Luận án Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) của tôm sú (penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
------- 
NGUYỄN GIANG THU 
NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ 
(TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) 
NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ 
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
HÀ NỘI - 2018 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
------- 
NGUYỄN GIANG THU 
NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ 
(TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) 
NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ 
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9420201 
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng 
 2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh 
HÀ NỘI - 2018 
 i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả 
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa 
từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. 
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã 
được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn 
gốc. 
Hà Nội, ngày tháng năm2018 
Tác giả luận án 
Nguyễn Giang Thu 
 ii 
 LỜI CẢM ƠN 
 Để hoàn thiện luận án, cho phép tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và 
biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Duy Kháng – Viện Công nghệ sinh học – Viện 
Hàn lâm KH&CN Việt Nam và PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh – Viện Nghiên 
cứu Nuôi trồng thủy sản 3 đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời 
gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. 
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, 
PGS.TS. Đồng Văn Quyền – Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Vi sinh vật học 
phân tử, TS. Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học- Viện Công nghệ sinh 
học, cùng các anh chị em trong phòng đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong 
suốt quá trình thực hiện đề tài. 
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Sáng, TS. Nguyễn 
Văn Hảo, TS. Đặng Tố Vân Cầm, cùng các anh chị em cán bộ - Viện Nghiên 
cứu Nuôi trồng thủy sản 2 đã cung cấp mẫu tôm cho nghiên cứu này. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học 
Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo sau đại học đã tận tình giúp đỡ tôi trong 
quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng 
nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên 
khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2018 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Giang Thu 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... i 
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... ii 
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... iii 
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 5 
1.1. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT NAM ........... 5 
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú ..................................................................... 5 
1.1.2. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam ......................... 7 
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ 
CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI .......................................................... 11 
1.2.1. Công trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ gen phiên mã của 
tôm . .................................................................................................. 12 
1.2.2. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua 
việc phân tích hệ phiên mã .................................................................... 13 
1.2.3. Xác định các gen có liên quan tới khả năng sinh sản của tôm ....... .
 . .................................................................................................. 14 
1.2.4. Xác định các gen có liên quan tới giới tính của tôm sú ............... 14 
1.2.5. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Thái Lan
 . .................................................................................................. 15 
1.2.6. Nghiên cứu lập bản đồ gen tôm sú ở Đài Loan ........................... 16 
1.2.7. Nghiên cứu giải mã hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Việt Nam .... .
 . .................................................................................................. 16 
1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE ................... 18 
1.3.1. Chỉ thị phân tử SNP ................................................................... 18 
1.3.2. Chỉ thị phân tử Microsatellite ..................................................... 21 
1.4. TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN 
LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC .............................................. 25 
1.4.1. Tính trạng tăng trưởng ............................................................... 25 
1.4.2. Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã 
được công bố trong nhóm giáp xác ........................................................ 26 
1.4.3. Các nhóm gen ứng viên trong quá trình lột xác .......................... 32 
1.4.4. Các gen phân giải và phát triển hệ cơ trong quá trình lột xác ..... 35 
1.5. SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CÔNG 
NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI ...................................... 38 
1.5.1. Phân loại các phần mềm lắp ráp ................................................. 39 
1.5.2. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen .............................................. 39 
1.5.3. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen phiên mã .............................. 41 
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 44 
2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................................ 44 
2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ......................................................... 44 
2.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................... 44 
2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................... 47 
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 47 
2.5.1. Phương pháp tách riêng rẽ các mô nghiên cứu ........................... 48 
2.5.2. Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm bằng Trizol ......................... 48 
2.5.3. Tách và tinh sạch mRNA ........................................................... 49 
2.5.4. Thiết lập thư viện cDNA ............................................................ 50 
2.5.5. Phương pháp tiền xử lý dữ liệu .................................................. 50 
2.5.6. Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã .......................... 51 
2.5.7. Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã .............. 51 
2.5.8. Phương pháp chú giải chức năng của unigene trong hệ gen phiên 
mã 53 
2.5.9. Phương pháp phân tích biểu hiện hệ gen phiên mã ..................... 54 
2.5.10. Xác định các SNP trong ngân hàng unigene ............................... 54 
2.5.11. Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene ................. 55 
2.5.12. Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ................... 55 
2.5.13. Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) ...................... 56 
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 57 
3.1. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ 
(TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) ................. 57 
3.1.1. Sàng lọc mẫu tôm sạch bệnh ...................................................... 57 
3.1.2. Chuẩn bị thư viện cDNA ............................................................ 58 
3.1.3. Giải trình tự, đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thô ....... 66 
3.1.4. Lắp ráp và chú giải chức năng hệgen phiên mã .......................... 70 
3.1.5. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm 
sú (Penaeus monodon) ........................................................................... 78 
3.2. SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH (UNIGENE) LIÊN QUAN 
ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS 
MONODON) ............................................................................................ 85 
3.2.1. Sàng lọc các unigene .................................................................. 85 
3.2.2. Phân tích sự biểu hiện khác nhau của hệ gen phiên mã tôm sú 
(Penaeus monodon) ............................................................................... 90 
3.3. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG 
TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)TỪ DỮ LIỆU HỆ 
PHIÊN MÃ. ............................................................................................. 96 
3.4. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG 
TRƯỞNG TỪ NHÓM TÔM SÚ GIA HÓA TĂNG TRƯỞNG NHANH 
VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM ................................................................ 99 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 101 
KẾT LUẬN ........................................................................................... 101 
KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 102 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ................................................ 103 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 104 
PHỤ LỤC .................................................................................................. 123 
 i 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt 
3’UTR 3’ untranslated region (trình tự không dịch mã đầu 3’) 
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung 
được tổng hợp từ mRNA) 
Contig Contiguous nucleotide sequence 
DNA deoxyribonucleic acid 
EC Enzyme commission 
IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus 
(virus gây gệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo 
biểu mô) 
MBV Monodon baculovirus (virus gây bệnh còi) 
Nr-NCBI Non redundant protein database-National Center for 
Biotechnology Information 
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) 
RNA Ribonucleic acid 
RNA-seq RNA sequencing (giải trình tự RNA) 
TSV Taura syndrome virus (virus gây hội chứng Taura) 
WSSV White spot syndrome virus (virus gây hội chứng đốm 
trắng) 
YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng) 
QC Quality score (Điểm chất lượng đánh giá trình tự) 
 ii 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 2.1: Các mẫu tôm sú thu từ vùng biển khác nhau của Nghệ An-Hà Tĩnh
 ..................................................................................................................... 45 
Bảng 2.2: Thông tin về 10 mẫu tôm tăng trưởng nhanh và 10 mẫu tôm tăng 
trưởng chậm sử dụng trong phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) ........ 46 
Bảng 2.3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR ......................................................... 56 
Bảng 3.1: Nồng độ mRNA của các mô nghiên cứu ...................................... 61 
Bảng 3.2: Nồng độ DNA sử dụng cho giải trình tự transcriptome bằng hệ 
thống Illumina MiSeq platform .................................................................... 62 
Bảng 3.3: Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự ........................................... 66 
Bảng 3.4: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo từng mô ................... 68 
Bảng 3.5: Thống kê kết quả lắp ráp hệ gen phiên mã tinh sạch từ các mô tôm 
sú Penaeus monodon .................................................................................... 70 
Bảng 3.6: Thống kê kết quả chú giải chức năng tôm sú P.monodon ............ 72 
Bảng 3.7: Thống kê kết quả các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú 
P.monodon. .................................................................................................. 81 
Bảng 3.8: Thống kê miền lặp của các microsatellite trong hệ phiên mã tôm 
sú.................................................................................................................. 82 
Bảng 3.9: Thống kê unigene liên quan đến tăng trưởng trong hệ gen phiên mã 
tôm sú .......................................................................................................... 87 
Bảng 3.10: Sự biểu hiện của hệ phiên mã tôm sú ......................................... 91 
Bảng 3.11: Thống kê một số SNPs được chú giải ở một số gen chính liên 
quan đến tính trạng tăng trưởng .................................................................... 97 
 iii 
DANH MỤC HÌNH 
Hình 1.1: Tôm sú thu được từ vùng biển Nghệ An, Việt Nam. ...................... 5 
Hình 1.2: Sản lượng tôm sú của một số nước trên thế giới vào năm 2011 
(Nguyễn Bích, 2013) ...................................................................................... 8 
Hình 1.3: Mô hình SNP ............................................................................... 19 
Hình 2.1: Mẫu tôm sú tự nhiên thu từ một điểm của vùng biển Nghệ An .... 44 
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................... 47 
Hình 2.3: Tôm sú và hình ảnh giải phẫu ...................................................... 48 
Hình 2.4: Cách tính N50. ............................................................................. 53 
Hình 3.1: Minh họa chất lượng của RNA trên kết quả đo bằng Bioanalyzer 
(https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample
_prep_kit_v2/input_req.html) ....................................................................... 59 
Hình 3.2: Mẫu RNA không thể hiện được chỉ số RIN trên máy Bioanalyzer 
(đánh dấu màu đỏ) ....................................................................................... 60 
Hình 3.3: Xác định nồng độ cDNA mô tim bằng hệ thống Bioanalyzer ....... 63 
Hình 3.4: Xác định nồng độ cDNA mô cơ và mô gan tụy bằng hệ thống 
Bioanalyzer .................................................................................................. 64 
Hình 3.5: Xác định nồng độ cDNA mô gốc mắt bằng hệ thống Bioanalyzer 65 
Hình 3.6: Kết quả đánh giá chất lượng dữ liệu trình tự đọc thô và dữ liệu 
trình tự đọc tinh sạch của các mô ................................................................. 69 
Hình 3.7: Phân bố độ dài toàn bộ unigene trên hệ gen phiên mã tinh sạch ... 71 
Hình 3.8: Thống kê kết quả chú giải BLASTX trên cơ sở dữ liệu NR-NCBI, 
A: Thống kê phân bố giá trị E-value, B: Thống kê phân bố độ tương đồng, C: 
Thống kê phân bố loài trong bộ kết quả tin cậy nhất (E-value thấp nhất)...... 74 
Hình 3.9: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng Gene 
Ontology. ..................................................................................................... 76 
Hìn ... .5.20 Mở nắp các ống RBP 
1.5.21 Chuyển toàn bộ các chất trong ống RBP sang ống mới đánh dấu là RFP. 
1.5.22 Đóng nắp ống RFP. 
1.5.23 Bảo quản các ống Fragment, Prime, Finish Mix tube ở nhiệt độ -15 đến -
250C. 
1.6 Ủ ống RFP: 
1.6.1 Đặt các ống RFP vào máy PCR, chọn chạy chương trình Elution 2 - Frag 
– Prime. 
1.6.2 Lấy các ống RFP ra khỏi máy PCR ngay khi máy đạt đến 4 ° C 
1.6.3 Ly tâm nhanh khoảng 10 giây. 
1.6.4 Chuyển ngay sang bước tiếp theo. 
 126 
PHỤ LỤC 2:CHUẨN BỊ THƯ VIỆN cDNA 
I. Sinh tổng hợp sợi cDNA. 
Chuẩn bị: 
a. Các hóa chất cần thiết: 
First Strand Synthesis Act D Mix (FSA): mastermix sinh tổng hợp cDNA: đưa về 
nhiệt độ phòng. 
EpiScript™ Reverse Transcriptase: enzyme sinh tổng hợp cDNA 
Lên chương trình cho máy RCP đặt tên là Synthesize 1st Strand như sau: 
Chọn chương trình pre-heat lid option và đặt 100°C 
25°C: 10 phút 
37°C: 20 phút 
85°C: 5 phút 
Hold: 4°C 
b. Chuẩn bị một ống PCR mới, đánh dấu CDP 
1.1 Chuẩn bị ống CDP 
1.1.1 Đặt ống RFP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
1.1.2 Vẫn giữ nguyên các ống trên giá từ, mở nắp, hút 17 ul dịch nổi từ các ống 
RFP sang các ống CDP tương ứng. 
1.1.3 Ly tâm ống First Strand Synthesis Act D Mix với vận tốc 600 xg trong 5 
giây. 
1.1.4 Bổ sung 50 ul EpiScript™ Reverse Transcriptase vào ống First Strand 
Synthesis Act D Mix, hút nhà pipet lên xuống nhẹ nhàng, ly tâm khoảng 
8 giây. Nếu không sử dụng hết cả ống First Strand Synthesis Act D Mix, 
bổ sung enzyme EpiScript™ Reverse Transcriptase với First Strand 
Synthesis Act D Mix theo tỷ lệ enzyme: Mix là 1:9, đánh dấu vào các ống 
ống First Strand Synthesis Act D Mix đã bổ sung enzyme. 
1.1.5 Cho 8 ul Mastermix First Strand Synthesis Act D Mix đã bổ sung 
EpiScript™ Reverse Transcriptase vào mỗi ống CDP, 
1.1.6 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống CDP. 
Lắc các ống CDP với vân tốc 1.600 rpm trong 20 giây. 
1.1.7 Bảo quản ống First Strand Synthesis Act D Mix tại nhiệt độ -15 đến -
20oC ngay sau khi sử dụng. 
 127 
1.2 Ủ ống CDP: 
1.2.1 Đưa các ống CDP vào máy PCR, chạy chương trình Synthesize 1st 
Strand. 
1.2.2 Lấy các ống CDP ra khỏi máy ngay khi máy đạt đến nhiệt độ 40C. 
1.2.3 Tiến hành ngay bước tiếp theo sinh tổng hợp mạch cDNA thứ 2. 
II. Sinh tổng hợp mạch cDNA thứ 2: 
a. Các hóa chất cần thiết: 
End Repair Control(CTE): đưa về nhiệt độ phòng. 
 Buffer (RSB): đưa về nhiệt độ phòng. 
Second Strand Marking Master Mix (SMM): đưa về nhiệt độ phòng. 
AMPure XP beads: để ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút. 
b. Thiết lập máy PCR về nhiệt độ 160C. 
2.1 Bổ sung SMM 
2.1.1 Mở nắp các ống CDP 
2.1.2 Thực hiện một trong 2 cách sau: 
a. Nếu sử dụng các hóa chất nội kiểm: 
- Ly tâm ống End Repair Control tại vận tốc 600 xg trong 5 giây. 
- Pha loãng ống End Repair Control 1/50 trong Resuspension Buffer 
(Ví dụ, 2 ul End Repair Control + 98 ul Resuspension Buffer) trước khi 
sử dụng. loại bỏ ống End Repair Control sau khi sử dụng. 
- Bổ sung 5 ul End Repair Control đã pha loãng vào từng ống CDP 
b. Nếu không sử dụng thuốc thử kiểm soát in-line, Bổ sung 5 ul 
Resuspension Buffer cho mỗi ống CDP. 
2.1.3 Ly tâm Second Strand Marking Master Mix với vận tốc 600 xg trong 5 
giây. 
2.1.4 Bổ sung 20 ul Second Strand Marking Master Mix vào các ống CDP. 
2.1.5 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống CDP. 
Lắc các ống CDP tại vận tốc 1.600 rpm trong 20 giây. 
2.1.6 bảo quản ống Second Strand Marking Master Mix đến -15 ° đến -25 ° C 
ngay sau khi sử dụng. 
2.2 Ủ ống CDP lần 2: 
2.2.1 Đặt các ống CDP vào máy PCR, ủ ở 16 ° C trong 1 giờ. 
 128 
2.2.2 Lấy các ống CDP ra khỏi máy PCR, mở nắp và làm ấm đến nhiệt độ 
phòng. 
2.3 Tinh sạch ống CDP: 
2.3.1 Lắc lọ AMPure XP cho đến khi mật độ các hạt bead đồng đều, sau đó Bổ 
sung 90 ul Hạt XP AMPure vào các ống 1.5 ml mới được đánh dấu CCP. 
2.3.2 Hút tất cả dung dịch từ các ống CDP sang các ống CCP đã có sẵn 
AMPure XP bead. 
2.3.3 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống CCP 
Lắc các ống CCP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
2.3.4 Ủ các ống CCP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 
2.3.5 Đặt các ống CCP trên giá từ ở nhiệt độ phòng, trong 5 phút. 
2.3.6 Mở nắp các ống CCP 
2.3.7 Hút bỏ 135 ul dịch nổi từ mỗi ống CCP . 
2.3.8 Với ống CCP trên giá từ, Bổ sung 200 ul EtOH 80% (mới pha) vào từng 
ống. 
2.3.9 Ủ ống CCP ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó hút bỏ toàn bộ dịch 
nổi trong mỗi ống. 
2.3.10 Lặp lại bước 3.37 và 3.38 một lần nữa với EtOH 80% (mới pha). 
2.3.11 Để các ống trên giá từ, tại nhiệt độ phòng trong 15 phút để khô 
2.3.12 Lấy các ống ra khỏi giá từ. 
2.3.13 Ly tâm Resuspension Buffer với vận tốc 600 xg trong 5 giây. 
2.3.14 Bổ sung 17,5 ul Resuspension Buffer vào ống CCP. 
2.3.15 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống CCP 
Lắc ống CCP với vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
2.3.16 Ly tâm ống CCP ở vận tốc 280 xg trong 1 phút. 
2.3.17 Ủ ống CCP ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. 
2.3.18 Đặt ống CCP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
2.3.19 Mở nắp các ống CCP. 
2.3.20 Chuyển 15 ul dịch nổi (ds cDNA) từ ống CCP sang ống 1.5 ml mới đánh 
dấu là ALP. 
III. Gắn Adenyle vào đầu 3’ 
Chuẩn bị: 
 129 
a. Các hóa chất cần thiết: 
A-Tailing Control(CTA): đưa về nhiệt độ phòng 
A-Tailing Mix (ATL): đưa về nhiệt độ phòng 
Resuspension Buffer (RSB):đưa về nhiệt độ phòng 
b. Thiết lập máy PCR đặt tên là ATAIL70 theo chu trình nhiệt như sau: 
37°C: 30 phút 
70°C: 5 phút 
Hold at 4°C 
3.1 Bổ sung ATL: 
3.1.1 Thực hiện một trong cách điều sau: 
a. Nếu sử dụng các hóa chất nội kiểm: 
-Ly tâm ống A-Tailing Control tại vận tốc 600 xg trong 5 giây. 
- Pha loãng A-Tailing Control 1/100 trong Resuspension Buffer (Ví 
dụ, 1 ul A-Tailing Control + 99 ul Resuspension Buffer) trước khi sử 
dụng. loại bỏ các A-Tailing Control đã pha loãng sau khi sử dụng. 
-Bổ sung 2,5 ul A-Tailing Control đã pha loãng vào các ống ALP. 
b. Nếu không sử dụng thuốc thử kiểm soát in-line, Bổ sung 2,5 ul 
Resuspension Buffer vào các ống ALP. 
3.1.2 Bổ sung 12,5 ul A-Tailing Mix vào các ống ALP. nhẹ nhàng pipet lên 
xuống 10 lần để trộn đều. 
3.1.3 Đóng nắp các ống ALP. 
3.2 Ủ các ống ALP lần 1: 
3.2.1 Đặt các ống ALP vào máy PCR, chạy chương trình ATAIL70. 
3.2.2 Lấy các ống ALP ra khỏi máy PCR ngay khi nhiệt độ đạt đến 4 ° C. 
3.2.3 Tiến hành ngay bước nối Adapters. 
IV. Nối Addapter: 
Chuẩn bị: 
Ligation Control(CTL): đưa về nhiệt độ phòng 
RNA Adapter Indices : đưa về nhiệt độ phòng, chọn lựa index theo bảng hướng dẫn 
ở trang 16. 
Ligation Mix (LIG): để tại nhiệt độ âm cho đến khi sử dụng. 
Resuspension Buffer (RSB): đưa về nhiệt độ phòng. 
Stop Ligation Buffer (STL): đưa về nhiệt độ phòng 
AMPure XP beads: để ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút 
 130 
Freshly Prepared 80% Ethanol(EtOH). 
4.1 Bổ sung LIG: 
4.1.1 Ly tâm ống adapter RNA đã làm ấm về nhiệt độ phòng với vận tốc 600 xg 
trong 5 giây. 
4.1.2 Ly tâm Ligation Control (nếu sử dụng Ligation Control) và ống Stop 
Ligation Buffer tại vận tốc 600 xg trong 5 giây. 
Lưu ý: chỉ lấy cácốngMixThắtở -15°đến -25° Clưu trữ ngaytrước khi sử 
dụng. 
Mở nắp các ốngALP. 
4.1.3 Thực hiện mộttrong hai cách sau: 
a. Nếu sử dụnghóa chất nội kiểm: 
- PhaloãngLigation Control1/100trongResuspensionBuffer(Ví dụ,1 
ulThắtControl +99ulResuspensionBuffer)trước khi sử dụng. loại bỏ 
cácLigation Controlđã pha loãng sau khi sử dụng. 
- Bổ sung2,5 ulLigation Control đã pha loãngvào từng ống ALP. 
b. Nếu không sử dụnghóa chất nội kiểm: Bổ sung 2,5ulResuspension Buffer 
vào từng ốngALP. 
4.1.4 Bổ sung 2,5 ul Ligation Mix vào từng ống ALP. 
4.1.5 Bảo quản ống Ligation Mix ở -15°đến -25° Cngaysau khi sử dụng. 
4.1.6 Bổ sung 2,5ul RNAAdapter Index thích hợpvào từng ống ALP. 
4.1.7 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống ALP. 
Lắccác ốngALPtại vận tốc 1.800 rpmtrong vòng 2 phút. 
4.1.8 Ly tâm các ống ALP ở vận tốc 280 xg trong 1 phút. 
4.2 Ủ ống ALP lần 2: 
4.2.1 Đưa các ống ALP vào máy PCR, ủ ở 30 ° C trong 10 phút. 
4.2.2 lấy các ống ALP từ máy PCR. 
4.3 Bổ sung STL: 
4.3.1 Mở nắp các ống ALP 
4.3.2 Bổ sung 5 ul Stop Ligation Buffer vào từng ống ALP để vô hiệu ligation 
mix, 
4.3.3 Tiến hành các bước mix đều như sau: 
Đóng nắp các ống ALP 
Lắc ống ALP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
 131 
4.3.4 Ly tâm ống ALP tại vận tốc 280 xg trong 1 phút. 
4.4 Tinh sạch ống ALP: 
4.4.1 Mở nắp các ống ALP. 
4.4.2 Lắc đều AMPure XP bead cho đến khi mật độ các hạt đồng đều, sau đó 
Bổ sung 42 ul hỗn hợp XP AMPure bead vào từng ống ALP. 
4.4.3 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống ALP 
Lắc ống ALP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
4.4.4 Ủ ống ALP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 
4.4.5 Đặt ống ALP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
4.4.6 Mở nắp các ống ALP 
4.4.7 Hút bỏ 79,5 ul dịch nổi từ mỗi ống ALP. 
4.4.8 Với ống ALP giữ nguyên trên giá từ, Bổ sung 200 ul EtOH 80% (mới 
pha) vào từng ống. 
4.4.9 Ủ ống ALP ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó loại bỏ tất cả dịch nổi 
từ mỗi ống. 
4.4.10 Lặp lại bước 5.4.8 và 5.4.9 một lần cho tổng cộng 80% rửa EtOH. 
4.4.11 Trong khi vẫn giữ ống ALP trên giá từ, để ống tự khô tại nhiệt độ phòng 
trong 15 phút. 
hòa tancặn với 52,5 ul Buffer Resuspension . 
4.4.12 Tiến hành các bước Mix như sau: 
Đóng nắp các ống ALP 
Lắc ống ALP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
4.4.13 Ủ ống ALP ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. 
4.4.14 Đặt ống ALP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
4.4.15 Mở nắp ống ALP 
4.4.16 Chuyển 50 ul dịch nổi từ các ống ALP sang các ống 1.5 ml tương ứng 
mới được đánh dấu CAP. 
4.4.17 Vortex AMPure XP bead cho đến khi mật độ các hạt được đồng đều, sau 
đó Bổ sung 50 ul hỗn hợp hạt XP AMPure vào từng ống CAP. 
4.4.18 Tiến hành các bước mix như sau: 
Đóng nắp các ống CAP 
Lắc ống CAP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
4.4.19 Ủ ống CAP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 
 132 
4.4.20 Đặt ống CAP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
4.4.21 mở nắp các ống CAP. 
4.4.22 Hút bỏ 95 ul dịch nổi từ mỗi ống CAP. 
4.4.23 Với ống CAP trên giá từ, Bổ sung 200 ml EtOH 80% (mới pha) vào các 
ống. 
4.4.24 Ủ ống CAP ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó hút bỏ tất cả dịch nổi 
từ mỗi ống. 
4.4.25 Lặp lại các bước 5.4.23 và 5.4.241 lần. 
4.4.26 Với ống CAP giữ nguyên trên giá từ, để không khí mẫu khô tại nhiệt độ 
phòngtrong 15 phút. 
4.4.27 Hòa tan cặn trong các ống với 22,5 ul ResuspensionBuffer . 
4.4.28 Hòa trộn kỹ càng như sau: 
đóng nắp ống CAP 
Lắc ống CAP tại vận tốc 1.800 rpm trong vòng 2 phút. 
4.4.29 Ủ ống CAP ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. 
4.4.30 Đặt ống CAP trên giá từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
4.4.31 Mở nắp các ống CAP. 
4.4.32 Chuyển 20 ul dịch nổi từ từng các ống CAP sang các ống PCR tương ứng 
đánh dấu PCR. 
V. Làm giàu các đoạn DNA 
Chuẩn bị: 
Các hóa chất cần chuẩn bị: 
PCR Master Mix (PMM): đưa về nhiệt độ phòng, ly tâm nhẹ ở 600xg trong 5 
giây trước khi sử dụng. 
PCR Primer Cocktail (PPC): đưa về nhiệt độ phòng, ly tâm nhẹ ở 600xg 
trong 5 giây trước khi sử dụng. 
Resuspension Buffer (RSB): đưa về nhiệt độ phòng. 
AMPure XP beads: để ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút trước khi đưa 
vào sử dụng. 
Freshly Prepared 80% Ethanol(EtOH). 
Chuẩn bị máy PCR đặt tên chương trình là PCR với điều kiện phản ứng như 
sau: 
• 98°C: 30 giây 
• 15 chu kỳ: 98°C: 10 giây 
 133 
60°C: 30 giây 
72°C: 30 giây 
• 72°C: 5 phút 
• 4°C: ∞ 
5.1 Chuẩn bị ống PCR: 
5.1.1 Bổ sung 5 ulPCR Primer Cocktail vào từng ốngPCR. 
5.1.2 Bổ sung25ul PCR Master Mixvào từng ốngPCR. nhẹ nhàngpipetlên 
xuống10 lần đểtrộn đều. 
5.1.3 Đóng nắp ống PCR. 
5.2 Chạy PCR: 
Đặt các ống PCR vào máy PCR, chạy chương trình PCR đã chuẩn bị sẵn. 
5.3 Tinh sạch sản phẩm PCR: 
5.3.1 Mở nắp các ốngPCR. 
5.3.2 VortexAMPureXPbeadcho đến khi mật độ các hạt trong ống đồng đều. 
5.3.3 Bổ sung 50ulhạtAMPureXP bead vàocác ốngPCRcóchứa50ulsản 
phẩmPCR. nhẹ nhàngpipet lên xuốngvà10lần đểtrộn đều. 
5.3.4 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong 15 phút. 
5.3.5 Đặtcác ốngPCRtrên giá từở nhiệt độ phòngtrong 5 phút. 
5.3.6 Hút bỏ95ul dịchnổitừ các ốngPCR. 
5.3.7 Với các ốngPCRgiữ nguyêntrên giátừ, Bổ sung200mlEtOH80% (mới 
pha) vào các ống PCR. 
5.3.8 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong 30 giây, sau đó hút bỏ toàn bộ dịch 
nổicủa các ống. 
5.3.9 Lặp lại các bước7 và 8một lần. 
5.3.10 Với các ốngPCRgiữ nguyên trêngiá từ, đểkhông khímẫukhôtại nhiệt 
độphòngtrong 15 phútvà sau đólấy các ống ra khỏi giá từ. 
5.3.11 Hòa tancặn ở đáy ống với32,5ul ResuspensionBuffer. nhẹ nhàngpipet lên 
xuống10lần đểtrộn đều. 
5.3.12 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong 2 phút. 
5.3.13 Đặtcác ốngPCRtrên giá từở nhiệt độ phòngtrong 5 phút. 
5.3.14 Chuyển30uldịch nổitừ các ốngPCR sang các ống0,3mlPCRmớiđược đánh 
dấuTSP1. 
 134 
PHỤ LỤC 3:XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ RNA BẰNG MÁY BIOANALYZER 
 Chuẩn bị RNA ladder 
1. Spin Ladder xuống và hút ra ống Eff RNase-free nhỏ 
2. Biến tính ở nhiệt độ 70o C trong 2 phút 
3. Chuyển lên đá lạnh 
4. Thêm 90 µl nước RNase-free và mix đều 
5. Chuẩn bị lượng vừa đủ sử dụng trong ống Eff 0,5 ml sử dụng trong ngày 
6. Bảo quản ở -70o C. Sau khi đã biến tính, bảo quản lạnh thì khi sử dụng sẽ không 
phải biến tính lại nữa. 
7. Trước khi sử dụng thì cắm Ladder lên đá khô. 
 Chuẩn bị Gel 
1. Hút 550 µl RNA gel matrix (lọ màu đỏ) vào spin filter. 
2. Ly tâm với tốc độ 1500g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng 
3. Hút 65 µl dịch ở ống đã ly tâm vào ống Eff 0,5 ml. Sử dụng gel đã lọc trong 
vòng 4 tuần. Bảo quản ở 4o C 
 Chuẩn bị Gel-Dye Mix 
1. Để RNA dye (lọ màu xanh dương) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút 
2. Votex RNA dye concentrate (lọ màu xanh dương) trong 10 giây, spin xuống. 
Hút 1 µl dye bổ sung vào 65 µl Gel filtered 
3. Votex đều dung dịch. Ly tâm 13000 g trong 10 phút ở nhiệt độ. Sử dụng Gel-
dye mix trong một ngày. 
 Loading Gel-Dye Mix 
1. Đặt chip RNA mới lên trạm để chip 
2. Hút 9 µl hỗn hợp Gel-dye vào giếng chữ G màu trắng 
3. Đưa xilanh về vị trí 1ml và đóng nắp trạm 
4. Nhấn xilanh xuống vị trí khóa 
5. Chờ chính xác 30 giây thì tháo xilanh khỏi vị trí khóa 
6. Chờ 5 giây. Kéo chậm xilanh lên vị trí 1ml ban đầu 
7. Mở nắp trạm chip và hút 9 µl hỗn hợp Gel-dye vào các giếng G màu đen trừ 
giếng G màu trắng đã có Gel-dye rồi 
 Loading Conditioning Solution và Marker 
1. Hút 9 µl RNA conditioning solution (Lọ màu trắng) vào giếng kí hiệu CS 
 135 
2. Hút 5 µl RNA marker (Lọ xanh lá cây) vào 11 giếng chứa mẫu và giếng kí hiệu 
# 
 Loading Diluted Ladder and Samples 
1. Hút 1 µl ống Ladder đã biến tính ở nhiệt độ 70o C vào giếng kí hiệu # 
2. Hút 1 µl mẫu RNA vào 11 giếng chứa mẫu còn lại. Nếu không đủ 11 mẫu thì 
các giếng không có mẫu thì hút 1 µl RNA Marker (Lọ xanh lá cây) thay thế 
mẫu. 
3. Đặt chip RNA lên máy Votex và votex ở 2400 rpm trong 1 phút 
4. Chạy chip RNA bằng máy Agilent 2100 Bioanalyzer trong vòng 5 phút. Sau đó 
máy sẽ đưa ra kết quả.