Luận án Đặc tính sinh học phân tử chủng klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blakpc phân lập tại một số bệnh viện trên địa bàn hà nội

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGUYỄN HOÀI THU 
ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG 
KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG 
CARBAPENEM MANG GEN BLAKPC PHÂN LẬP 
TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
HÀ NỘI - 2018 
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGUYỄN HOÀI THU 
ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG 
KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG 
CARBAPENEM MANG GEN BLAKPC PHÂN LẬP 
TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI 
Chuyên ngành: Vi sinh vật học 
Mã số: 62 42 01 07 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bình Minh 
 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 
2. PGS.TS. Đinh Duy Kháng 
Viện Công nghệ sinh học 
HÀ NỘI - 2017 
Hà Nội, 2011 
Lời cảm ơn 
 Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất rất nhiều sự giúp đỡ, 
tạo điều kiện của các thầy cô giáo, tập thể các nhà khoa học của Viện Vệ sinh Dịch 
tễ Trung ương và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công 
nghệ Việt Nam. 
 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Bình Minh và 
PGS. TS. Đinh Duy Kháng, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo 
cho tôi hoàn thành luận án này. 
 Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Trần Huy Hoàng, người luôn 
theo sát, hướng dẫn, nhắc nhở và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. 
 Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, lãnh 
đạo khoa Vi khuẩn, đồng nghiệp tại phòng thí nghiệm Kháng sinh, phòng thí 
nghiệm Vi khuẩn đường ruột và phòng Quản lý chất lượng Viện Vệ sinh Dịch tễ 
Trung ương đã luôn tạo điều kiện, đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá 
trình thực hiện luận án. 
 Tôi cũng xin được bày tỏ sự biết ơn chân thành tới lãnh đạo Viện Công 
nghệ sinh học, PGS. TS. Đồng Văn Quyền và các anh chị tại phòng thí nghiệm Vi 
sinh phân tử, ThS. Bùi Thị Hải Hà phòng Quản lý tổng hợp, Viện Công nghệ sinh 
học đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. 
 Cuối cùng nhưng đặc biệt quan trọng, tôi xin dành tất cả sự yêu thương và 
lời cảm ơn tới gia đình, nơi luôn là hậu phương vững chắc và niềm động viên 
mạnh mẽ giúp tôi hoàn thành luận án. 
 Nguyễn Hoài Thu 
Lời cam đoan 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các 
cộng sự khác; 
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được 
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các 
đồng tác giả; 
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. 
Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2018 
Tác giả 
Nguyễn Hoài Thu 
MỤC LỤC 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 
1.1. Klebsiella pneumoniae gây bệnh trên người .................................................. 3 
1.1.1. Đặc điểm sinh học .......................................................................................... 3 
1.1.2. Vai trò gây bệnh ............................................................................................. 4 
1.2. Kháng sinh carbapenem ................................................................................. 6 
1.2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh ..................................................................... 6 
1.2.2. Kháng sinh carbapenem ................................................................................. 7 
1.3. Klebsiella pneumoniae kháng kháng sinh qua cơ chế sinh KPC ................... 9 
1.3.1. Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn ....................................................... 9 
1.3.2. Đặc tính kháng carbapenem ......................................................................... 11 
1.3.3. Đặc điểm dịch tễ học của Klebsiella pneumoniae sinh KPC ....................... 17 
1.3.4. Đặc tính phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC ............. 23 
1.4. Các con đường lan truyền gen kháng kháng sinh blaKPC ............................. 27 
1.4.1. Các yếu tố tiếp hợp (plasmid) ...................................................................... 27 
1.4.2. Các yếu tố tiếp hợp (hòa nhập) .................................................................... 29 
1.5. Kiểm soát nhiễm khuẩn do Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh..... 30 
1.6. Các kỹ thuật nghiên cứu đặc tính vi khuẩn kháng carbapenem mang gen 
blaKPC............................................................................................................ 31 
1.6.1. Các thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh .............................. 31 
1.6.2. Kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu gen kháng kháng sinh ..................... 33 
1.6.3. Kỹ thuật dịch tễ học phân tử ........................................................................ 35 
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 40 
2.1. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 40 
2.2. Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu ................................................................. 40 
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 40 
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ...................................................................................... 41 
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 41 
2.3.1. Quy trình nghiên cứu ................................................................................... 41 
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ................................................................... 42 
2.3.3. Thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh .................................... 42 
2.3.4. PCR phát hiện gen blaKPC kháng carbapenem ............................................ 43 
2.3.5. Giải trình tự gen kháng kháng sinh .............................................................. 44 
2.3.6. PCR phát hiện gen ESBL ............................................................................. 45 
2.3.7. Phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh ........................................... 46 
2.3.8. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC.............................. 46 
2.3.9. Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng Klebsiella pneumoniae 
bằng kỹ thuật PFGE .................................................................................... 47 
2.3.10. Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng Klebsiella pneumoniae 
bằng kỹ thuật MLST ................................................................................... 48 
2.4. Phương pháp phân tích kết quả .................................................................... 49 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 50 
3.1. Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng 
Klebsiella pneumoniae ................................................................................. 50 
3.1.1. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem .................................. 50 
3.1.2. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ...... 52 
3.1.3. Kết quả giải trình tự gen blaKPC ................................................................... 54 
3.1.4. Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng 
carbapnem mang gen blaKPC ........................................................................ 55 
3.1.4.1. Thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh ........................................................... 55 
3.1.4.2. Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu .......................................................... 57 
3.1.5. Phát hiện vi khuẩn mang gen ESBL trên các chủng Klebsiella 
pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ....................................... 62 
3.1.6. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm khuẩn do Klebsiella pneumoniae 
kháng carbapenem mang gen blaKPC ............................................................ 65 
3.2. Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh giữa các chủng 
Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ...................... 68 
3.2.1. Phát hiện plasmid mang gen blaKPC ............................................................ 68 
3.2.2. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC.............................. 70 
3.3. Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng Klebsiella 
pneumoniae mang gen blaKPC ...................................................................... 72 
3.3.1. Kết quả PFGE .............................................................................................. 72 
3.3.2. Kết quả MLST ............................................................................................. 76 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ................................................................... 80 
4.1. Đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng Klebsiella 
pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội ........................ 80 
4.1.1. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ...... 80 
4.1.2. Kết quả giải trình tự gen blaKPC ................................................................... 83 
4.1.3. Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng 
carbapnem mang gen blaKPC ........................................................................ 83 
4.1.4. Phát hiện vi khuẩn mang gen ESBL trên các chủng Klebsiella 
pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ....................................... 87 
4.2. Khả năng lan truyền gen kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella 
pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC ....................................... 89 
4.2.1. Phát hiện plasmid mang gen blaKPC ............................................................. 89 
4.2.2. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC.............................. 90 
4.3. Đặc tính dịch tễ học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng 
carbapnem mang gen blaKPC ........................................................................ 93 
4.3.1. Khảo sát mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng bằng kỹ thuật PFGE ........... 93 
4.3.2. Khảo sát mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng bằng kỹ thuật MLST .......... 96 
4.4. Bàn luận về hướng nghiên cứu tiếp theo ..................................................... 97 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 100 
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 103 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 112 
PHẦN PHỤ LỤC ....................................................................................................... 1 
PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN TRONG NGHIÊN CỨU ...................... 1 
PHỤ LỤC 2. QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT ......................... 4 
PHỤ LỤC 3. HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA GEN BLAKPC ....................... 11 
PHỤ LỤC 4. HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN GIỮ NHÀ ............. 13 
PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ PFGE................................................................................. 17 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Ký hiệu Chú thích 
ADN Axit deoxyribonucleic 
ADH Arginine Dihydrolase 
AM Ampicillin 
AMC Amoxicillin + clavunalate 
AMY amygdalin 
ATCC 
American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng chuẩn 
Mỹ) 
ATM Aztreonam 
ARA Arabinose 
bp Base pair (đơn vị đo trọng lượng của ADN) 
CAZ Ceftazidime 
CDC 
Centre for Disease for Control and Prevention (Trung tâm kiểm 
soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ) 
CEF Cefixime 
CF Cephalothin 
CIP Ciprofloxacin 
CLSI 
Clinical laboratory standards institute (Viện chuẩn thức Lâm 
sàng và phòng xét nghiệm Mỹ) 
CRKP 
Carbapenem resistant K. pneumoniae (K. pneumoniae kháng 
carbapenem) 
CRO Ceftriaxone 
CTX Cefotaxim 
CTX Cefotaxime 
CTX-M Cefotaximase 
CXM Cefuroxim 
CIT Citrate utilization 
DCA deoxycholate citrate agar 
ESBL Extended-spectrum beta lactamase 
FEP Cefepime 
gapA Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 
GEL Gelatinase 
GM Gentamicin 
GLU Glucose 
ICE Intergrative conjugative element (Yếu tố tiếp hợp hòa nhập) 
IND Indole 
INO Inosito 
infB translation initiation factor 2 
IPM Imipenem 
KPC 
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (Enzym kháng 
carbapenem phát hiện trên các chủng Klebsiella pneumoniae) 
LB Luria-Bertani 
LDC Lysine Decarboxylase 
MAN Mannito 
MBLs Metallo-beta-lactamase 
mdh malate dehydrogenase 
MEL Melibiose 
MEM Meropenem 
MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) 
MLST Multilocus sequence type (định typ dựa trên trình tự đa locus) 
NCBI 
National Center for Biotechnology Information (Trung tâm 
thông tin công nghệ sinh học quốc gia Mỹ) 
NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase-1 
NGS Next generation sequencing 
ODC Ornithine Decarboxylase 
ONPG Ortho Nitrophenyl-ßD-galactopyranosidase 
OXA Oxacillinase 
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 
PFGE Pulse field gel electrophoresis (Điện di trường xung) 
pgi phosphoglucose isomerase 
phoE phosphorine E 
RHA Rhamnose 
rpoB beta subunit of RNA polymerase 
SAC Saccharose 
SHV Sulfhydryl variable 
SMA Sodium mercapto acetic acid 
SME Serratia marcescens enzyme 
SOR Sorbitol 
SS Salmonella Shigella agar 
ST Sequence type (Kiểu trình tự) 
SXT Trimethoprim sulphamethoxazole 
TDA Tryptophane Deaminase 
TEM A Temoneira (tên một nhà khoa học người Hy Lạp) 
ton B periplasmic energy transducer 
URE Urease 
VIM Verona integron-encoded metallo-β-lactamase 
VP Voges Proskauer 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Kháng sinh carbapenem và phổ tác dụng............................................ 8 
Bảng 1.2. Phân loại, các biến thể của carbapenemase....................................... 13 
Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của K. pneumoniae trên bộ API-20E ........... 42 
Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu phát hiện các gen mã hóa -lactamase .......... 45 
Bảng 2.3. Các cặp mồi dùng cho phân tích MLST ........................................... 48 
Bảng 3.1. Phân bố chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem .................. 51 
Bảng 3.2. Phân bố chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen 
blaKPC ................................................................................................. 54 
Bảng 3.3.A. Kết quả thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh của K. pneumoniae 
kháng carbapenem mang gen blaKPC tại bệnh viện Xanh pôn và 
Thanh Nhàn ....................................................................................... 56 
Bảng 3.3.B. Kết quả thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh của K. pneumoniae 
kháng carbapenem mang gen blaKPC tại bệnh viện Việt Đức ........... 57 
 ... ev 57(10): 1451-1470. 
175. Yang, J. Y., L. Guo, L. Zhao, Q. Chen, R. Luo, Y. Chen, Y. Tian, S. Zhao, J. Shen, 
D. Han, L. (2013). A nosocomial outbreak of KPC-2-producing Klebsiella 
pneumoniae in a Chinese hospital: dissemination of ST11 and emergence of ST37, 
ST392 and ST395. Clin Microbiol Infect 19(11): E509-515. 
176. Yigit H, Q. A., Anderson GJ, et al. (2008). Author’s correction- Novel carbapenem-
hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenemresistant strain of Klebsiella 
pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 52(2). 
177. Yigit, H., A. M. Queenan, G. J. Anderson, A. Domenech-Sanchez, J. W. Biddle, C. 
D. Steward, S. Alberti, K. Bush and F. C. Tenover (2001). Novel carbapenem-
hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella 
pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 45(4): 1151-1161. 
178. Ying-Tsong Chen, J.-C. L., Chang-Phone Fung, Po-Liang Lu, Yin-Ching Chuang, 
Tsu-LanWu and a. L. K. Siu (2014). KPC-2-encoding plasmids from Escherichia 
coli and Klebsiella pneumoniae in Taiwan. J Antimicrob Chemother 69: 628-631. 
179. Yong, D., M. A. Toleman, C. G. Giske, H. S. Cho, K. Sundman, K. Lee and T. R. 
Walsh (2009). Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), 
130 
and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in 
Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother 
53(12): 5046-5054. 
180. Yoo, J. S., Kim, H. M., Yoo, J. I., Yang, J. W., Kim, H. S., Chung, G. T., et al. (2013). 
Detection of clonal KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae ST258 in Korea during 
nationwide surveillance in 2011. J. Med. Microbiol. 62: 1338-1342. 
181. Zagorianou A, S. E., Iosifidis E, et al. (2012). Microbiological and molecular 
characteristics of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae endemic in a 
tertiary Greek hospital during 2004-2010. Euro Surveill. 17(7): pii:20088. 
182. Zhanel, G. G., R. Wiebe, L. Dilay, K. Thomson, E. Rubinstein, D. J. Hoban, A. M. 
Noreddin and J. A. Karlowsky (2007). Comparative review of the carbapenems. 
Drugs 67(7): 1027-1052. 
 1 
PHẦN PHỤ LỤC 
PHỤ LỤC 1 
DANH SÁCH BỆNH NHÂN TRONG NGHIÊN CỨU 
STT 
Mã bệnh 
nhân 
Tuổi Giới tính Bệnh viện Khoa Loại mẫu Năm 
1 13 60 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
2 25 75 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Đờm khí quản 2010 
3 26 78 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
4 27 73 Nữ Thanh Nhàn Hồi sức Đờm khí quản 2010 
5 32 65 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
6 33 63 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
7 64 65 Nam Xanh pôn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
8 66 71 Nam Xanh pôn Hồi sức Dịch phế quản 2010 
9 67 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2010 
10 84 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2010 
11 124 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2010 
12 151 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
13 152 76 Nam Xanh pôn Hồi sức Dịch phế quản 2011 
14 263 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2011 
15 265 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
16 273 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
17 274 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
18 278 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
19 294 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
20 297 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
21 298 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
22 322 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
23 326 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
24 328 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
25 348 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
26 365 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
27 389 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
28 408 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
29 410 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2011 
30 437 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
 2 
31 447 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
32 451 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2011 
33 452 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2011 
34 454 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
35 455 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
36 457 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
37 529 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2011 
38 580 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2011 
39 676 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
40 681 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2012 
41 683 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2012 
42 686 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
43 724 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2012 
44 725 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
45 729 9 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
46 732 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
47 847 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
48 869 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2012 
49 914 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
50 980 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
51 1040 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
52 1045 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
53 1048 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2012 
54 1070 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2012 
55 1075 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
56 1117 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
57 1133 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
58 1136 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
59 1152 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
60 1202 1 Nam Thanh Nhàn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
61 1203 1 Nữ Thanh Nhàn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
62 1279 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
63 1280 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
64 1281 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
65 1282 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
66 1338 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
67 1340 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
68 1342 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
 3 
69 1401 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Máu 2013 
70 1407 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
71 1408 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2013 
72 1503 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2014 
73 1508 1 Nữ Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2014 
74 1512 1 Nam Xanh pôn Hồi sức Nhi Dịch phế quản 2014 
75 1555 56 Nam Việt Đức Hồi sức Dịch ổ bụng 2014 
 4 
PHỤ LỤC 2 
QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT 
Ngày 1: 
KỸ THUẬT PFGE: 
1. Cấy các chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-Hinton (Bio-
rad) có chứa 2µg/ml imipenem. Ủ 37oC trong 24 giờ 
2. Lấy 4-5 khuẩn lạc trên đĩa thạch Muller-Hinton trộn đều vào 200 µl dung dịch 
đệm TE 
3. Nhỏ 200 µl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn đều 
4. Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi cho đến khi thạch đông 
5. Chuyển các plug sang các tube 2 ml có chứa 2ml dung dịch lysis buffer 
(1mg/ml protein K, 1% N-Lauroryl sarcosin trong 0.5M EDTA pH 8.0) 
6. Ủ qua đêm các tube ở 550C trong bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng 
SOUTHERN BLOT: 
1. Đánh dấu đoạn dò gen blaKPC 
- Khuếch đại gen blaKPC bằng phản ứng PCR (Applied Biosystem) (tương tự 
mục 2.2.4) 
- Tinh sạch sản phẩm PCR blaKPC bằng kit tinh sạch QIAGEN 
- Biến tính 100 ng sản phẩm PCR (10µl) bằng cách đun sôi trong bể ủ nhiệt 
5 phút. Làm lạnh ADN bằng cách cho vào hộp đá bào trong 5 phút 
- Nhỏ 10µl dung dịch hóa chất đánh dấu ADN (ECLTM Amersham) 
- Nhỏ 10µl dung dịch glutaraldehyde, lắc đều và tập trung hỗn dịch bằng cách 
ly tâm nhẹ. Ủ 20 phút ở 37oC 
- Sản phẩm blaKPC sau khi đánh dấu nếu không sử dụng ngay có thể được giữ 
ở trong 30% glycerol ở (-15) đến (-30)oC trong 6 tháng 
 5 
2. Thực hiện kỹ thuật S1-PFGE 
• Cấy các chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-Hinton có 
chứa 2µg/ml imipenem. Ủ 37oC trong 24 giờ 
• Lấy 1 khuẩn lạc trên đĩa thạch Muller-Hinton cấy vào 5ml môi trường canh 
thang LB ủ qua đêm có chứa 1µg IMP/ml 
• Lấy 50µl dịch nuôi cấy qua đêm cho vào 5ml canh thang LB lắc 37oC trong 
trong 4 giờ 
• Ly tâm 2100 vòng/10 phút loại dịch nổi 
• Rửa cặn tế bào bằng 1 ml dung dịch TE 
• Hoàn nguyên cặn tế bào vi khuẩn trong 500 µl dung dịch đệm TE 
• Nhỏ 500µl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn đều 
• Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi cho đến khi thạch đông 
• Chuyển các plug sang các tube 2ml có chứa 2ml dụng dịch lysis buffer 
(1mg/ml protein K, 1% N-lauroylsarcosin trong 0.5M EDTA pH 8.0) 
• Ủ qua đêm các tube ở 55oC trong bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng 
Ngày 2: 
1. Cắt miếng thạch có chiều dày khoảng 2 mm từ các miếng plug 
2. Cho các miếng thạch đã cắt vào 2 ml microtube 
3. Rửa các miếng thạch bằng 1ml nước siêu sạch (đã được ủ ấm ở 55oC) trong 
10-15 phút x 2 lần 
4. Rửa các miếng thạch bằng 1ml dung dịch TE (đã được ủ ấm ở 55oC) trong 10-
15 phút x 4 lần 
5. Rửa các miếng thạch bằng 200 µl dung dich đệm emzyme S1, ủ ấm ở 37oC 
trong 10-15 phút 
Thành phần µl/Plug Slide 12 Plug slide 
H2O 180 2160 
 6 
10X S1 buffer 20 240 
Total Volume 200 2400 
6. Rửa các miếng thạch chủng S. braenderup bằng 200 µl dung dich đệm 
emzyme XbaI, ủ ấm ở 370C trong 10-15 phút 
Thành phần µl/Plug Slide 2 Plug slide 
H2O 180 360 
10X XbaI buffer 20 40 
Total Volume 200 400 
7. Loại bỏ dung dịch đệm của enzyme S1 và XbaI bằng pipet 
8. Cắt loại bỏ ADN nhiễm sắc thể của vi khuẩn bằng enzyme S1 nồng độ 20 
UI/200 µl dung dịch đệm emzyme S1, ủ ở 37oC trong vòng 1-2 giờ 
Thành phần µl/Plug Slide 12 Plug slide 
H2O 177 2124 
10X Buffer 20 240 
BSA 10mg/ml 2 24 
S1 Enzyme (Promega) 1 12 
Total Volume 200 2400 
9. Loại bỏ hỗn dịch enzyme và rửa các miếng plug 2 lần sau khi cắt trong dung 
dịch TE 1X lạnh (trong vòng 20-30 phút) 
10. Chủng S. braenderup rửa bằng đệm và cắt bằng enzyme XbaI, 40UI/phản ứng 
cắt ở 37oC trong 6-8 giờ 
 7 
Thành phần µl/Plug Slide 2 Plug slide 
H2O 172 344 
10X Buffer 20 40 
BSA 10mg/ml 2 4 
XbaI Enzyme (10U/µl) 6 12 
Total Volume 200 400 
11. Chuẩn bị thạch điện di 1%: Cân 0.5 g thạch Seakem gold cho vào 50ml dung 
dịch đệm TBE 0,5X trong chai có nắp xoáy, đun sôi bằng microwave cho thạch 
tan hoàn toàn. Giữ chai thạch trong water-bath ở nhiệt độ 55-60oC 
12. Rửa các miếng thạch sau khi cắt enzyme 
13. Loại bỏ toàn bộ hỗn hợp cắt enzyme bằng pipeting: Rửa các miếng thạch bằng 
dung dịch TE đã được làm lạnh trong 30 phút X 2 lần hoặc ngâm các miếng 
thạch trong 200 µl TBE 0,5X 
14. Đặt các miếng thạch vào đầu răng lược theo các bước như sau 
15. Đặt miếng thạch S. braenderup vào các đậu răng lược ở vị trí 1, 5, 10 và 15. 
16. đặt các các thạch của các mẫu thí nghiệm vào các vị trí răng lược còn lại 
17. Thấm dung dịch đệm thừa bằng giấy thấm. Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 
trong 5 phút 
18. Đặt lược vào khuôn đổ thạch 
19. Đổ thạch vào khuôn và đợi cho đến khi thạch đông 
20. Làm lạnh hệ thống điện di (14oC), bật nguồn điện và hệ thống bơm (đặt ở chế 
độ 70 để chạy ở tốc độ 1 lít/1 phút) 
21. Tháo lược sau khi thạch đông hoàn toàn (khoảng 30-40 phút sau khi đổ thạch 
22. Sử dụng thạch Seakem gold 1% chưa đông ở 55-60oC để lấp kín các lỗ lược 
23. Sản phẩm cắt ADN sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad 
laboratories, Richmond, Calif) trên thạch horizontal 1%, ở hiệu điện thế 6V/cm 
 8 
trong 19 giờ ở nhiệt độ 14oC, thời gian một xung từ 25 đến 60s và và góc điện 
trường là 120o. 
Ngày 3: 
1. Sau khi điện di nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 30 phút 
2. Rửa thạch điện di bằng nước trong 60-90 phút, thay nước rửa 20 phút/ lần. 
3. Chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh Gel-doc 
Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham 
Hóa chất: 
- Dung dịch depurination: HCL 0,25 M 
- Dung dịch 
- Biến tính: 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH 
- Dung dịch trung hòa:1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 
- Dung dịch SSC 20x 
Tiến hành: 
1. Rửa gel trong 250 ml dung dịch HCL 0,25 M trong 30 phút (depurination 
solution) 
2. Rửa gel trong 250 ml dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) 
3. Rửa gel trong 300 ml dung dịch trung hòa (1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 
7.5) 
4. Nhúng ướt miếng đệm (porous) của hộp chuyển màng vào trong H2O và sau 
đó đặt trở lại hộp chuyển màng 
5. Cắt miếng giấy lọc và màng lai bằng kích thước của miếng thạch điện di PFGE 
6. Cắt khung plastic có kích thước ngắn hơn miếng thạch khoảng 3-10mm ở tất 
cả các hướng. Đặt khung plastic lên miếng đệm (porous) để tạo ra vị trí để đặt 
giấy lọc, màng lai và miếng thạch PFGE 
7. Nhúng ướt miếng giấy lọc số 1 trong H2O vô trùng và đặt lên trên khung plastic 
sau đó nhấc khung plastic ra 
 9 
8. Đặt màng lai (màng lai Hybond-N, Amersham) sau khi đã được nhúng ướt 
với H2O vô trùng lên trên miếng giấy lọc số 2 sau đó đặt lên trên miếng giấy 
lọc số 1 (loại bỏ bọt khí). 
9. Đặt trở lại khung plastic lên trên miếng giấy lọc và màng lai 
10. Đặt miếng thạch lên trên khung plastic (loại bỏ bọt khí) 
11. Sử dung thạch Seakem gold 1% pha trong TBE 1X để hàn xung quanh miếng 
thạch và đổ lên trên khung plastic để hàn kín các chỗ dò rỉ 
12. Phủ miếng thạch PFGE bằng dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 
300 mM NaCitrate, pH 7.0). 
13. Đặt ấp lực hút chân không ở 50 mbar và hút chân không trong vòng 90 phút. 
14. Tắt bơm hút chân không loại bỏ miếng thạch PFGE 
15. Lấy màng lai ra khỏi hộp chuyển màng và rửa bằng dung dịch chuyển màng 
SSC 20X trong 10 phút và sau đó làm khô trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng 
thí nghiệm. 
16. Màng lai sau đó sẽ được xử lý bằng tia cực tím (UV-cross linking) ở cường độ 
150 mJ trong 5 phút. (nếu chưa sử dụng ngay mang lai sẽ được rửa trong H2O 
và làm khô trong không khí sau đó được gói trong giấy bạc và giữ ở 4oC. 
17. Hiệu xuất chuyển màng có thể được đánh giá bằng cách nhuộm lại miếng thạch 
PFGE và chụp lại ảnh bằng máy chụp Gel-Doc. 
Ngày 4: Kỹ thuật Southern blot 
Hóa chất: 
• Dung dịch tiền lai (prehybridization): 100ml 
- Hóa chất phủ màng blocking reagent (5%w/v) 
- NaCl (Nồng độ cuối cùng 0.5 M) 
- Hybridization buffer 
• Dung dịch lai (hybridization): Nhỏ 60 μl Sản phẩm PCR blaKPC đã được đánh 
dấu bằng kít ECL vào 20 ml dung dịch tiền lai (pre-hybridization) 
• Dung dịch rửa màng: 
 10 
- Dung dịch rửa 1 không có Urea (primary buffer): 
 SDS 4 g 
 20 x SSC 25 ml 
 Cho thêm nước vào cho đủ 1000 ml , giữ ở 2-80C sử dụng trong 3 tháng. 
- Dung dịch rửa màng 2: 2x SSC (100 ml 20x SSC trong 900 ml H2O) 
Hiện màng (sử dụng Kit ECl) 
- Trộn dung dịch A và dung dịch B với tỷ lệ 40:1 
- Nhỏ dung dịch lên màng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 
- Sử dụng Hyper film để phát hiện 
7. Phân tích kết quả: 
Sử dụng ảnh chụp gen các plasmid trước khi và ảnh plasmid sau khi lai để 
phát hiện số lượng và kích thước các plasmid mang gen blaKPC. 
 11 
PHỤ LỤC 3 
KẾT QUẢ HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA GEN BLAKPC 
847/XP/2012 
1202/TN/2013 
 12 
1555/VĐ/2014 
 13 
PHỤ LỤC 4 
KẾT QUẢ HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN GIỮ NHÀ 
Trình tự gen gapA 
Trình tự gen infB 
 14 
Trình tự gen gen mdh 
Trình tự gen pgi 
 15 
Trình tự gen phoE 
Trình tự gen rpoB 
 16 
Trình tự gen tonB 
 17 
PHỤ LỤC 5 
KẾT QUẢ PFGE 
 18