Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb. ex murray) trevis) thu tại Lào cai và Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
LÊ THỊ LAN ANH 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ 
 NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA 
(Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) 
 THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Hà Nội – 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
LÊ THỊ LAN ANH 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ 
 NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA 
(Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) 
 THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9.42.02.01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
 1. TS. Lê Thị Bích Thủy 
 2. GS. TS. Nguyễn Đức Thành 
Hà Nội – 2021 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
 Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với 
một số cộng sự khác. 
 Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã 
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, các hội nghị trong nước và 
quốc tế với sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả. 
 Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất 
kỳ công trình nào khác. 
 Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
 Nghiên cứu sinh 
 Lê Thị Lan Anh 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
 Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của 
mình đến GS. TS. Nguyễn Đức Thành và TS. Lê Thị Bích Thủy, phòng Di truyền Tế 
bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt 
Nam, những người thầy đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn 
khoa học và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu 
và hoàn thành luận án. 
 Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô tại Viện Công nghệ sinh học đã 
giảng dạy, cung cấp kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề 
trong chương trình đào tạo. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ 
đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào 
tạo. 
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng 
trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, 
các thầy cô trong các Khoa, Phòng, Ban nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện tốt 
nhất, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ chuyên môn tại trường trong suốt 
thời gian tôi đi học. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Tế bào Thực vật, 
Viện Công Nghệ sinh học, tập thể các cán bộ thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên và 
Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ và chia sẻ 
kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào 
tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện 
Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ 
trong quá trình học tập. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong 
khuôn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học và Công nghệ: “Khai thác và phát triển 
nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) tại Sapa và 
Đà Lạt”. 
 Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn tôi xin gửi đến gia đình, người thân và bạn 
bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời 
gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn! 
 Nghiên cứu sinh 
 Lê Thị Lan Anh 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii 
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii 
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................... v 
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... ix 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1 
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài .................................................... 2 
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 
3. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3 
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................... 3 
4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 3 
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 
1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .............................. 5 
1.1.1. Phân loại ..................................................................................................... 5 
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa ...................................... 6 
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa .............................. 7 
1.1.4. Đặc điểm sinh sản ..................................................................................... 10 
1.1.5. Đặc điểm hóa sinh .................................................................................... 11 
1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa .............. 14 
1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa ................ 15 
1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA .......................................................... 15 
1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA .................... 18 
1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA ................... 20 
1.2.4. Vai trò của HupA trong y học ................................................................... 22 
1.2.5. Dược động học của HupA ........................................................................ 23 
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở 
Việt Nam ........................................................................................................ 25 
iv 
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới ...... 25 
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam ....... 30 
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 31 
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 31 
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 31 
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 32 
2.1.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 33 
2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................. 33 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 34 
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng 
răng cưa ................................................................................................................. 34 
2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa ........................................ 39 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 46 
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ... 46 
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ...................... 46 
3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa ..................................... 49 
3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa ...................... 51 
3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị 
phân tử RAPD ....................................................................................................... 53 
3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai 
và Lâm Đồng. ....................................................................................................... 59 
3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa ................................................................ 68 
3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân ......... 68 
3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô ............. 88 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 107 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .................................................. 109 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 110 
PHỤ LỤC 
v 
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 
ACh Acetylcholine Axetylcholin 
AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesteraza 
AD Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer 
AFLP Amplified fragment length 
polymorphism 
Đa hình chiều dài của đoạn 
được khuếch đại. 
BA 6-benzyladenin 6-benzyladenin 
BuChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesteraza 
CTAB Cetyltrimethyl 
amoniumbromide 
Xetyltrimethyl amoniumbromit 
CYP Cytochrome P450 Xytochrom P450 
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic 
dNTP Deoxyribonucleoside 
triphosphate 
Deoxyribonucleosit triphosphat 
EDTA Ethylene diamin tetra acetate Ethylene diamin tetra axetat 
HPLC High performance liquid 
chromatography 
Sắc ký lỏng hiệu năng cao 
HupA Huperzine A Huperzin A 
H. serrata Huperzia serrata Thạch tùng răng cưa 
IAA β-indole acetic acid Axit β-indole acetic 
IBA Indole-3-butyric acid Axit indole-3-butyric 
IC50 The half maximal inhibitory 
concentration 
Nồng độ ức chế tối đa một nửa 
Kb Kilobase Kilo bazơ 
LC-MS Liquid chromatography-mass 
spectrometry 
Sắc ký lỏng khối phổ 
MS Murashige and Skoog medium Môi trường Murashige và 
Skoog 
NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic 
vi 
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 
OD Optical density Mật độ quang 
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza 
Phy Physostigmine Physostigmin 
RAPD Random amplified 
polymorphic DNA 
Đa hình phân đoạn DNA được 
nhân bản ngẫu nhiên 
Rf Rentention factor Hệ số di chuyển 
RNase Ribonuclease Enzim ribonucleaza 
SD Standard deviation Độ lệch tiêu chuẩn 
TE Tris EDTA Tris EDTA 
THA Tetrahydroaminoacridine Tetrahydroaminoacridin 
TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng 
UPLC - MS Ultra performance liquid 
chromatography - mass 
Spectrometry 
Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu 
dò khối phổ 
UPLC-PDA Ultra performance liquid 
chromatography- photodiode 
array 
Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò 
PDA 
UPLC-Q/TOF/
MS 
Ultra performance liquid 
chromatography/ quadrupole 
time of flight/ mass 
spectrometry 
Sắc ký lỏng siêu áp/ phương 
pháp quang phổi khối thời gian 
chạy tứ cực 
UV Ultra violet Tia tử ngoại 
vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu 32 
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu... 36 
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo 43 
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và 
Lào Cai.. 
46 
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 
mồi RAPD.. 
55 
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. 56 
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu 
Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).............. 
64 
Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa. 66 
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây 
con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng 
giâm hom 
69 
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con 
Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai. 
71 
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của 
cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm 
Đồng.. 
74 
Bảng 3.9. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây 
con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai. 
76 
Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát 
triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu 
....78 
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con 
Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng. 
80 
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai 
và Lâm Đồng sau 4 tháng........... ..81 
Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng. 83 
Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác 
nhau. 
84 
viii 
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con 
Thạch tùng răng cưa. 
..85 
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa 
sau 30 ngày nuôi cấy. 
89 
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nuôi cấy chồi Thạch 
tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy 
91 
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 
120 ngày nuôi cấy.. 93 
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng 
cưa sau 120 ngày nuôi cấy 
94 
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng 
răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy.. 
95 
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau 
60 ngày nuôi cấy. 96 
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng 
cưa sau 60 ngày nuôi cấy... 
97 
Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau 
60 ngày nuôi cấy.. 
97 
Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng.. ..100 
Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên môi trường 
¼ MS + 1 mg/l kinetin sau 4 tháng....... 
..102 
ix 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata.. ..6 
Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùn ... ffects of Huperzine A and B on 
skeletal muscle and electroencephalogram, Acta Pharmacologica Sinica, 
1987, 8 (2), 117-123. 
101. S.L. Zhang, Therapeutic effects of Huperzine A on the aged human with 
memory impatient, New Drugs Clin remed, 1986, 5, 260-262. 
102. R.E. Becker, P. Moriearty, L. Unni L, The second generation of cholinesterase 
inhibitors: clinical and pharmacological effects, Cholinergic Basis for 
Alzheimer Therapy, 1991, 263-296. 
103. X.C. Tang, Y.F. Han, X.P. Chen, X.D. Zhu, Effects of Huperzine A on 
learning and the retrieval process of discrimination performance in rats, Acta 
Pharmacologica Sinica, 1986, 7 (6), 507-511. 
104. G.P. Vincent, L. Rumennik, R. Cumin, J. Martin, J. Sepinwall (1987), The 
effects of Huperzine A, an acetylcholinesterase inhibitor, on the enhancement 
of memory in mice, rats and monkeys, Neuroscience Abstracts, 1987, 13, 844. 
105. X.D. Zhu, X.C. Tang, Improvement of impaired memory in mice by huperzine 
A and huperzine B, Acta Pharmacologica Sinica, 1988, 9(6), 492-497. 
106. Tang, Y.F. Han, Pharmacological profile of Huperzine A, a novel 
acetylcholinesterase inhibitor from Chinese herb, CNS Drug review, 1999, 5 
(3), 281-300. 
 121 
107. J.T. Little, S. Walsh, P.S. Aisen PS, An update on Huperzine A as a treatment 
for Alzheimer’s disease, Expert opinion on investigational drugs, 2008, 17 (2), 
209-215. 
108. Y.E. Wang, J. Feng, W.H. Lu, X.C. Tang, Pharmacokinetics of Huperzine A 
in rats and mice, Acta Pharmacologica Sinica, 1988, 9(3), 193-196. 
109. G. Wang, S. Zhang, H. Zhan, Effect of Huperzine A on cerebral cholinesterase 
and acetylcholine in elderly patients during recovery from general anesthesia, 
Journal of southern medical university, 2006, 26 (11), 1660-1662. 
110. Y. Wang, D. Chu, J. Gu, J.P. Fawcett, Y. Wu, W. Liu, Liquid 
chromatographic tandem mass spectrometric method for the quantitation of 
Huperzine A in dog plasma, Journal of chromatography B, 2004, 803 (2), 
375-378. 
111. B.C. Qian, M. Wang, Z.F. Zhou, K. Chen, R.R. Zhou, G.S. Chen, 
Pharmacokinetics of tablet huperzine A in six volunteers, Acta 
pharmacologica sinica, 1995, 16 (5), 396-398. 
112. G. Li, J. Li, Y.Y. Li, Y.J. Tang, H. Wei, Sterilization of explants and 
elimination of endophytes in Huperzia serrata, Journal of Jishou University 
(Natural Sciences Edition), 2009, 30 (4), 100 - 103. 
113. Y. Zhou, X. Liu, K.G. Li, Z.G. Wang, X. Geng, S.P. Hu, Tissue culture 
of Huperzia serrata, Journal of Jishou University Natural Sciences Edition, 
2009, 30 (2), 90-93. 
114. Y.Z. Ma, J.H. Liu, H. Xu, F. Liu, In vitro cultural of Huperzia serrata, Plant 
physiology Journal, 2015, 51 (4), 465-470. 
115. X.Z. Xu, Y. Tu, Z.D. Ji, M. Chen, X.F. Cai, P. Yang, In vitro cultured 
morphological changes in Huperzia serrata and accumulation of Huperzine A, 
Chinese Bulletin of Botany, 2015, 50 (6), 733-738. 
116. Z.A. Wang, J.Z. Xu, X.P. Yu, S.J. Shen, Effect of environmental factors on 
growth of Huperzia serrata, Europe PMC, 2008, 33(15), 1814-1816. 
117. H.Y. Zeng, W.B. Zhang, Studies on the Propagations of Medicinal Fern 
Huperzia serrata, Journal of Huaihua University, 2008, 03. 
118. J.C. Zhang, H.Y. Zhang, Z.L. Ye, X.H. Ye, M. Zhu, Preliminary report of 
Huperzia serrata nursery constructing and original habitat cutting, Journal of 
 122 
Sanming University, 2009, 02. 
119. D.J. Qin, Y.K. Yang, J.Q. Xiang, F.Z. Zeng, Y.J. Li, H.Q. Yin, Y.C. Zou, J. 
Ma, Study on cutting seedling NFT culture technique of Huperzia 
serrata (Thunb.) Trev, Journal of Hubei University for Nationalities - Natural 
Science edition, 2010, 28 (1), 18-21. 
120. H. Long, Q. Li, L. Li, L.H. Huang, Study on cutting and gemmae propagation 
of Huperzia serrata, Article in Chinese Zhong Yao Cai, 2014, 37 (7), 
1115-1121. 
121. M. Maridass, G. Raju, R. Mahesh, K. Muthuchelian, K. Dharmar, A. Chelliah 
A, Ex situ convervation of endemic fern allies, Huperzia hilliana (Spring) RD 
Dixit, International journal of applied bioresearch, 2011, 2, 1-6. 
122. D.P. Whittier and H. Storchova, The gametophyte of Huperzia selago in 
culture, American Fern Journal, 2007, 97 (3), 149-154. 
123. Xuan Binh Minh Phan, Thi Kim Trang Do, Thi Hien Nguyen, Phuong Lan 
Nguyen, Bao Tram Tran (2019), Effect of mineral mixture on the in vitro 
propagation of Huperzia serrata Thunb, Vietnam Journal of science and 
technology, 2019, 61 (5), 31 - 36. 
124. Nông Văn Duy, Tình hình nghiên cứu Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam, Nhà 
xuất bản Tây Nguyên., 2015, 7-12. 
125. Nguyễn Nghĩa Thìn, Các phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học 
Quốc gia Hà Nội, 2008. 
126. M.A. Saghai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard, 
Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian 
inheritance, chromosomal location, and population dynamics, Proceedings of 
the National Academy of Sciences of the United States of America, 1984, 81 
(24), 8014-8018. 
127. J.G. William, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, S.V. Tingey, DNA 
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, 
Nucleic Acids Research, 1990, 18 (22), 6531–6535. 
128. F.I. Rohlf, Programa NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate 
analysis system: version 2.1, The American Statistician, 2000, 83. 
129. B.S. Weir, Genetic data analysis II: Method for discrete population genetic 
 123 
data, Sinauer associates, Inc. Sunderland, MA., 1996, 376. 
130. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Chất điều hòa sinh trưởng đối với 
cây trồng, NXB Nông Nghiệp, 1993, 11-17. 
131. T. Murashige and F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bio 
assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 1962, 15, 
473-479. 
132. G. Lloyd, B. McCown, Commercially – feasible micropropagation of 
mountain laurel, Kalmiaa latifolia, by use of shoot-tip culture, Combined 
Proceedings, International Plant Propagators’ Society, 1980, 30, 421-427. 
133. O. L. Gamborg, R. A. Miller and K. Ojima, Nutrient requirements of 
suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, 1986, 
50 (1), 151-158. 
134. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản trẻ, 2003, quyển 1, 24. 
135. Trần Anh Tuấn, Trương Ngọc Kiểm, Đánh giá tiềm năng tài nguyên khí hậu 
khu vực Hoàng Liên Sơn (thuộc tỉnh Lào Cai) phục vụ quy hoạch phát triển 
cây Tam thất (Panax pseudo-ginseng Wall), Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: 
Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ, 2017, 33(22S), 288-294. 
136. Nguyễn Thị Thu Hà, Đa dạng sinh học ở vườn Quốc gia Hoàng Liên với phát 
triển du lịch sinh thái ở Tây Bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 
2017, 172 (12/1): 103 -108. 
137. Báo cáo cuối cùng “Khảo sát cơ sở về đa dạng sinh học cho dự án quản lý tài 
nguyên thiên nhiên bền vững (hợp phần 3)”, Cơ quan hợp tác Quốc tế Nhật 
Bản (JICA)/ Dự án quản lý bền vững tài nguyên thiên nhiên (SNRM), 2017, 
Viện sinh thái học miền Nam. 
138. D. Bai, Development of Huperzine A and B for treatment of Alzheimer’s 
disease, Pure Applied Chemistry, 2007, 79 (4), 469-479. 
139. Ninh Thị Phíp, Một số biện pháp kỹ thuật tăng khả năng nhân giống của cây 
Đinh lăng lá nhỏ, Polyscias fruticose (L.) harms, Tạp chí Khoa học và Phát 
triển, 2013, 11 (2), 168 - 173. 
140. T.R. Abu-Zahra, A.N. Al-Shadaideh, s.m. Abubaker, I.M. Qrunfleh, Influence 
of auxin concentrations on different ornamental plant rooting, International 
Journal of Botany, 2013, 9(2), 96-99. 
 124 
141. K.S. Poornima, M. Chandregowda, T.N. Pushpa, D. Srikantaprasad, Studies 
on effect of growth regulators on rooting of two rosemary types and estimation 
of biochemical changes associated with rooting, Medicine Crop Research, 
2012, 43 (1, 2, 3), 245 - 248. 
142. W. Szypula, P. Mistrzak, O. Olszowska O, A new and fast method to obtain in 
vitro cultures of Huperzia selago (Huperziaceae) sporophytes, a club moss 
which is a source of Huperzine A, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 
2013, 82 (4), 313-320. 
PHỤ LỤC 
Phụ lục 1 
Môi trường nuôi cấy 
1.1. Thành phần môi trường MS (Murashige & skoog, 1962) 
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) Hàm lượng (µM) 
1 Các 
nguyên 
tố đa 
lượng 
CaCl2 332,02 2,99 
2 KH2PO4 170,00 1,25 
3 KNO3 1900,00 18,79 
4 MgSO4 180,54 1,50 
5 NH4NO3 1650,00 20,61 
6 
Các 
nguyên 
tố vi 
lượng 
CoCl2.6H2O 0,025 0,11 
7 CuSO4.5H2O 0,025 0,10 
8 FeNaEDTA 36,70 100,00 
9 H3BO3 6,20 100,27 
10 KI 0,83 5,00 
11 MnSO4.H2O 16,90 100,00 
12 Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 
13 ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 
14 
Các 
vitamin 
Glycin 2,00 26,64 
15 Myo-inositol 100,00 554,94 
16 Axit nicotinic 0,50 4,06 
17 Pyridoxine HCl 0,50 2,43 
18 Thiamin HCl 0,10 0,30 
1.2. Môi trường Woody Plant medium (WPM) (Lloyd & McCown, 1980) 
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) µM 
1 
Các 
nguyên 
tố đa 
lượng 
CaCl2 72,50 0,65 
2 Ca(NO3)2 
.4H2O 
471,26 2,35 
3 KH2PO4 170,00 1,25 
4 K2SO4 990,00 5,68 
5 MgSO4 180,54 1,50 
6 NH4NO3 400,00 5,00 
7 
Các 
nguyên 
tố vi 
lượng 
CuSO4.5H2O 0,25 1,00 
8 FeNaEDTA 36,70 100,00 
9 H3BO3 6,20 100,27 
10 MnSO4.H2O 22,30 131,94 
11 Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 
12 ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 
13 
Các 
vitamin 
Glycine 2,00 26,64 
14 myo-Inositol 100,00 554,94 
15 Nicotinic acid 0,50 4,06 
16 Pyridoxine HCl 0,50 2,43 
17 Thiamine HCl 1,00 2,96 
1.3. Môi trường Gamborg B5 
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) µM 
1 Các 
nguyên 
tố đa 
lượng 
CaCl2 113,23 1,02 
2 KNO3 2500,00 24,73 
3 MgSO4 121,56 1,01 
4 NaH2PO4 130,44 1,09 
5 (NH4)2SO4 134,00 1,01 
6 
Các 
nguyên 
tố vi 
lượng 
CoCl2.6H2O 0,025 0,11 
7 CuSO4.5H2O 0,025 0,10 
8 FeNaEDTA 36,70 100,00 
9 H3BO3 3,00 48,52 
10 KI 0,75 4,52 
11 MnSO4.H2O 10,00 59,16 
12 Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 
13 ZnSO4.7H2O 2,00 6,96 
14 
Các 
vitamin 
myo-Inositol 100,00 554,94 
15 Nicotinic acid 1,00 8,12 
16 Pyridoxine HCl 1,00 4,86 
17 Thiamine HCl 10,00 29,65 
Phụ lục 2 
Kết quả chạy RAPD-PCR 
1. Kết quả tách ADN tổng số 
Kết quả điện di tách chiết ADN tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. 
1: Mẫu SP1; 2: Mẫu SP2; 3: Mẫu SP3; 4: Mẫu SP4; 5: Mẫu SP5; 6: Mẫu DL1; 7: 
Mẫu DL2; 8: Mẫu DL3. M: Marker 1kb. 
2. Kết quả đo nồng độ ADN ở bước sóng OD260 nm /OD280 nm 
Thứ tự mẫu OD260nm OD280nm OD260/ OD280 Nồng độ ADN (ng/µl) 
SP1 0,0097 0,0051 1,90 97 
SP2 0,009 0,0046 1,96 90 
SP3 0,0087 0,0048 1,81 87 
SP4 0,0093 0,0049 1,90 93 
SP5 0,0103 0,0056 1,84 103 
DL1 0,0101 0,0053 1,91 101 
DL2 0,0107 0,0055 1,95 107 
DL3 0,0109 0,006 1,82 109 
3. Các sản phẩm RAPD-PCR 
3.1. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB20 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB20 
(2 băng, 2 đa hình). 
3.2. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB15 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB15 (6 
băng, 2 đa hình). 
3.3. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC19 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC19 (4 
băng, 3 đa hình). 
3.4. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB18 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB18 (3 
băng, 1 đa hình). 
3.5. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC10 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC10 (2 
băng, 1 đa hình). 
3.6. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC13 
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC13 (3 
băng, 2 đa hình). 
3.7. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB13 
Sản phẩm PCR của ADN genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB13 (1 
băng, không đa hình). 
3.8. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC1 
Sản phẩm PCR của ADN genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC1 (5 
băng, 4 đa hình). 
(Chú thích đối với tất cả các sản phẩm RAPD-PCR: M: marker 1 kb (Fermentas); 
1-3: Mẫu DL1- DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 - SP5. 
Phụ lục 3 
Một số hình ảnh nghiên cứu và nhân giống cây Thạch tùng răng cưa 
1. Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên 
Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt 
A B C 
Hình ảnh lá (A) và bào tử (B, C) của Thạch tùng răng cưa 
Cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên bị cắt mất phần thân phía trên. 
Ảnh đi thực địa trong rừng tại Lâm Đồng của nhóm nghiên cứu 
Đo hình thái Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên tại Lào Cai (A, B) và Lâm Đồng (C). 
2. Một số hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa trong quá trình nghiên cứu tại 
phòng thí nghiệm 
A B. 
Một số hình ảnh đo đạc cây trong phòng thí nghiệm 
A B 
C 
C. D 
Một số hình ảnh đo đạc cây trong phòng thí nghiệm 
Một số hình ảnh lá và đo lá Thạch tùng răng cưa 
Mẫu bào tử thu tại Lào Cai đang được đưa vào khử trùng. 
3. Một số hình ảnh về nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình 
thức giâm hom thân 
Hom thân Thạch tùng răng cưa được lựa chọn trong thí nghiệm về ảnh hưởng của 
chiều cao hom thân đến sinh trưởng cây con. 
Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng α-NAA nồng độ cao 
Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng IBA 
Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng α - NAA nồng độ thấp 
Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng IAA nồng độ thấp 
Giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai (hom thân dài 6 cm, sử dụng chất 
điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2, độ sâu hom 
thân giâm xuống đất 3,5 cm). 
Giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng (hom thân dài 6 cm, sử dụng 
chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2, độ sâu 
hom thân giâm xuống đất 3,5 cm) 
Một số hom thân giâm Thạch tùng răng cưa được thử nghiệm xuất vườn ươm sau 6 
tháng giâm hom thân tại Lâm Đồng 
Vườn ươm Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng 
Vườn ươm Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai 
4. Một số hình ảnh về nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình 
thức nuôi cấy mô 
Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa bắt đầu nuôi cấy mô. 
Hình ảnh Thạch tùng răng cưa tạo đa chồi 
Mô sẹo chuyển từ mầu trắng đục sang màu xanh xám và xuất hiện đa chồi 
Hình ảnh đa chồi của cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2020 
 Cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2020 
A B C 
Phụ lục 4 
Một số hình ảnh về TLC và HPLC 
1. Hình ảnh về chạy sắc kí bản mỏng 
Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại SP1A. 
1. HupA chuẩn, 2. Mẫu mùa xuân, 3. Mẫu mùa thu. 
2. Đường chuẩn định lượng HupA 
3. Một số hình ảnh về sắc kí đồ định lượng HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng 
cưa từ 8 điểm lấy mẫu tại Lào Cai và Lâm Đồng. 
A 
Sắc kí đồ định lượng HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa từ 8 điểm lấy mẫu 
vò mùa thu. Ghi chú: A: Mẫu chất chuẩn, B - F: Mẫu SP1A - Mẫu SP5A, G - I: 
Mẫu DL1A- Mẫu DL3A. 
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở DL3A năm 2016. 
A. Mẫu thu hái vào mùa thu, B. Mẫu thu hái vào mùa xuân 
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở Lào Cai 
năm 2017. 
A. Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A. 
A 
B 
C 
D 
 HupA 
 HupA 
 HupA 
 HupA 
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở Lào Cai năm 2016. 
A. Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A. 
A 
 HupA 
B 
 HupA 
C 
 HupA 
D 
 HupA