Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc - Xin phòng bệnh cho cá mú (epinephelus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
--------------- 
 NGUYỄN THỊ THANH 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY 
HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP 
LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC- XIN PHÒNG BỆNH CHO 
CÁ MÚ (Epinephelus spp.) 
 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
 Hà Nội, năm 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
 --------------- 
NGUYỄN THỊ THANH 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT 
GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ 
HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH 
CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
 Mã số: 9420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
 Người hướng dẫn khoa học: 
PGS.TS. Phạm Công Hoạt 
 PGS.TS. Lê Văn Năm 
Hà Nội, năm 2018
i 
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn 
bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng 
được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các 
thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. 
 Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 
 Tác giả luận án 
 Nguyễn Thị Thanh 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
 Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ 
từ các tổ chức và cá nhân. 
 Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Công 
Hoạt (Bộ Khoa học và Công nghệ), PGS. TS. Lê Văn Năm (Hội đồng chức 
danh giáo sư nhà nước), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học và Hợp tác 
quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp 
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. 
 Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính, cơ sở vật chất, 
trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15. Tôi xin cảm ơn 
tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện 
Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ 
trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. 
 Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến 
khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp 
đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành 
công trình nghiên cứu này. 
Tôi xin chân thành cảm ơn! 
 Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 
 Tác giả luận án 
 Nguyễn Thị Thanh 
iii 
MỤC LỤC 
Lời cam đoan ...................................................................................................... i 
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii 
Mục lục ............................................................................................................. iii 
Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................... vii 
Danh mục bảng................................................................................................. ix 
Danh mục hình .................................................................................................. x 
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú ....................................................... 4 
1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú ....................................................................... 4 
1.1.2. Đặc điểm phân bố .................................................................................... 4 
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng .............................................................................. 5 
1.1.4. Đặc điểm sinh sản ................................................................................... 6 
1.1.5. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú ......................................................... 6 
1.2. Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú ..................................................... 7 
1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam10 
1.3.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển....................................10 
1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới ................ 12 
1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam .......... 15 
1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá ................ 17 
1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ...................................... 21 
1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú .................... 25 
1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá27 
1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh .................................. 27 
1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới ................ 30 
1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam ............... 34 
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 37 
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................ 37 
iv 
2.2. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................38 
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38 
2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần 
kinh trên cá mú ................................................................................................ 38 
2.3.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu ........................................................... 38 
2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học ................................................................. 38 
2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào....... 39 
2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số ................................................. 40 
2.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)..............................41 
2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose ................................................... 41 
2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: ............................................................... 41 
2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh 
(NNV) .............................................................................................................. 45 
2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1................ 45 
2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú ......................... 46 
2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút 
trên tế bào GS1 ................................................................................................ 47 
2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi 
rút trên cá mú ................................................................................................... 48 
2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh 
giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ............................... 48 
2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen ................. 48 
2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+.......................................................... 49 
2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109 ............................................................ 49 
2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm 
tra bằng PCR và enzyme giới hạn. .................................................................. 50 
2.3.3.5 Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 ............ 51 
2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE ...................................................... 51 
2.3.3.7. Phương pháp Western blot ................................................................. 52 
v 
2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng 
nguyên tái tổ hợp ............................................................................................. 53 
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 56 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 57 
3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam ..... 57 
3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương 
pháp mô bệnh học ........................................................................................... 57 
3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương 
pháp RT-PCR .................................................................................................. 59 
3.1.3. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào ..................................................... 62 
3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV. ......................... 67 
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 
trên cá mú ........................................................................................................ 72 
3.2.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào mẫn cảm72 
3.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú ............ 73 
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử 
thần kinh trên tế bào GS1. ............................................................................ 75 
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử 
thần kinh trên cá mú ........................................................................................ 77 
3.3. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin 
phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. ....................................................... 80 
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 ................................................ 80 
3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh85 
3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng 
nguyên của NNV ............................................................................................. 85 
3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp ............................. 87 
3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi 
rút gây bệnh hoại tử thần kinh ......................................................................... 92 
3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp ....................................................... 95 
vi 
3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ........... 97 
3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên 
thỏ .................................................................................................................... 97 
3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ 
hợp trên cá mú ............................................................................................... 100 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 104 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ ........................................................................................... 
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... 
vii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Giải thích 
aa Amino axit 
BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử 
thần kinh trên cá bơn) 
bp Base pair (cặp bazơ) 
BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò) 
cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit 
Deoxyribonucleic acid bổ sung) 
CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào) 
CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương) 
cs Cộng sự 
Da Dalton 
DAB Diamino bezidine (kit làm hiện màu) 
DNA Deoxyribonucleic acid 
EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid 
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch 
liên kết enzyme) 
 EtBr Ethidium Bromide 
FCS fetal calf serum (Huyết thanh bào thai bê) 
HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) 
kb kilobase 
KDa Kilodalton 
GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản 
toàn cầu) 
GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú) 
IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside 
Ig Immunoglobulin (kháng thể) 
viii 
LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào) 
LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) 
NCR Non coding region 
ND Not done (không đánh giá) 
NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh) 
nt nucleotid 
OD Optical Density (mật độ quang) 
ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) 
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel 
polyacrylamide) 
PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime) 
PVDF Polyvinylidene Fluoride 
RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại 
tử thần kinh trên cá mú chấm đỏ) 
RNA Ribonucleic acid 
RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược) 
SDS Sodium dodecyl sulphase 
SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần 
kinh trên cá măng sọc) 
TAE Tris - acetate - EDTA 
TBS Tris Buffer Saline 
TBST TBS - Tween 
TCID50 Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào) 
TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần 
kinh trên cá nóc hổ) 
UV Ultraviolet light 
VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút) 
VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh) 
ix 
DANH MỤC BẢNG 
Thứ tự 
bảng 
Tên bảng Trang 
1.1 
Vùng địa lý và sự phân bố một số loài cá mú có biểu hiện 
bệnh hoại tử thần kinh 
13 
1.2 Các kiểu gen của Betanodavirus 23 
1.3 Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA 33 
1.4 Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 34 
3.1 Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mô bệnh học 58 
3.2 
Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp 
RT-PCR 
60 
3.3 Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 65 
3.4 
So sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 thu được 
với các trình tự của GenBank 
70 
3.5 
Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào 
GS1 
73 
3.6 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 74 
3.7 Phát hiện gen mã hoá kháng nguyên T4 của NNV trên cá mú 75 
3.8 
Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở nhiệt độ 28oC cả 
ngày và đêm 
78 
3.9 
Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 
24
oC ban đêm 
79 
3.10 
Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 
kinh ở mô hình in vitro 
97 
3.11 
Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 
kinh ở mô hình in vivo 
99 
3.12 
Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá ... calcarifer for virus isolation”, Aquaculture. 192, p 133–145. 
24. Chi SC., Shieh JR., Lin SC (2003), “Genetic and antigenic analysis of 
betanodaviruses isolated from aquatic organisms in Taiwan”, Diseases of 
Aquatic Organisms, p. 221–228. 
25. Cho HS., Seo JY., Park SI., Kim TG., Kim TJ (2018), “Oral immunization 
with recombinant protein antigen expressed in tobacco against fish nervous 
necrosis virus”, J Vet Med Sci. 80(2):272–279. 
 26. Christie KE (1997), “Immunization with viral antigents: Infectious 
pancreatic necrosis”, In: Fish Vaccinology; Developments in Biological 
Standardizationn. Basel, Karger, 90. 191–199. 
27. Chen YM., Wang TY., Chen TY (2014), “Immunity to betanodavirus 
infections of marine fish”, Dev Comp Immunol, 43 (2): 174–183. Dol: 
10.1016/j. 
28. Comps M., Trindad M., Delsert C (1996), “Investigation of fish 
encenphalitis viruses expression in marine fishes using DIG-labeled probes”, 
Aquaculture. 143, p 113–121. 
29. Costa JZ., Thompson KD (2016), “Understanding the interaction between 
Betanodavirus and its host for the development of prophylactic measures for 
viral encephalopathy and retinopathy”, Fish Shellfish Immunol 53:35–49. 
30. Danayadol Y., Direkbusarakom S., Supamattaya K (1995), “Viral nervous 
necrosis in brown- spotted grouper Epinephelus malabaricus culture in 
Thailand”, In: Diseases in Asian Aquaculture II. Fish Health Section, Asian 
Fisheries Society, Manila, p 227–233. 
31. Doan QK., Vandeputte M., Chatain B., Morin T., Allal F (2017), “Viral 
encephalopathy in aquaculture: a review”, J Fish Dis ; 40 (5): 717–742. 
32. Frerichs GN., Tweedie A., Starkey WG., Richards RH (2000), 
“Temperature, pH and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfection 
inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy virus”, 
Aquaculture 185, p 13–24. 
33. Fukuda Y., Nguyen HD., Furuhashti M., Nakai T (1996), “Mass mortality 
of cultured sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, associated with 
viral nervour necrosis”, Fish Pathol; 31: 165–170. 
34. Grotmol S., Totland GK (2000), “Surface disinfection of Atlantic halibut 
Hippoglossus hippoglossus with ozonated sea-water inactivates nodavirus and 
increases survival of the larvae”, Dis. Aquat. Org.39, 89–96. 
 35. Gye HJ., Nishizawa T (2013), “Assessment of the sevenband 
grouper Epinephelus septemfasciatus with a live nervous necrosis virus 
(NNV) vaccine at natural seawater temperature”, Vaccine Volume 31, 
Issue 16, 12 April 
36. Hegde A (2003), Characterization and immunological studies of fish 
nervour necrosis virus, A thesis submitted for the degree of doctor of 
philosophy department of Biological sciences National University of 
Singapore. 
37. Heppell J., Heather L (2000), “Application of DNA vaccine technology to 
aquaculture”, Davis Advanced Drug Delivery Reviews 43, p. 29–43 
38. Husgard S., Grotmol S., Hjeltnes BK., Rodseth OM., Biering E (2001), 
“Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous 
necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and evaluation of a 
vaccine againts SJNNV”, Dis. Aquaculture. Org. 45, 33–44. 
39. Iwamoto T., Nakai T., Mori K., Arimoto M., Furusawa I (2000), “Cloning 
of fish cell line SSN-1 for piscine nodaviruses”, Dis. Aquat. Org. 43, 81–89. 
40. Kai YH., Su H., Tai J., Chi SC (2010), “Vaccination of grouper broodfish 
(Epinephelus tukula) reduces the risk of vertical transmission by nervous 
necrosis virus”, Vaccine 28: p 996 – 1001. 
41. Kim JO., Kim WS., Oh MJ (2015), “Development of a Recombinant 
Protein Vaccine Based on Cell-Free Protein Synthesis for Sevenband Grouper 
(Epinephelus septemfasciatus) Against Viral Nervous Necrosis”, J. 
Microbiol. Biotechnol, 25(10), 1761–1767 
42. Lai YS., Chiu HC., Murali S., Guo IC., Chen SC., Fang K., Chang CY 
(2001), “In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow 
grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus 
infection in yellow grouper Epinephelus awoara”, J. Fish Dis.24, 237–244. 
 43. Lorenzen N., LaPatra SE (2005), “DNA vaccines for aquacultured fish”, 
Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (1), 201–213 
44. Munday BL., Kwang J., Moody N (2002), “Betanodavirus infections of 
teleost fish: a review”, J. Fish Dis. 25, 127–142. 
45. Muroga K (1995), “Viral and bacteria diseases in larval and juvenile 
marine fish and shellfish: a review”, Fish Pathol. 30, 71 – 85 
46. Nakai T., Mori T., Nishizawa T., Muroga K (1995), “Viral nervous 
necrosis of larval and juvenile marine fish”, Proceedings of the international 
Symposium on Biotechnology Aplication In Aquaculture. Asian Fish. p147–
152 
47. Nakai T (2000), “Recent advances in the diagnosis and control of viral 
nervous necrosis (VNN) in groupers”, In: Development of a regional research 
program on grouper virus transmission and vaccine development, Bangkok. P 
18–20. 
48. Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Muroga K (1997), “Genomic 
classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the 
coat protein gene”, Applied and Environmental Microbiology 63, 1633–1636. 
49. Nishizawa T., Gye HJ., Takami I., Oh MJ (2012), “Potentiality of a live 
vaccine with nervous necrosis virus (NNV) for sevenband grouper 
Epinephelus septemfasciatus at a low rearing temperature”, Vaccine; 30 (6): 
1056–63. 
50. Oh MJ., Gye HJ., Nishizawa T (2013), “Assessment of the sevenband 
grouper Epinephelus septemfasciatus with a live nervous necrosis virus 
(NNV) vaccine at natural seawater temperature”, Vaccine; 31 (16): 0025–7. 
51. Pakingking JR., Bautista NB., de Jesus-Ayson EG., Reyes O (2010), 
“Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-marbled 
grouper (Epinephelus fuscogutattus) following vaccination with inactivated 
betanodavirus”, Fish and Shellfih Immunology 28: 525–533 
 52. Pasnik DJ., Smith SA (2005), “Immunogenic and protective effects of a 
DNA vaccine for Mycobacterium marinum in fish”, Immunopathol, 103 (3-
4), 195–206. 
53. Peducasse S., Castric R., Thiery R., Jeffroy J., Le VA; Baudin L (1999), 
“Compare studies of viral encenphalopathy and retinopathy in juvenile sea 
bass Dicentrarchus labrax infected in different ways”, Dis. Aquat. Org. 36, p 
11 – 20. 
54. Purcell MK., Kurath G., Garvet KA., Herwig RP., Winton JR (2004), 
“Quantitative expression profiling of immune response genes in rainbown 
trout following infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) infection or 
DNA vaccination”, Fish Sellfish. Immunol, 17 (5). 447–462. 
55. Qin QW., Wu TH., Jia TL., Hegde A., Zhang RQ (2006), “Development 
and characterization of a new tropical marine fish cell line from grouper, 
Epinephelus coioides susceptible to iridovirus and nodavirus”, J. Virol. 
Methods 131, 58–64. 
56. Ransangan J., Manin BO., Lal TMM., Lu KC, Sade A., Azila A (2013), 
“Betanodavirus Infection in Marine Fish Aquaculture in Malaysia”, Research 
Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences , ISSN 2320 – 6535. 
Vol. 1(7), p 10–15. 
57. Reed LT., Muench H (1938), A simple method of estimating fifty percent 
end points, The American Journal of Hygienne: p 493–497. 
58. Rimmer MA., Phillips MJ., Sim SY (2006), “Aquaculture of groupers in 
Asia and the Pacific”, In: Proceedings Economics and marketing of the live 
reef fish trade in Asia–Pacific, Noumea, ACIAR Working Paper No. p. 116–
134. 
59. Roy PE., Yanong (2010), “Viral nervous necrosis (betanodavirus) 
infections in fish”, University of Florida. 
 60. Russell PH., Kanellos T., Negrou M., Ambali AG (2000), “Antibody 
responses of goldfish (Carassius auratus) DNA immunization at different 
temperatures and feeding levels”, Vaccine, 18, 2331–2336. 
61. Sambrook J., Russell DW (2001), Molecular cloning: a laboratory 
manual, CSHL Press. 
62. Setty M., Maiti B., Santhosh KS., Venugopal MN., Karunasagar I (2012), 
“Betanodavirus of Marine and Freshwater Fish: Distribution, Genomic 
Organization, Diagnosis and Control Measures”, ndian J Virol; 23(2): 114–
123. 
63. Sohn SG., Park MA (1998), “Viral diseases of cultured marine fish and 
shrimp in Korea”, Fish Pathol. 33, 189–192. 
64. Sommerset I., Skern R., Biering E., Bleie H., Fiksdal IU., Nerland AH 
(2005), “Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by 
recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination”, 
Fish Sellfish Immunol, 18 (1), 13–29. 
65. Tanaka S., Mori K., Arimoto M., Arimoto T., Nakai T (2001), “Protective 
immunity of sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus Thunberg, 
against experimental viral nervous necrosis”, J. Fish. Dis. 24, 15–22. 
66. Toffan A., Panzarin V., Toson M., Cecchettin K., Pascoli F (2016), 
“Water temprature affects pathogenicity of different betanodavirus genotypes 
in experimentally challenged Dicentrarchus labrax”, Dis Aquat Organ, 119 
(3):231–6. 
67. Tveteras R (2016), “Global Fish Production Data & Analysis”, University 
of Stavanger, Global outlook for Aquaculture leadership. Global Aquaculture 
Alliance 2016. 
68. Watanabe K., Nishizawa T., Yoshimuzu M (2000), “Selection of 
broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with 
recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis. Aqua. 
Org.41, 219–223 
 69. Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T (2009), “Neutralizing 
antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband 
grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an 
inactivated virus vaccine”, J Fish Dis. 32(9):767–75. 
70. Yuasa K., Koesharyani I., Roza D., Mori K., Katata M., Nakai T (2002), 
“Immune response of humpback grouper Cromileptes altivelis, injected with 
the recombinant coat protein of betanodavirus”, J. Fish Dis. 25: 53–56 
71. Zafran HT., Yuasa K., Hatai K (2001), “Viral nervos necrosis in 
humpback grouper Chromileptes altivelis larvae and Juveniles”, Fish Pathol. 
35, 95–96. 
TÀI LIỆU WEBSITE 
72. 
trong-cho-nganh-thuy-san.htm 
73. https://nongnghiep.vn/quang-ngai-nhan-rong-mo-hinh-nuoi-ca-mu-trong-
long-post209956.html 
74. https://baotintuc.vn/kinh-te/phat-trien-nghe-nuoi-ca-long-be-tren-bien-
20180221091402318.htm 
 PHỤ LỤC 
Phụ lục 1: Đặc điểm các mẫu bệnh phẩm 
STT Ký hiệu mẫu Não Mắt Biểu hiện lâm sàng Gen T4 
1 QN1 - - A B - 
2 QN2 ++++ +++ A B C D + 
3 QN3 - - A B - 
4 QN4 ++++ +++ A B C D + 
5 QN5 - - A B - 
6 QN6 - - A B - 
7 QN7 +++ ++ A B C D - 
8 QN8 - - A B - 
9 HP1 - - A B - 
10 HP2 ++ + A B + 
11 HP3 - - A B - 
12 HP4 +++ +++ A B C D + 
13 HP5 +++ +++ A B C D - 
14 HP6 - - A B + 
15 HP7 - - A B + 
16 HP8 +++ +++ A B C D + 
17 HP9 - - A B - 
18 HP10 + - A B + 
19 HP11 - - A B + 
 20 NĐ1 +++ +++ A B C D + 
21 NĐ2 - - A B - 
22 NĐ3 + - A B + 
23 NĐ4 +++ +++ A B C D + 
24 NĐ5 +++ +++ A B C D + 
25 NĐ6 - - A B - 
26 NĐ7 + - A B + 
27 NĐ8 + - A B + 
28 NĐ9 - - A B - 
29 NĐ10 +++ +++ A B C D + 
30 NĐ11 +++ +++ A B C D + 
31 KH1 - - A B - 
32 KH2 - - A B - 
33 KH3 - - A B - 
34 KH4 +++ ++ A B C D + 
35 KH 5 +++ +++ A B C D + 
36 KH6 + - A B - 
37 KH7 - - A B - 
38 KH8 - - A B - 
39 KH9 + - A B + 
40 BT1 + - A B - 
41 BT2 +++ +++ A B C D + 
 42 BT3 - - A B + 
43 BT4 +++ +++ A B C D + 
44 BT5 - - A B - 
45 BT6 - - A B - 
46 BT7 + - A B + 
47 BT8 - - A B - 
48 BT9 +++ +++ A B C D + 
49 BT10 - - A B + 
50 BT11 - - A B - 
51 BT12 +++ ++ A B C D + 
Ghi chú: 
A: Bỏ ăn 
B: Bơi tách đàn, màu sắc cơ thể đen tối 
C: Mắt lồi, bóng hơi căng, ruột chứa dịch 
D: Bơi ngửa, bơi xoay tròn, có hiện tượng chết 
(-): Không có CPE ở mô não, mô mắt; không có gen T4 
(+): Có gen T4 
(++): CPE > 50% 
(+++): CPE > 85% 
(++++): CPE > 98%, có hiện tượng tan bào 
 Phụ lục 2: Một số phương pháp đã sử dụng trong luận án 
1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 
Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA 
theo nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn: 
Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi cDNA, 
sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA. 
Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng 
 Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên 
mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuếch 
đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết. 
Để khuếch đại trình tự T4 của RNA-2 dài 421 bp của E. fuscogutatus 
và E.akaara, dựa trên trình tự của GenBank chúng tôi đã thiết kế cặp mồi 
gồm: 
P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và 
P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’) 
Thành phần phản ứng 
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 
RT-PCR buffer 
Q- solution 
dNTP 
Enzyme DNA-polymerase 
Mồi: P1-P2 
RNA temperlate 
RNase- free water 
10 
10 
2 
2 
0,6 
5 
19,8 
Tổng 50 
Chu trình nhiệt 
RT: 50ºC/ 30phút 
PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút 
- 94ºC/ 30s 
- 60ºC/30s 30 cycle 
- 72ºC/ 1p 
- 72º C/ 5p 
 2. Phương pháp điện di trên gel agarose 
Theo phương pháp của Sambrook J, Russel DW. (2001). 
 + Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy và bổ sung 1µl EtBr rồi đổ vào 
khuôn gel đã lắp sẵn lược để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel 
đã nguội hoàn toàn thì rút lược và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, 
sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel. 
+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA), 
trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử DNA lắng 
xuống trong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel. 
 + Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút. 
 + Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới 
ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm. 
3. Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose. 
Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành 
tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA 
Cloning Kit của hãng Invitrogen với các bước như sau: 
1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn. 
2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 
10: 60 (mg/ µl) trong ống vô trùng 5ml. 
3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy 
hết. 
4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C. 
5. Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc. 
6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn đều rồi 
ủ ở nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía 
dưới. 
7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 
phút. 
 8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột 
tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml. 
9. Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 
1 phút. 
10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu 
hồi các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C. 
 Phụ lục 3: Kết quả so sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 
với các trình tự của GenBank