Luận án Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ / dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học

1 
MỞ ĐẦU 
Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ 
chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi 
vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt 
cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang 
được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu 
về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 
con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với 
sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và 
phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi 
chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện 
không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo. 
Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3 
đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà 
Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa 
đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả 
xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều 
kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển 
hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc 
biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp 
loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như 
thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản 
với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành. 
Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố 
có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong 
các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã 
được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF 
thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt, 
2 
nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là 
Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá 
Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được 
tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều 
kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả 
năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK 
hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Để 
tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử 
lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề 
tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt 
cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”. 
Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây: 
Mục đích nghiên cứu 
 Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu 
làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử. 
 Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và 
chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK 
KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa. 
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã 
VK KK hô hấp loại khử clo. 
Nội dung nghiên cứu 
 Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử 
lý bằng phương pháp nested-PCR. 
 Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm 
chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE. 
 Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử 
lý 3.384 m
3
 tại Biên Hòa. 
3 
 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại 
diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam. 
 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp 
chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF. 
 Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK 
cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa 
chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử 
độc tại Biên Hòa sau 36 tháng. 
Phƣơng pháp nghiên cứu 
1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử 
dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô 
nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu. 
2. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí 
nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh 
trưởng của các VK này. 
3. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và 
GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần 
của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy 
sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất 
của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa. 
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 
1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại 
khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các VK 
KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại 
khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo 
không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, 
Anaeromyxobacter v.v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, 
Clostridium, Shewanella v.v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả. 
4 
2. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất 
ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được 
hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân 
PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là 
2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5-
TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch. 
3. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng 
quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt 
cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên 
đất ô nhiễm ở mục (2). 
5 
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 
1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo 
1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo 
Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá 
trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim 
loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v.v., trong nông nghiệp và cả trong chiến 
tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy 
không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt 
động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006). Thời gian bán hủy 
của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng 
năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và 
Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa 
clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy 
dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa. 
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa 
học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng 
thơm và đa vòng thơm (Hình 1.1) (Tas, 2009). 
(i) Các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường được sử dụng làm dung môi 
hữu cơ như tetrachloroethene (PCE), trichloroethene (TCE), chloroform và chúng 
được thải ra môi trường nhiều nhất (Hiraishi, 2003; Cheng, 2009). 
(ii) Các chất hữu cơ vòng thơm chứa clo như hexachlorobenzene, chlorobenzene, 
chlorophenol (CP) v.v. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất 
thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009). 
(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc 
2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có 
độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các 
chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian 
6 
của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin 
(PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau. 
Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt 
Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5-
trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác. 
cis-1,3-
dichloropropene 
Tetrachloroethene 
(PCE) 
Trichloroethene 
(TCE) 
-hexachlorocyclohexane 
(HCH) 
2,4,5-T 2,4-D 2,4-dichlorophenol 
(2,4-DCP) 
1,2,4,5-
tetrachlorobenzen 
PCDD PCDF 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-
dioxin (2,3,7,8-TCDD) 
Hình 1.1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình 
2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở 
dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình 
tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự 
phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật. 2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5-
trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong 
nông nghiệp và lâm nghiệp. 
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá 
trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc 
tương đương là 1 (Schecter, 2006). Dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated 
biphenyl (PCB) là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 đồng phân trong đó có 29 
chất đặc biệt nguy hiểm (Schecter, 2006; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). PCB được sản 
7 
xuất rất nhiều trong những năm 1930-1970 ở phía Bắc Bán cầu và được sử dụng trong 
máy biến áp, chất lỏng thủy lực, chất dẻo và trong một số ngành công nghiệp khác 
(Angelo, 2010). 
Nhìn chung, các hợp chất hữu cơ chứa clo thường kỵ nước (do hệ số octan – 
nước cao) nên chúng bị lắng đọng trong bùn và trầm tích. Đây là các hợp chất độc, 
tồn tại lâu dài trong môi trường, tích lũy trong các chuỗi thức ăn và gây bệnh cho 
người và động vật (Smidt, 2000; Schecter, 2006; Tas, 2009; Wagner, 2009). 
1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường 
Các hợp chất hữu cơ chứa clo đều là các chất có độ độc cao không những đối 
với người, động thực vật mà còn với cả VSV. Hầu hết các chất hữu cơ chứa clo có 
thể gây ung thư cho người. Tuy nhiên, các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường 
ít độc hơn và thời gian bán hủy ngắn hơn so với các hợp chất vòng thơm chứa clo. 
Các hợp chất PCDD, PCDF và PCB là những chất hữu cơ bền vững, độc hại và khó 
phân hủy (POP) trong môi trường tự nhiên. Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao 
nhất là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (PeCDD) với tổng 
độ độc tương đương là 1. Các chất có độ độc thấp hơn như hexachlorodibenzo-p-
dioxin (HxCDD), tetrachlorodibenzo-p-furan (TCDF), PCB. Các chất có độ độc 
thấp nhất là octachlorodibenzo-p-dioxin (OCDD), octachlorodibenzo-p-furan 
(OCDF), trichlorobenzene (TrCB) với tổng độ độc tương đương là 0,0001. 
Ở Việt Nam, độ tồn lưu của các chất là thành phần của chất diệt cỏ tại các căn 
cứ quân sự cũ của Mỹ vẫn ở mức cao. Trong đó, 2,3,7,8-TCDD có thể chiếm tới 
99% tổng độ độc ở tại hai sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa (Hatfield, 2011). 
EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người. 
Không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không 
gây ung thư (Van den Berg, 2006). Ở hàm lượng cao, dioxin có thể gây chết người. 
Khi ở nồng độ thấp, dioxin gây ra các đột biến và di truyền qua nhiều thế hệ khác 
nhau. Dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám 
da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh 
dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ) 
8 
v.v. Theo WHO 2002, mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người 
là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ/ngày) (Van den Berg, 2006). Theo Angelo và đtg, 
PCB có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh 
và hệ sinh sản (Angelo, 2010). 
Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (TN-MT), ngưỡng dioxin cho phép trong 
vùng đất và trầm tích bị ô nhiễm nặng dioxin tương ứng là 1.000 và 150 ng TEQ/kg 
đất. Cao hơn mức độ này, khu vực đó cần được khoanh vùng, xử lý và hạn chế hay 
ngừng hoàn toàn việc tiếp xúc của người, động vật cũng như các hoạt động canh tác 
nông nghiệp, thủy sản (QCVN2012/BTNMT). 
Tóm lại, các hợp chất hữu cơ chứa clo mà đặc biệt là các hợp chất đa vòng thơm 
có thể gây các bệnh về da, nội tiết, thần kinh, tim mạch, tiêu hóa cho con người. 
Chúng có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau qua sinh sản, thậm chí gây tử vong và là 
nguyên nhân gây một số bệnh ung thư. Trong môi trường, chúng tồn tại bền vững qua 
nhiều năm, gây ô nhiễm đất, nước ngầm, trầm tích, được tích lũy qua các mắt xích 
của chuỗi thức ăn vào các động thực vật khác và cuối cùng là vào con người. 
1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo 
1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới 
Trên thế giới đã có nhiều biện pháp để kiểm soát tốc độ thải ra môi trường của 
các chất hữu cơ chứa clo nhưng các chất độc này vẫn được thải ra môi trường rất 
nhiều, gây ô nhiễm đất và bùn trầm trọng (Fennell, 2004). Tính đến năm 2003, 
trong môi trường có khoảng 3.500 chất hữu cơ chứa clo có nguồn gốc tự nhiên và từ 
các hoạt động sống của con người (Smidt, 2004). Theo EPA, chỉ tính riêng năm 
2001 đã có 150 kg dioxin và các hợp chất tương tự dioxin, 1,13 triệu kg PCB và 
16.000 kg hexachlorobenzene (HCB) giải phóng vào môi trường do các hoạt động 
công nghiệp (EPA, 2006). Tổng số PCB thải vào môi trường trên toàn thế giới tính 
đến năm 2003 là 900-1800 triệu kg (Fennell, 2004). Theo Wagner và đtg (Wagner, 
2009), tổng số PCDD/Fs trong khí quyển trên toàn thế giới hàng năm vào khoảng 
13.000 kg/yard. Lượng các chất PCB và PCDD gây ô nhiễm các thủy vực ở Mỹ 
khoảng 1,2 tỷ m3 (Fennell, 2004). Theo Tas và đtg (Tas, 2009), các hợp chất hữu cơ 
9 
chứa clo là các chất gây ô nhiễm môi trường với phạm vi rộng nhất. Từ những năm 
1980, hàng nghìn tấn HCB được sử dụng làm chất diệt cỏ, diệt nấm, chất bảo quản 
gỗ và sản xuất thuốc nhuộm. Do HCB có độ độc rất cao nên nó đã bị cấm sử dụng 
trên toàn thế giới. Tuy nhiên, HCB vẫn bị thải vào mô ... reductive dechlorination 
of chlorinated dioxins in estuarine sediments. Appl Microbiol Biotechnol 57, 786–790. 
143. Vroumsia T, Steiman R, Seigle-Murandi F, Benoit-Guyod JL, Groupe pour 
l´E´tude du Devenir des Xe´nobiotiques dans l´Environnement (GEDEXE) (2005) 
Fungal bioconversion of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4-
dichlorophenol (2,4-DCP). Chemos 60, 1471–1480. 
144. Wagner A, Kleinsteuber S, Andreesen JR, Lechner U (2009) Transcription 
analysis of genes encoding homologues of reductive dehalogenases in 
“Dehalococcoides” sp. strain CBDB1 by using terminal restriction fragment length 
polymorphism and quantitative PCR Appl Environ Microbiol 75 (7) 1876-1884. 
146 
145. Waller AS, Krajmalnik-Brown R, Löffler FE, Edwards EA (2005) Multiple 
reductive-dehalogenase-homologous genes are simultaneously transcribed during 
dechlorination by Dehalococcoides-containing cultures Appl Environ Microbiol 71 
(12) 8257-8264. 
146. Wang S, He J (2013) Phylogenetically distinct bacteria involve extensive 
dechlorination of Aroclor 1260 in sediment-free cultures. Plos One 8(3), 1-12. 
147. Warner KA, Gilmour CC, Capone DG (2002) Reductive dechlorination of 2,4-
dichlorophenol and related microbial processes under limiting and nonlimiting 
sulfate concentration in anaerobic mid-Chesapeake Bay sediments. FEMS Microb 
Ecol 40, 159-165. 
148. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) 16S ribosomal DNA 
amplication for phylogenetic study. J Bacteriol 173: 697-703. 
149. Wildeman DS, Diekert G, Van Langenhove H, Verstraete W (2003) 
Stereoselective microbial dehalorespiration with vicinal dichlorinated alkanes. Appl 
Environ Microbiol. 69:5643-5647 
150. Yan J, Rash BA, Rainey FA, Moe WM (2009) Detection and quantification of 
Dehalogenimonas and “Dehalococcoides” populations via PCR-based protocols 
targeting 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol 75 (23), 7560–7564. 
151. Yoshida N, Takahashi N, Hiraishi A (2005) Phylogenetic characterization of a 
polychlorinated dioxin dechlorinating microbial community by use of microcosm 
studies. Appl Environ Microbiol 71, 4325–4334. 
152. Zeyaullah M, Kamli MR, Islam B, Atif M, Benkhayal FA, Nehal M, Rizvi MA, 
Arif A (2009). Metageneomicss-An advanced approach for non-cultivable 
microorganisms. Biotechnol Mol Biol, 4 (3), 49 – 54 
153. Zhang X, Wiegel J (1990) Sequential anaerobic degradation of 2,4-
dichlorophenol in freshwater sediments. Appl Environ Microbiol 56, 1119-1127. 
154. Zharikova N, Markusheva T, Galkin E, Korobov V, Zhurenko E, Sitdikova 
L, Kolganova T, Kuznetsov B, Turova T(2006) Raoultella planticola, a new strain 
degrading 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid. Appl Biochem Microbiol 42(3), 258-262. 
147 
SUMMARY 
Study of community diversity of anaerobic bacteria in 
bioremediated herbicide/dioxin cells 
More than 40 years after the US-Vietnam War, spilled Agent Orange defoliant 
solution containing traces of the dioxins, tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) and 
octachlorodibenzodioxin (OCDD), remains in the soil and in lake sediment 
contaminated by polluted soil, which had been carried by run off from the former 
military airbases in Danang and Bienhoa. Natural attenuation of the herbicides and 
dioxins has not been effective in detoxifying the soil or sediment. 
There are 4 mechanisms have been proposed in degradation and 
transformation of polychlorinated compounds by microbes as follows: (1) ring 
cleavage; (2) dechlorination of ring-broken products; (3) catalysis by extracellulase 
enzyme such as laccase, MnP, LiP or laccase-like etc; (4) reductive dechlorination 
by anaerobic bacteria. At least 18 diferent genera show reductive dechlorination 
ability with PCB, polychloroethene, herbicide/dioxin, have been found. They belong to 
3 groups: obligate dehalorespiring bacteria (Dehalobacter, Dehalogenimonas, 
Dehalococcoides); facultatively dehalorespiring bacteria (Desulfitobacterium, 
Sulfurospirillum, Desulfomonile, Desulfuromonas, Geobacter, Anaeromyxobacter, 
Desulfovibrio); co-metabolic reductive dehalorespiring bacteria (Propionigenium, 
Pseudomonas, Bacterioides, Shewanella, Desulfobacterium, Acetobacterium, 
Clostridium, Methanosarcina, Enterobacter etc.). 
Numerous of international groups have concluded that bioremediation is the 
most environmentally responsible and cost-effective remedy for cleaning up Agent 
Orange residues at the former military bases in Vietnam. Bioremediation, which 
utilizes the microorganisms to degrade and detoxify herbicide/dioxin and their 
metabolites was applied with pilot scale in Danang (0.5-100 m
3
) and full treatment 
in Bienhoa (3,384 m
3
). 
Biodegradation of TCDD has been reported from laboratory to pilot scale in 
Vietnam from 1999 up to now. The obtained results from these researches shown 
that microbes are capable in degrading dioxins, herbicides and other toxicants were 
148 
dominant. Microbial community structure of contaminated soil and sediment (Sen 
Lake and other lakes), initially and over the course of bioremediation was observed 
by DGGE varying in Danang and Bienhoa former military bases. Culturable and 
non-culturable microbes and their distribution over some main phylogenetic groups 
inhabiting in herbicide/dioxin contaminated soil befote treatment and during 27 
month detoxification by bioremediation in “active landfill” of Bienhoa airbase. 
Number of fungi, actinomycetes, aerobic and anaerobic bacteria changed depending 
on the water content and nutrient products supplied during bioremediation. 
Their degradation capability of 2,3,7,8-TCDD, dibenzofuran, PAH in purified 
cultures as well as consortia and biotreatments had detected by HPLC, GC/MS, DR-
CALUX and other methods. Characterization of bacteria, actinomycetes, 
filamentous fungi and some their functional genes were also ịnvestigated. More 
than 300 sequences of 16S rRNA, 18S rRNA, dioxin dioxygenase, C23O (encode 
for catechol-2,3-dioxygenase C230), cadA, dbfA1, tfdA genes were deposited at 
GeneBank. Morever, isolation and identification of microbes producing 
oxidoreductase enzymes (laccase, manganese peroxidase - MnP, lignin peroxidase - 
LiP) and their activity from different herbicide/dioxin, TNT, DDT, HCH 
contaminated sites were archived. Aerobic laccase-like enzyme-producing bacteria 
and actinomycetes playing a certain role for the oxidation of chlorinated compounds 
during bioremediation were reported in Bienhoa. Specially, genus Dehalococcoides, 
obligated anaerobic microbes recognizing as “dechlorinating workers”, was 
detected by DGGE method in different original herbicide/dioxin sediments and soil 
of bioremediated cells in Danang and Bienhoa. This bacterial group was detected in 
all Bienhoa bioremediated cells may be involved in reductive dechlorination of 
dioxin as well as other chlorinated pollutants.However, the role of Dehalococcoides 
as well as other dehalorespiring bacteria in the transformation and detoxification of 
a wide range of halogenated compounds, e.g., chlorophenols, chloroethenes, 
chlorobenzenes, biphenyls (PCBs), PCDD/Fs and polybrominated diphenylethers 
(PBDEs) have not been investigated. 
149 
In Vietnam, soil and sediment contamination by mixture of dioxin, herbicide 
(2,4,5-T, 2,4-D) and other chlorinated biodegradation products. Dioxin 2,3,7,8-
TCDD congener is a main substarte causes high toxicity of the soil. In the frame of 
all researches were carried out here used the media containing soil extract with the 
mixture chlorinated compouds above. This research aimed to understand microbial 
community structutre and physiological activity of dehaloganting bacteria including 
Dehalococcoides in Danang and Bienhoa bioremediated cells. The research focused 
on diversity of anaerobic dehalogenating bacteria in Danang and Bienhoa 
bioremediated cells by nested-PCR and DGGE methods, charracterization of 
sulfate-reducing bacteria, transformation and degradation of halogenated 
compounds including dioxins and their congener by pure and enrichment cultures 
using HPLC and GC/MS analysis, diversity of anaerobic bacteria and their function 
genes related to these processes in enrichment containing heavy herbicides and 
dioxins as well as their metabolites by Metagenomics tools. 
Using nested-PCR, the diversity of dehalorespiring bacteria in bioremediated 
herbicide/dioxin cells in Danang and Bienhoa airbases has been verified. 
Dehalorespiring bacteria inhabited in those cells belong to Desulfovibrio, 
Desulfococcus, Desulfitobacterium, Dehalococcoides. Two genera that are 
obligatory dehalorespiring bacteria Dehalogenimonas and Dehalobacter have not 
been detected in these cells. 
Sulfate-reducing bacteria (SRB) and Dehalococcoides diversity within Danang 
and Bienhoa bioremediated cells were found by DGGE when using 16S rRNA gene 
specific primers. They belong to Desulfosarcinar, Desulfococcus, 
Desulfobacterium, Desulfovibrio genera. Sequences of 16S rRNA gene of SRB in 
Bienhoa showed high homology from 97 to 98% in comparision with those in 
Danang. However, SRB in Danang are more diverse than those in Bienhoa. The 
sequences of these bands were deposited in GenBank with accession numbers from 
KC985168 to KC985170 and from KF358989 to KF358997. The diversity of 
Dehalococcoides was also detected by DGGE, especially in P5 bioremediated cell 
in Danang and BH1.2 in Bienhoa was highest. In contrast, Dehalococcoides 
150 
diversity was detected in 100DNT bioremediated cell in Danang after 10 year old 
of treatment was low. The lowest diversity of these bacteria was detected in 
sediments of A, C lakes in Danang and BH3.4 of bioremediated cells in Bienhoa. 
Most of sequences from obtained bands showed high homology (98%) to 16S 
rRNA gene sequence of Dehalococcoides strains of data in the GenBank. These 
DGGE band sequences were deposited in GenBank with accession numbers from 
IQ677605 to IQ677673. 
Analysing by Metagenomics method also demonstrated that dehalorespiring 
bacterial community enriched on heavy herbicide/dioxin contaminated soil 
contained 3 groups: co-metabolic dehalogenating bacteria (Pseudomonas, 
Bacterioides, Clostridium), facultatively dehalorespiring bacteria (Desulfovibrio, 
Desulfitobacterium, Desulfuromonas), obligately dehalorespiring bacteria 
(Dehalococcoides, Dehalogenimonas). Whereas, co-metabolic dehalogenating 
bacteria which could play an important role in dioxin degradation and detoxification 
were dominant in the enrichment. 
Using Metagenomics analysis, series of functional genes coding the enzymes, 
which could be involved in degradation of aromatic compounds under anaerobic 
condition, were presented. All of them belong to Pseudomonas genus, which is the 
majority of metagenome.They are 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1-carboxylate 
dehydrogenase, putative 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase, benzoate 1,2-
dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase. In addition, haloacid dehalogenase, which 
acts on halide bonds in carbon-halide compounds and participates in gamma-
hexachlorocyclohexane degradation, was also exposed. 
The obtained results provided scientific evidences for the dehalogenating 
bacteria community and their functional genes coding for enzymes involved in 
metabolism of the chlorinated compounds as well as bio-transformation and bio-
degradation of these substrates depending on their chemical structure and toxicity in 
herbicide/dioxin contaminated sites. 
SRB are recognized as one of interesting groups of anaerobic dehalorespiration 
bacteria. They are facultative dehalorespiring bacteria that play an important role in 
151 
persistently organic pullutant (POP) degradation, including herbicide’s compounds. 
In this study, effect of environmental factors on the sulfate reducing bacterial 
consortium was shown. The optimal growth of the bacterial consortium was detected 
at temperature of 30-35
o
C, pH 7, 0.1% NaCl. They could also grow in medium with 
the presence of different halogenated organic compounds, such as 2,4-D, 2,4,5-T, 
DCPs, DDT with an initial concentration at 100 ppm. In the Posgate B medium, the 
sulfate reducing bacterial consortium could grow in medium containing either sodium 
-lactate, acetate, pyruvate, or benzoate, except for sodium-citrate and oxalate. 
Sulfate reducing bacteria BDN10T which was isolated from bioremediated 
herbicide/dioxin cell in former DaNang military bases belonged to Desulfovibrio 
genus. This strain was named Desulfovibrio sp. BDN10Twith the accession numbers 
in GenBank is JN314424.These results affirmed the present as well as the role of 
sulfate reducing bacterial group and some strains of Desulfovibrio genus in 
dehalorespiration. Morever, this finding could provide scientific base for enhancing 
the rate of herbicide/dioxin detoxification in bioremediated cells. 
From the bioremediated herbicide/dioxin anaerobic cells the former Danang and 
Bienhoa military airbase, Dehalococcoides and other dehalorespiring bacteria were 
enriched in M204 anaerobic medium containing 2,4-DCP, 2,4,5-T or soil extract. 
Several different anaerobic bacteria that differ from morphology including 
Dehalococcoides were detected in 2,4-DCP and 2,4,5-T enrichments from P1 and 
P5 samples, respectively. Sequences of two Dehalococcoides clones that were 
enriched from P5 sample in M204 anaerobic medium containing 2,4,5-T were 
deposited in GenBank with accession numbers KF305118 and KF305119. 
Using HPLC analyse, 100% of 2,4-DCP was reductively dehalogenated by the 
enrichments, which come from bioremediated herbicide/dioxin cells in Danang and 
Bienhoa samples, after 9 and 12 weeks, respectively. 80-100 % of 2,4,5-T was also 
reductively dehalogenated after 12 weeks. This is the first finding in Vietnam about 
transformation of 2,4-DCP and 2,4,5-T by enrichment cultures driving to defind 
kinetics and pathway of reductive dehalogenation. 
152 
The dehalogenating community degraded and transformed above 55% of 
PCDD/Fs with total equivalent quantity of 41.265 pg TEQ/g soil. Especially, 
OCDD, which is a biomarker for biodegradation (it is only degraded in anaerobic 
condition), was degraded 57% after 1 year-enrichment. In addition, other aromatic 
compounds such as 2,4-DCP, 2,4,5-TCP are also degraded and transformed. Other 
bioremediated intermediates such as benzoic acid, acetic acid, phthalic acid, 2,5-
hexadione, propionic acid, etc. were demontrated to be degraded almost completely. 
Chemical composition of Desulfovibrio sp. BDN10T pure culture in the medium 
containing soil extract scanned by GC-MS analysis indicated that some of 
components existing in the soil extract, which include 2,4-DCP (2,4-dichorophenol) 
and 2,4,5-TCP (2,4,5-trichlorophenol) were be transformed and degraded by the 
examined strain.