đoàn TP Hồ Chí Minh
Ngày nhận bài 26/10/2018; ngày chuyển phản biện 29/10/2018; ngày nhận phản biện 23/11/2018; ngày chấp nhận đăng 30/11/2018
Tóm tắt:
Sốt rét là bệnh nhiễm trùng gây ra bởi các loài ký sinh thuộc chi Plasmodium. Ở Việt Nam, bệnh sốt rét chủ yếu do 
Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax gây ra thông qua trung gian truyền bệnh là muỗi Anopheles. Bệnh sốt 
rét chủ yếu lưu hành tại vùng rừng, đồi núi, ven biển nước lợ ở Việt Nam, nơi mà các phương pháp chẩn đoán bệnh 
sốt rét khó được tiếp cận. Trong lúc vaccine cho sốt rét chưa được ứng dụng rộng rãi trong thực tế lâm sàng thì việc 
điều trị bệnh sốt rét phụ thuộc chủ yếu vào các thuốc chống sốt rét, đặc biệt khi bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn 
sớm. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật recombinase polymerase amplification (RPA) được áp dụng nhằm phát triển 
quy trình xét nghiệm phát hiện đồng thời hai tác nhân chính gây bệnh sốt rét là P. falciparum và P. vivax. Kết quả 
nghiên cứu cho thấy: đã thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản ADN của P. falciparum và P. vivax 
trong phản ứng duplex RPA. Tiếp đến, các thông số của phản ứng duplex RPA như nhiệt độ phản ứng và thể tích 
phản ứng được tối ưu hoá nhằm giảm chi phí, đạt được hiệu quả tốt. Nghiên cứu cũng xây dựng phản ứng lai dựa 
trên kỹ thuật lateral flow strip với các mẫu dò đặc hiệu cho P. falciparum và P. vivax nhằm giảm thao tác và thời gian 
tiến hành cũng như nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện sản phẩm RPA từ P. falciparum và P. vivax. Quy trình 
duplex RPA được ứng dụng để thử nghiệm trên 33 mẫu ADN được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm ký 
sinh trùng sốt rét và so sánh với quy trình monoplex real-time PCR. Kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax của 
2 quy trình này là tương đồng. Quy trình phát hiện P. falciparum và P. vivax được xây dựng trong nghiên cứu này có 
khả năng được phát triển thành bộ kit phát hiện nhanh P. falciparum và P. vivax ứng dụng trong thực tế lâm sàng. 
Từ khóa: chẩn đoán phân tử, nhân bản đẳng nhiệt, Plasmodium, recombinase polymerase amplification, sốt rét.
Chỉ số phân loại: 3.3
*Tác giả liên hệ: Email: nhchuong@hcmus.edu.vn
860(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
bị cũng như kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó, việc phát triển 
một phương pháp đơn giản hơn nhưng lại cho độ nhạy và độ đặc 
hiệu cao để chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét là hết sức cần thiết. 
PRA là phương pháp nhân bản ADN đẳng nhiệt ở nhiệt độ từ 37-
420C và trong thời gian khoảng 5-20 phút. Recombinase, SSB và 
polymerase là 3 protein đóng vai trò quan trọng trong phản ứng 
RPA. Recombinase và SSB sẽ giúp gắn mồi và trình tự ADN mục 
tiêu. Sau đó, mồi sẽ được kéo dài nhờ polymerase. Đây là một kỹ 
thuật khuếch đại acid nucleic nên cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao 
như PCR. RPA có thể sử dụng cho xác định bệnh và phát hiện đa 
hình nucleotide đơn ở ung thư của người và sinh vật biến đổi gen 
[5]. Ngoài ra, RPA cũng có thể được ứng dụng trong kiểm tra vi 
sinh trong mẫu nước, thực phẩm và trong lĩnh vực trồng trọt, chăn 
nuôi. Do chỉ cần hoạt động ở nhiệt độ thấp nên RPA có khả năng 
ứng dụng cao trong chẩn đoán tại hiện trường hoặc các điểm chăm 
sóc sức khỏe. Ở Việt Nam, P. falciparum và P. vivax là hai ký sinh 
trùng sốt rét gây bệnh phổ biến và với đặc điểm chẩn đoán ký sinh 
trùng sốt rét càng sớm và chính xác thì việc điều trị bệnh sốt rét 
càng hiệu quả, chúng tôi thực hiện nghiên cứu xây dựng một quy 
trình phát hiện đồng thời P. falciparum và P. vivax dựa trên kỹ 
thuật duplex RPA với mong muốn đóng góp một công cụ vào việc 
kiểm soát hiệu quả bệnh sốt rét ở Việt Nam.
Đối tượng và phương pháp 
Vật liệu
Các mẫu ADN tách chiết từ P. falciparum và P. vivax được 
nuôi cấy nhân tạo và các mẫu ADN tách chiết từ các mẫu bệnh 
phẩm nghi nhiễm ký sinh trùng sốt rét được cung cấp bởi Viện 
Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP Hồ Chí Minh. Các mồi và 
mẫu dò được tổng hợp và cung cấp bởi Công ty Integrated ADN 
Technologies. Các hóa chất thực hiện phản ứng RPA được cung 
cấp bởi Công ty TwistDX. Các hóa chất cho phản ứng lateral flow 
strip được cung cấp bởi Công ty Milenia Biotec. Các hóa chất thực 
hiện phản ứng real-time PCR được cung cấp bởi Công ty Bioline. 
Các hóa chất điện di trên gel agarose được cung cấp bởi Công ty 
Bioline và Công ty TBR. 
Thiết kế mồi và mẫu dò phát hiện đặc hiệu P. falciparum và 
P. vivax
Vùng gen 18S rRNA của Plasmodium được lựa chọn để thiết kế 
các mồi và mẫu dò đặc hiệu cho P. falciparum và P. vivax. Tất cả các 
trình tự gen 18S rRNA của P. falciparum và P. vivax (JQ627149.1, 
JQ627149.1, JQ627149.1, JQ627149.1, JQ627149.1, JQ627149.1, 
JQ627149.1, JQ627149.1, JQ627149.1) được tải về từ GenBank. 
Sau đó, các vùng gen này được so hàng bằng phần mềm Clustal 
X để tìm ra các đoạn bảo tồn. Trên các đoạn bảo tồn này, một mồi 
ngược chung và hai mồi xuôi đặc hiệu cho P. falciparum và P. 
vivax được thiết kế sử dụng phần mềm Annhyb. Ngoài ra, mẫu 
dò đặc hiệu cho P. falciparum và P. vivax cũng được thiết kế theo 
cách tương tự. Đặc tính kỹ thuật của các mồi và mẫu dò được kiểm 
tra bằng phần mềm OligoAnalyzer. Tính đặc hiệu lý thuyết của 
các mồi và mẫu dò được khảo sát với phần mềm Blast. Trình tự 
các mồi và mẫu dò được gửi tổng hợp tại Công ty Integrated ADN 
Technologies.
Constructing a molecular assay 
based on the recombinase polymerase 
amplification technique for 
simultaneous detection of Plasmodium 
falciparum and Plasmodium vivax
Ngoc Bao Huy Nguyen1,2, Quoc Dang Quan3, 
Hoang Chuong Nguyen2*
1TBR Company
2University of Science, Vietnam National University, Ho Chi Minh City
3Center of Science and Technology Development, 
Ho Chi Minh Communist Youth Union
Received 26 October 2018; accepted 30 November 2018
Abstract:
Malaria is an infectious disease caused by Plasmodium 
species. In Vietnam, this disease is mainly caused by 
Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax through the 
malaria vector, the Anopheles mosquito. Malaria mainly 
circulates throughout the year in forest, mountainous, 
and coastal areas in Vietnam where diagnostic methods 
for this disease are often not easily accessible. Vaccines for 
malaria have been not available, but malaria medications 
are effective against the disease especially when malaria is 
diagnosed at the early stage. In this study, we developed 
a molecular assay based on the recombinase polymerase 
amplification (RPA) technique to detect P. falciparum 
and P. vivax in clinical samples. We successfully designed 
the specific primers to amplify the DNA of these two 
Plasmodium species in the duplex RPA reaction. Reaction 
temperature and reaction volume of the duplex RPA 
reaction were studied to reduce the operating cost. We 
also set up the hybridisation reaction with the specific 
P. falciparum and P. vivax probes based on the lateral 
flow strip technique to detect the RPA products. This 
hybridisation technique reduced manipulation and timing 
as well as improved the accuracy in the detection of P. 
falciparum and P. vivax by RPA. Finally, we evaluated the 
built molecular assay to detect P. falciparum and P. vivax 
on 33 DNA samples collected from malaria patients in 
comparison with the monoplex real-time PCR assay. The 
results of the two assays were identical. The duplex RPA 
assay could be developed into a quick test kit for the rapid 
and accuracy detection of P. falciparum and P. vivax in the 
treatment of malaria in Vietnam.
Keywords: isothermal duplication, malaria, molecular 
diagnosis, Plasmodium, recombinase polymerase 
amplification.
Classification number: 3.3
960(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Thiết lập phản ứng RPA và phát hiện sản phẩm RPA bằng 
kỹ thuật điện di
Phản ứng RPA được thiết lập trong tube thể tích 0,2 ml bao 
gồm các thành phần: 29,5 µl rehydration buffer; 2,5 µl magnesium 
acetate, 2 µl mỗi mồi (RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.VivaxF) có 
nồng độ 10 mM/mồi; 2,5 µl ADN bản mẫu; nước cất vừa đủ 50 
µl. Phản ứng RPA được ủ ở 37oC trong 40 phút. Sau khi kết thúc 
phản ứng, cho 100 µl phenol pH 8 vào trong tube 0,2 ml. Vortex 
và ly tâm 11.000 vòng/phút trong 2 phút. Thu dịch nổi để điện di 
trên gel agarose.
Khảo sát nhiệt độ và thể tích phản ứng duplex RPA
Nhiệt độ phản ứng: phản ứng RPA được thiết lập như trên và 
được ủ ở các nhiệt độ 25, 30
,
 35, 40oC để khảo sát khoảng nhiệt độ 
mà phản ứng duplex RPA có khả năng diễn ra.
Thể tích phản ứng: phản ứng RPA được thiết lập với đầy đủ các 
thành phần như trên nhưng với các thể tích phản ứng khác nhau, 
bao gồm 10, 20, 30, 40, 50 µl để khảo sát thể tích phản ứng nhỏ 
nhất vẫn cho kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax.
Thiết lập phản ứng RPA và phát hiện sản phẩm RPA bằng kỹ 
thuật lateral flow strip
Phản ứng RPA được thiết lập trong tube thể tích 0,2 ml bao 
gồm các thành phần: 29,5 µl rehydration buffer; 2,5 µl magnesium 
acetate, 2 µl mỗi mồi (RPA.PlasR, RPA.Falci-BIO, RPA.Vivax-
DIG) có nồng độ 10 µM/mồi; 0,6 µl mẫu dò RPA.Plas-FAM có 
nồng độ 10 µM; 2,5 µl ADN bản mẫu; nước cất vừa đủ 50 µl. Phản 
ứng RPA được ủ ở 37oC trong 40 phút. Sau khi kết thúc phản ứng, 
sử dụng 2 µl sản phẩm RPA phát hiện bằng lateral flow strip. 2 µl 
sản phẩm RPA của P. falciparum và P. vivax được trộn với dung 
dịch PBST running buffer (bộ kit Milenia Genline Hybridetect-2 
kit), sau đó rút 10 µl của dung dịch này cho lên vị trí nạp mẫu của 
que giấy. Trên que giấy chứa 3 vị trí tương ứng với vạch tín hiệu 
chứng nội, vạch tín hiệu cho P. falciparum và vạch tín hiệu cho 
P. vivax. Cuối cùng, cho que giấy này vào tube chứa 200 µl dung 
dịch PBST running buffer mới và quan sát kết quả hiện màu của 
hạt nano vàng sau 2-5 phút ở ba vị trí của chứng nội, P. falciparum 
và P. vivax. 
Thiết lập phản ứng real-time PCR
Phản ứng monoplex real-time PCR được thiết lập trong tube 
0,2 ml bao gồm các thành phần: 10 µl SensiFastTM Probe Lo-
ROX Mix 2X; 1 µl mỗi mồi (Plas-R, Faci-F, Vivax-F) với nồng độ 
10 µM/mồi; 0,25 µl mỗi mẫu dò (Falci-P, Vivax-P) với nồng độ 10 
µM/mẫu dò; 2,5 µl ADN bản mẫu; nước cất vừa đủ thể tích 20 µl. 
Chương trình real-time PCR: 1 chu kỳ 3 phút ở 95oC; 40 chu kỳ 
95oC trong 10 giây và 60oC trong 50 giây. Kết quả real-time PCR 
được phân tích sử dụng phần mềm của máy ABI 7500.
Phương pháp giải trình tự nucleotide Sanger
Các sản phẩm RPA từ P. falciparum và P. vivax được tinh 
sạch bằng bộ kit Expin PCR SV (GenAll). Sau đó, các sản phẩm 
này được đánh dấu huỳnh quang bằng phản ứng PCR với bộ kit 
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing (ThermoFisher). Tiếp 
đến, các sản phẩm đánh dấu huỳnh quang được phân tích trên máy 
giải trình tự tự động ABI 3500. Các trình tự giải mã được xử lý 
bằng phần mềm Sequencing Analysis Software v5.4 with KB™ 
Basecaller v1.4.1, sau đó được phân tích và so sánh với trình tự 
chuẩn trên GenBank bằng phần mềm BioEdit. 
Kết quả
Thiết kế các mồi và mẫu dò đặc hiệu cho P. falciparum và 
P. vivax
Trình tự các mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu này được 
trình bày trong bảng 1.
Tất cả các mồi và mẫu dò đã thiết kế được kiểm tra các đặc tính 
kỹ thuật bằng các phần mềm thích hợp nhằm đảm bảo có khả năng 
hoạt động tốt trong phản ứng RPA và phản ứng lai. Kết quả kiểm 
tra cho thấy, các mồi và mẫu dò đặc hiệu cho P. falciparum và P. 
vivax đã thiết kế đạt yêu cầu về mặt lý thuyết. Các mồi và mẫu dò 
này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Xây dựng phản ứng RPA nhằm phát hiện P. falciparum, P. 
vivax 
Phản ứng monoplex RPA được thiết lập cho P. falciparum, P. 
vivax với các mồi RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.VivaxF để khảo 
sát hoạt động thực tế của các mồi đã thiết kế. Kết quả điện di trên 
gel agarose của các phản ứng monoplex RPA được trình bày trong 
hình 1.
STT Tên Trình tự nucleotide Ghi chú
1 RPA.PlasR
CCC AAG CTA CTC CTA TTA ATC GTA ACT 
AAG CCA 
Tự thiết kế. Mồi ngược chung
2 RPA.FalciF
CGC TTT AAT ACG CTT CCT CTA TTA TTA 
TGT TC 
Tự thiết kế. Kết hợp với RPA.
PlasR tạo sản phẩm 246 bp
3 RPA.VivaxF
GCA ACG CTT CTA GCT TAA TCC ACA TAA 
CTG AT 
Tự thiết kế. Kết hợp với RPA.
PlasR tạo sản phẩm 279 bp
4 RPA.Plas-FAM
FAM-TGC TWT AWC TGT TTG CTT TGA 
ACA CTC TAA (THF) TTA CTC AAA GTA ACA 
A-Block
Tự thiết kế. Phát hiện các sản 
phẩm RPA bằng phản ứng lai
5 RPA.Falci-BIO
Biotin-CGC TTT AAT ACG CTT CCT CTA TTA 
TTA TGT TC
Tự thiết kế. Kết hợp với RPA.
PlasR tạo sản phẩm 246 bp
6 RPA.Vivax-DIG
Digoxigenin-GCA ACG CTT CTA GCT TAA TCC 
ACA TAA CTG ATA C 
Tự thiết kế. Kết hợp với RPA.
PlasR tạo sản phẩm 279 bp
7 Plas-R AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
Các mồi và mẫu dò sử dụng 
cho real-time PCR được 
tham khảo công trình của 
Rougemont và cộng sự (2004) ... ue giấy là rõ ràng và không có các tín hiệu ký sinh khác. Vì 
vậy, chúng tôi sẽ sử dụng phương pháp lai lateral flow strip thay 
cho điện di trên gel agarose cho quy trình phát hiện P. falciparum 
và P. vivax bằng kỹ thuật RPA.
Đánh giá quy trình duplex RPA trên các mẫu ADN nghi 
nhiễm P. falciparum và P. vivax
Chúng tôi thu nhận 33 mẫu ADN tách chiết từ các bệnh nhân 
nghi nhiễm ký sinh thuộc chi Plasmodium từ Viện Sốt rét - Ký sinh 
trùng - Côn trùng TP Hồ Chí Minh và thực hiện quy trình duplex 
RPA nhằm phát hiện P. falciparum và P. vivax trong các mẫu ADN 
này. Chúng tôi cũng thực hiện quy trình monoplex real-time PCR 
với các mẫu dò Taqman đặc hiệu cho P. falciparum và P. vivax 
nhằm so sánh với kết quả phát hiện bằng quy trình duplex RPA. 
Các mẫu dò Taqman probe cho các phản ứng monoplex real-time 
PCR được tham khảo từ công trình của Rougemont và cộng sự 
năm 2004. Kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax bằng cả hai 
quy trình được trình bày đại diện trong hình 8 và trình bày đầy đủ 
trong bảng 2.
Hình 6. Kết quả khảo sát thể tích phản ứng RPA. M: thang ADN 100 
bp; 1-5: thể tích phản ứng RPA lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50 µl.
Hình 7. Kết quả lai bằng kỹ thuật lateral flow strip trên các sản phẩm 
RPA. 1: phản ứng lai với sản phẩm RPA của P. falciparum; 2: phản ứng 
lai với sản phẩm RPA của P. vivax; 3: phản ứng lai với sản phẩm RPA 
của P. falciparum và P. vivax; 4: phản ứng lai với sản phẩm RPA từ mẫu 
chứng âm.
1260(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
Hình 8 cho thấy kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax 
trên 9 mẫu ADN nghi nhiễm ký sinh thuộc chi Plasmodium bằng 
quy trình duplex RPA và real-time PCR. Quy trình duplex RPA 
phát hiện P. falciparum ở cả 9 mẫu ADN và phát hiện P. vivax ở 
2 mẫu ADN (số 5 và số 8 trong hình 8). Kết quả phát hiện bằng 
real-time PCR khẳng định kết quả duplex RPA khi phát hiện cả 9 
mẫu ADN có nhiễm P. falciparum và 2 mẫu ADN (số 5 và số 8) 
nhiễm P. vivax. 
Bảng 2. Kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax bằng duplex RPA 
và real-time PCR.
Mẫu ADN Mẫu phát hiện bằng 
duplex RPA
Mẫu phát hiện bằng 
real-Real-time PCR
Nhiễm P. falciparum 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 
15, 16, 20, 21, 22
1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 
15, 16, 20, 21, 22
Nhiễm P. vivax 13 13
Nhiễm P. falciparum 
và P. vivax
5, 8, 11, 12, 14, 17, 
18, 19, 23, 24, 25, 26, 
27, 28, 29, 30, 31, 
32, 33
5, 8, 11, 12, 14, 17, 18, 
19, 23, 24, 25, 26, 27, 
28, 29, 30, 31, 32, 33
Mẫu âm tính
Bảng 2 cho thấy, kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax là 
trùng hợp giữa hai quy trình duplex RPA và real-time PCR.
Bàn luận
P. falciparum và P. vivax là hai ký sinh trùng gây bệnh sốt rét 
chủ yếu ở Việt Nam. Do đặc thù bệnh xuất hiện chủ yếu ở vùng 
rừng, đồi núi nên công tác chẩn đoán còn gặp nhiều khó khăn. Việc 
tìm kiếm một kỹ thuật sinh học phân tử không đòi hỏi nhiều về 
trang thiết bị là cần thiết cho chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét. Trong 
các kỹ thuật sinh học phân tử được phát triển gần đây, RPA là một 
kỹ thuật có khả năng ứng dụng cao trong chẩn đoán, có thể khuếch 
đại ở nhiệt độ phòng, chỉ trong 10 phút và đọc kết quả chỉ trong 5 
phút bằng lateral flow strip. Đây là một trong những phương pháp 
có khả năng ứng dụng rất tốt cho chẩn đoán, đặc biệt là chẩn đoán 
tại hiện trường. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm ứng dụng 
kỹ thuật RPA trong việc phát hiện P. falciparum và P. Vivax, phục 
vụ cho việc điều trị hiệu quả bệnh sốt rét ở Việt Nam. Đây cũng là 
công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng kỹ thuật RPA 
trong chẩn đoán. 
RPA là một kỹ thuật cho phép nhân bản ADN ở nhiệt độ thấp 
và đẳng nhiệt bằng cách sử dụng các enzyme trong hệ thống sửa 
sai và sao chép của tế bào sinh vật. Ở giai đoạn khởi động nhân 
bản ADN mục tiêu, các mồi sẽ được enzyme recombinase (RecA) 
gắn vào tạo thành sợi nucleoprotein. Sợi nucleoprotein này sẽ dò 
trên trình tự ADN mục tiêu để tìm kiếm cấu trúc tương đồng. Khi 
cấu trúc tương đồng được tìm thấy, sợi nucleoprotein này sẽ xâm 
lấn ADN mục tiêu mạch đôi và hình thành một cấu trúc D-loop. 
Đây là vị trí phân tách sợi ADN mạch đôi. Mạch bổ sung được 
tách ra sẽ được ổn định bởi protein SSB để giúp hạn chế việc mạch 
bổ sung tự bắt cặp lại với mạch mục tiêu. Trong khi đó, sau khi 
bắt cặp với mạch mục tiêu, các SSB protein rời khỏi trình tự mồi, 
điều này giúp cho enzyme polymerase gắn vào được phức hợp 
mồi - mạch mục tiêu và tiến hành tổng hợp mạch bổ sung. Kết 
quả là có hai phân tử ADN giống hệt phân tử ADN ban đầu được 
hình thành sau một chu kỳ hoạt động của RecA, protein SSB và 
enzyme polymerase. Hai phân tử ADN này tiếp tục làm cơ chất để 
hệ protein RecA, protein SSB và enzyme polymerase tổng hợp các 
phân tử ADN mới ở các chu kỳ kế tiếp [5, 6]. 
Các mồi cho phản ứng RPA như RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.
VivaxF được thiết kế dựa vào nguyên tắc của kỹ thuật RPA như có 
độ dài từ 20-35 nucleotide, %GC nằm trong khoảng 30-70%, các 
cấu trúc thứ cấp có năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mol, trình 
tự mồi đặc hiệu cho sinh vật mục tiêu [7, 8]. Lưu ý, mồi RPA.
Falci-BIO có trình tự nucleotide trùng hợp với mồi RPA.FalciF 
và tương tự cho mồi RPA.Vivax-DIG với mồi RPA.VivaxF. Điểm 
khác biệt giữa hai mồi RPA.FalciF và RPA.VivaxF với hai mồi 
RPA.Falci-BIO và RPA.Vivax-DIG là các gốc chức năng Biotin 
và Digixigenin, hai gốc chức năng này sẽ được sử dụng trong phản 
ứng lai lateral flow strip. Tương tự, mẫu dò RPA.Plas-FAM cũng 
được thiết kế đặc hiệu với P. falciparum và P. vivax và có các cấu 
trúc thứ cấp với năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mol. Các cấu 
trúc thứ cấp của một mồi hay mẫu dò có năng lượng tự do nhỏ 
hơn -9 kcal/mol sẽ không bền ở nhiệt độ phản ứng và vì thế không 
cản trở mồi hay mẫu dò bắt cặp vào ADN mục tiêu trong phản 
(A)
(B)
(C)
(B ) 
(C ) 
Hình 8 . K ết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax bằng quy trình duplex RPA và real -
time PCR. (A ) duplex RPA; (B ) real-time PCR v ới mồi và mẫu dò đặc hiệu P. falciparum ; (C ) 
real-time PCR v ới mồi và mẫu dò đặc hiệu P. vivax . 
B ảng 2. K ết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax bằng duplex RPA và real -time PCR . 
M ẫu ADN M ẫu phát hi ện bằng duplex 
RPA 
M ẫu phát hi ện bằ g real -
Real -time PCR 
Nhiễm P. falciparum 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 15, 16, 
20, 21, 22 
1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 15, 
16, 20, 21, 22 
Nhiễm P. vivax 13 13 
Nhiễm P. falciparum và P. vivax 5, 8, 11, 12, 14, 17, 18, 19, 
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 
31, 32, 33 
5, 8, 11, 12, 14, 17, 18, 19, 
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 
30, 31, 32, 33 
Mẫu âm tính 
B ảng 2 cho thấy, kết quả phát hiện P. falciparum và P. vivax là trùng hợp giữa hai quy trình 
duplex RPA và real -time PCR. 
Bàn lu ận 
P. falciparum và P. vivax là hai ký sinh trùng gây bệnh sốt rét chủ yếu ở Việt Nam. Do đặc 
thù bệnh xuất hiện chủ yếu ở vùng rừng, đồi núi nên công tác chẩn đoán còn gặp nhiều khó khăn. 
Vi ệc tìm kiếm một kỹ thuật sinh học phân tử không đòi hỏi nhiều về trang thiết bị là cần thiết 
cho chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét. Trong các kỹ thuật sinh học phân tử được phát triển gần đây, 
RPA là m ột kỹ thuật có khả năng ứng dụng cao trong chẩn đoán, có thể khuếch đại ở nhiệt độ 
phòng, chỉ trong 10 phút và đọc kết quả chỉ trong 5 phút bằng lateral ow strip. Đây là một trong 
những phương pháp có khả năng ứng dụng rất tốt cho chẩn đoán, đặc biệt là chẩn đoán tại hiện 
trường. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm ứng dụng kỹ thuật RPA trong vi ệc phát hiện P. 
falciparum và P. Vivax, phục vụ cho việc điều trị hiệu quả bệnh sốt rét ở Vi ệt Nam. Đây cũng là 
công trình nghiên cứu đầu tiên ở Vi ệt Nam ứng dụng kỹ thuật RPA trong chẩn đoán. 
RPA là m ột kỹ thuật cho phép nhân bản ADN ở nhiệt độ thấp và đẳng nhiệt bằng cách sử 
dụng các enzyme trong hệ thống sửa sai và sao chép của tế bào sinh vật. Ở giai đoạn khởi động 
nhân bản ADN mục tiêu, các mồi sẽ được enzyme recombinase (RecA ) gắn vào tạo thành sợi 
nucleoprotein. Sợi nucleoprotein này sẽ dò trên trình tự ADN mục tiêu để tìm kiếm cấu trúc 
Hình 8. Kết quả phát hiện . falciparum và P. vivax bằng quy trình 
duplex RPA và real-time PCR. (A) duplex RPA; (B) real-time PCR với mồi 
và mẫu dò đặc hiệu P. falciparum; (C) real-time PCR với mồi và mẫu dò 
đặc hiệu P. vivax.
1360(12) 12.2018
Khoa học Y - Dược
ứng nhân bản và phản ứng lai [9]. Khi khảo sát hoạt động thực 
tế trong phản ứng RPA với ADN tách chiết từ P. falciparum và P. 
vivax nuôi cấy, các mồi RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.VivaxF đã 
cho các sản phẩm nhân bản với kích thước dự kiến là 246 và 279 
bp. Kết quả giải trình tự nucleotide Sanger đã xác nhận các sản 
phẩm nhân bản từ các mồi RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.VivaxF 
có nguồn gốc từ P. falciparum và P. vivax. Ngoài ra, kết quả kiểm 
tra khả năng nhân bản chéo cũng cho thấy các mồi đã thiết kế 
là RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.VivaxF chỉ nhân bản chọn lọc P. 
falciparum và P. vivax. Vì vậy, các mồi đã thiết kế cho phản ứng 
RPA là hoàn toàn đặc hiệu cho P. falciparum và P. vivax và hoạt 
động tốt trong phản ứng RPA trên thực tế.
Để tiết kiệm chi phí hóa chất cũng như giảm thao tác, chúng tôi 
đã xây dựng và khảo sát một số điều kiện của quy trình duplex RPA 
phát hiện đồng thời P. falciparum và P. vivax. Kết quả cho thấy có 
khả năng phát hiện cùng lúc hai ký sinh thuộc chi Plasmodium 
bằng phản ứng RPA với 3 mồi RPA.PlasR, RPA.FalciF, RPA.
VivaxF. Phản ứng duplex RPA có khả năng diễn ra ở nhiệt độ từ 
25 đến 40oC và thể tích phản ứng RPA có thể giảm xuống còn 10 
µl. Các thông số này cho phép tiến hành phản ứng RPA ở những 
nơi thiết thốn trang thiết bị thí nghiệm. Ngoài ra, chúng tôi cũng 
khảo sát phản ứng lai với mẫu dò đặc hiệu dựa trên kỹ thuật lateral 
flow strip. Đây là bước quan trọng nhất của quy trình duplex RPA 
để được ứng dụng trong thực tế lâm sàng vì nó giảm được thao 
tác và thời gian phát hiện sản phẩm RPA mục tiêu so với kỹ thuật 
điện di trên gel agarose. Thời gian tiến hành phản ứng lai chỉ diễn 
ra trong khoảng 5 phút với thao tác nhúng que giấy vào dung dịch 
lai và xem kết quả trực tiếp bằng mắt thường. Để so sánh, kỹ thuật 
điện di trên gel agarose phát hiện các sản phẩm RPA cần hơn 120 
phút với các thao tác chuẩn bị bản gel, điện di sản phẩm trên bản 
gel, nhuộm và giải nhuộm bản gel, quan sát kết quả trên bàn đèn 
tử ngoại. Hơn nữa, phát hiện sản phẩm RPA bằng kỹ thuật lateral 
flow strip còn tăng tính chính xác vì sử dụng thêm một mẫu dò đặc 
hiệu trong phản ứng lai. Mẫu dò này chỉ bắt cặp với sản phẩm RPA 
mục tiêu và không bắt cặp với các sản phẩm RPA ký sinh có trong 
phản ứng RPA. Trên thực tế, thường có sự xuất hiện của các sản 
phẩm RPA ký sinh bên cạnh sản phẩm RPA mục tiêu khi điện di 
sản phẩm từ phản ứng RPA trên gel agarose mặc dù các điều kiện 
của phản ứng RPA như nồng độ mồi, thời gian phản ứng đã được 
khảo sát để tối ưu. Tuy nhiên, các sản phẩm ký sinh này đã được 
loại bỏ hoàn toàn trong phản ứng lai lateral flow strip với các mẫu 
dò đặc hiệu. Như vậy, với quá trình xây dựng và khảo sát đã đề cập 
ở trên thì quy trình duplex RPA trong nghiên cứu này có khả năng 
được sử dụng để phát hiện P. falciparum và P. vivax ở những điểm 
y tế thiếu thốn các trang bị.
Cuối cùng, quy trình duplex RPA vừa xây dựng được đánh giá 
trên các mẫu ADN được tách chiết từ máu của những bệnh nhân 
nghi nhiễm ký sinh trùng thuộc chi Plasmodium ở Việt Nam và 
được thực hiện song song quy trình monoplex real-time PCR với 
cùng các mồi PlasR, FalciF, VivaxF và các Taqman probe đặc hiệu 
cho P. falciparum và P. vivax được trích từ công trình nghiên cứu 
của Rougemont và cộng sự năm 2004 [10]. Kết quả phát hiện P. 
falciparum và P. vivax ở các mẫu ADN nghi nhiễm ký sinh trùng 
thuộc chi Plasmodium là trùng khớp giữa hai quy trình duplex 
RPA và monoplex real-time PCR. Với những kết quả thu nhận 
được thì nghiên cứu này là tiền đề tốt để tiếp tục phát triển quy 
trình duplex RPA thành bộ kit phát hiện nhanh P. falciparum và P. 
vivax phục vụ cho việc điều trị bệnh sốt rét trong thực tế lâm sàng.
Kết luận
Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình nhằm phát 
hiện P. falciparum và P. vivax dựa trên kỹ thuật duplex RPA và 
lateral flow strip. Các mồi và mẫu dò đã thiết kế trong phản ứng 
duplex RPA hoàn toàn đặc hiệu và nhân bản hiệu quả ADN của P. 
falciparum và P. vivax. Phản ứng duplex RPA có khả năng diễn ra 
ở dãy nhiệt độ từ 25-40oC và thể tích phản ứng có thể giảm xuống 
đến 10 µl. Các sản phẩm RPA từ P. falciparum và P. vivax được 
phát hiện bằng kỹ thuật lateral flow strip với mẫu dò đặc hiệu, điều 
này làm giảm thao tác và thời gian tiến hành cũng như nâng cao độ 
chính xác. Khi đánh giá quy trình duplex RPA trên 33 mẫu ADN 
nghi nhiễm ký sinh thuộc chi Plasmodium, quy trình duplex RPA 
đã cho kết quả tương đồng với quy trình monoplex real-time PCR. 
kết quả nghiên cứu này là tiền đề tốt để phát triển thành bộ kit phát 
hiện nhanh P. falciparum và P. vivax phục vụ cho việc điều trị bệnh 
sốt rét ở Việt Nam.
LỜI CẢM ƠN
Nhóm tác giả xin cảm ơn Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn 
trùng TP Hồ Chí Minh đã cung cấp các mẫu ADN tách chiết từ 
P. falciparum và P. vivax nuôi cấy và từ các mẫu máu bệnh nhân 
nghi nhiễm ký sinh thuộc chi Plasmodium. Chúng tôi cũng cảm 
ơn Công ty TBR đã tài trợ các hóa chất, vật liệu sử dụng trong 
nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] N. Tangpukdee, C. Duangdee, P. Wilairatana, S. Krudsood (2009), 
“Malaria diagnosis: a brief review”, The Korean Journal of Parasitology, 
47(2), pp.93-102.
[2] J.H. Kattenberg, A. Erhart, M.H. Truong, E. Rovira-Vallbona, K.A.D. 
Vu, T.H.N. Nguyen, V.H. Nguyen, V.V. Nguyen, M. Bannister-Tyrrell, M. 
Theisen, A. Bennet, A.A. Lover, T.D. Tran, X.X. Nguyen, A. Rosanas-Urgell 
(2018), “Characterization of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax 
recent exposure in an area of significantly decreased transmission intensity in 
Central Vietnam”, Malaria Journal, 17(1), DOI: 10.1186/s12936-018-2326-1.
[3] World Health Organization (2015), World Malaria Report 2014.
[4] 
[5] R.K. Daher, G. Stewart, M. Boissinot, M.G. Bergeron (2016), “PRA 
for diagnostic applications”, Clinical Chemistry, 62(7), pp.947-958.
[6] O. Piepenburg, C.H. Williams, D.L. Stemple, N.A. Armes (2006), 
“ADN detection using recombination proteins”, PLOS Biology, 4(7), p.e204, 
DOI:10.1371/journal.pbio.0040204.
[7]2https://www.twistdx.co.uk/docs/default-source/twistamp-manuals/
twistamp-assay-design-manual-v2-4.pdf?sfvrsn=10.
[8] https://www.twistdx.co.uk/en/rpa/using-pcr-primers.
[9]1https://www.idtADN.com/pages/support/faqs/how-do-i-use-the-
oligoanalyzer-tool-to-analyze-possible-hairpins-and-dimers-formed-by-my-oligo.
[10] M. Rougemont, M. Van Saanen, R. Sahli, H.P. Hinrikson, J. Bille, K. 
Jaton (2004), “Detection of four Plasmodium species in blood from humans 
by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays”, 
Journal of Clinical Microbiology, 42(12), pp.5636-5643.