Luận án Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
NGUYỄN THỊ NHUNG 
NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ 
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM 
BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Hà Nội, 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
NGUYỄN THỊ NHUNG 
NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ 
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM 
BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO 
 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
 Mã số: 9 42 02 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
 1. TS. Bùi Xuân Nguyên 
 2. TS. Nguyễn Việt Linh 
Hà Nội, 2021 
i 
LỜI CẢM ƠN 
 Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Nguyên, Nguyên Trưởng 
Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS. Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng 
Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ 
thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. 
 Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công 
nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được 
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. 
 Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và Công 
nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn 
thành các thủ tục liên quan đến luận án. 
 Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị Ước, Phòng công nghệ Phôi, 
Viện công nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những ngày 
đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Ước đã góp một phần rất 
lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà còn trong suốt thời gian làm việc của 
tôi. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm 
nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh 
học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến 
sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phòng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, 
Viện chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và 
thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ 
Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn 
kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án. 
 Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công 
nghệ sinh học cùng các cán bộ Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã có 
những góp ý để tôi hoàn chỉnh luận án. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa 
học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn 
ii 
tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học 
viện. 
 Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo 
điểu kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án. 
 Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động 
viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn./. 
 Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 
 Tác giả 
 NCS. Nguyễn Thị Nhung 
iii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan 
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự 
khác; 
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố 
trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác 
giả; 
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. 
 Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 
 Tác giả 
 NCS. Nguyễn Thị Nhung 
iv 
MỤC LỤC 
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... i 
LỜI CAM ĐOAN ĐOAN............................................................................... iii 
MỤC LỤC ....................................................................................................... iv 
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ........................................................................ viii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................ x 
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU.............................................. 4 
1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh 
và phát triển phôi in vivo ở lợn....................................................... 4 
1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn................... 4 
1.1.2. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo......................................... 9 
1.1.3. Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn....................... 12 
1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro................................... 15 
1.2.1. Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên 
liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục............................................. 15 
1.2.2. Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ 
thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi.................................... 19 
1.2.3. Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT.................................... 26 
1.3. Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro............................................. 32 
1.3.1. Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản........................... 32 
1.3.2. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt 
Nam.................................................................................................... 33 
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP................................................. 35 
2.1. Vật liệu, hoá chất nghiên cứu......................................................... 35 
2.1.1. Mẫu nghiên cứu................................................................................. 35 
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................... 36 
v 
2.1.3. Hóa chất và thiết bị............................................................................ 36 
2.1.4. Thiết bị nghiên cứu............................................................................ 36 
2.1.5. Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản........................................... 37 
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................ 37 
2.2.1. Phân loại tháng theo mùa................................................................... 37 
2.2.2. Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng........................................... 37 
2.2.3. Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng.................. 37 
2.2.4. Phương pháp phân chia nhóm nang................................................... 37 
2.2.5. Phương pháp thu trứng...................................................................... 38 
2.2.6. Phương pháp phân loại chất lượng trứng........................................... 38 
2.2.7. Phương pháp đo kích thước trứng lợn............................................... 39 
2.2.8. Phương pháp nuôi trứng.................................................................... 39 
2.2.9. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi ...................................... 40 
2.2.10. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh........................................... 40 
2.2.11. Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh......... 42 
2.2.12. Phương pháp TTON..................................................... 43 
2.2.13. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh.......................................... 44 
2.2.14. Phương pháp đông lạnh phôi............................................................. 44 
2.2.15. Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn................................... 45 
2.2.16. Phương pháp nhân nuôi tế bào........................................................... 45 
2.2.17. Phương pháp đông lạnh tế bào........................................................... 46 
2.2.18. Phương pháp NBVT (NBVT) ........................................... 46 
2.2.19. Phương pháp nuôi phôi...................................................................... 49 
2.2.20. Phương pháp nhuộm Hoechst............................................................ 49 
2.2.21. Phương pháp nhuộm Orcein.............................................................. 50 
2.2.22. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu............................................. 50 
vi 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 54 
3.1. Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 
ở lợn Bản theo mùa......................................................................... 
54 
3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa........ 54 
3.1.2. Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản........................................ 56 
3.1.3. Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 
lợn Bản............................................................................................... 
59 
3.2. Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản ................... 65 
3.2.1. Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản.. 65 
3.2.2. Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục 
 trứng lợn Bản...................................................................................... 
68 
3.3. Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON................... 72 
3.3.1. Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản................................................... 73 
3.3.2. Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu..................................................... 78 
3.3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 
triển phôi............................................................................................ 
84 
3.3.4. Đông lạnh phôi TTON....................................................................... 89 
3.4. Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT................................ 91 
3.4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace............ 91 
3.4.2. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace..................................... 94 
3.4.3. Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT........................................... 96 
3.4.4. Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT....................................................... 97 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 107 
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN 
ĐẾN ĐỀ TÀI................................................................................................... 
109 
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 110 
PHỤ LỤC.......................................................................................................... 1 
vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa .............................................. 54 
Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước ............................................... 57 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản...60 
Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm) ................................................................ 62 
Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản .............................................................. 66 
Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản .................................................... 67 
Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu ...................................................................... 73 
Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh .................................................... 74 
Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh .................. 77 
Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng....................................................79 
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .80 
Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ 
cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau ................................. 81 
Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi .....85 
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn 
Bản sau thụ tinh ..................................................................................... 86 
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn 
Bản sau thụ tinh ..................................................................................... 86 
Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON ............................................................... 89 
Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace ............................................. 913 
Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi 
trường nuôi............................................................................................94 
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT... 96 
Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi 
trường nuôi ......................................................................................... ...97 
viii 
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 
Hình 1.1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật 
có vú............................................................................................... 5 
Hình 1.2. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình 
 giảm phân...................................................................................... 6 
Hình 1.3. Quá trình thành thục của trứng lợn. .............................................. 7 
Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với 
 nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng............ 10 
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn........................................... 11 
Hình 1.6. Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10......................... 12 
Hình 1.7. Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự 
 thành thục của trứng động vật có vú............................................. 19 
Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic...................................... 24 
Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT.............................................................. 27 
Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng.................................................................... 43 
Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim........................... ... Biology, Interaction between growing oocytes 
and granulosa cells in vitro, Reproductive Medicine and Biology, 2020, 19.1: 
13-23. 
171. T. Somfai, M. Ozawa, J. Noguchi, H. Kaneko, N.W.K. Karja, M. Fahrudin, 
127 
M. Nakai, N. Maedomari, A. Dinnyés, T. Nagai, In vitro development of 
polyspermic porcine oocytes: Relationship between early fragmentation and 
excessive number of penetrating spermatozoa, Animal reproduction science, 
2008, 107.1-2: 131-147. 
172. N.V. Linh, T. Somfai, T.H. Nguyen, N.T. Nhung, N.T. Hong, N.T. Dat, N.H. 
Thinh, N.K. Van, D.V. Quyen, H.H. Chu, Optimization of the in vitro 
fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low fertilization ability 
in Ban—A native Vietnamese pigs, Animal Science Journal, 2018, 89.8: 1079-
1084. 
173. M. Suzuki, K. Misumi, M. Ozawa, J. Noguchi, H. Kaneko, K. Ohnuma, D. 
Fuchimoto, A. Onishi, M. Iwamoto, N. Saito, Successful piglet production by 
IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal 
bovine serum, Theriogenology, 2006, 65.2: 374-386. 
174. G.S. Im, L. Lai, Z. Liu, Y. Hao, D. Wax, A. Bonk, R.S. Prather, In vitro 
development of preimplantation porcine nuclear transfer embryos cultured in 
different media and gas atmospheres, Theriogenology, 2004, 61.6: 1125-1135. 
175. K.P. Brüssow, H. Torner, W. Kanitz, J. Rátky, In vitro technologies related to 
pig embryo transfer, Reproduction Nutrition Development, 2000, 40.5: 469-
480. 
176. C. Zijlstra, A. Kidson, E. Schoevers, A. Daemen, T. Tharasanit, E. Kuijk, W. 
Hazeleger, D. Ducro-Steverink, B. Colenbrander, B.J.T. Roelen, Blastocyst 
morphology, actin cytoskeleton quality and chromosome content are 
correlated with embryo quality in the pig, Theriogenology, 2008, 70.6: 923-
935. 
177. D. Bourc'His, D. Le Bourhis, D. Patin, A. Niveleau, P. Comizzoli, J.P. Renard, 
E.J.C.B. Viegas-Pequignot, Delayed and incomplete reprogramming of 
chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos, Current Biology, 
2001, 11.19: 1542-1546. 
178. W. Dean, F. Santos, M. Stojkovic, V. Zakhartchenko, J. Walter, E. Wolf, W.J. 
Reik, Conservation of methylation reprogramming in mammalian 
128 
development: aberrant reprogramming in cloned embryos, National Academy 
of Sciences, 2001, 98.24: 13734-13738. 
179. Y.K. Kang, D.B. Koo, J.S. Park, Y.H. Choi, A.S. Chung, K.K. Lee, Y.M.J. 
Han, Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos, Nature 
genetics, 2001, 28.2: 173-177. 
1 
PHỤ LỤC 1. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 
Tên thiết bị Hãng Mã 
Tủ-20oC Nihon Freezer 
GS-3120HC20H 
828993379 
Tủ-80oC Nihon Freezer 
CLN-32UD215121 
32UD21512143 
Tủ stock Alaska 16-3-003712 
Bình nitơ Nhật Serial No. 001236 
Bể ổn nhiệt Nhật (ASONE) 16-3-003713 (1604771A) 
Máy ly tâm Nhật (Tomy) 
Low speed Centrifuge LCX-100. 
Speed 10000 RPM. 
Serial No: 52425004 
Tokyo.1790073 
Tủ nuôi TB ASTEC (Nhật) 
Model No: APC-50DR 
Serial No: 50D1700861 
Power: AC230V 5A 50/60 Hz 
Japan 811-2207 
Tủ nuôi phôi ASTEC (Nhật) 
Model No: APM-50DR 
Serial No: 50D1500682 
Power: AC230V-300VA-50Hz 
Tủ cấy vô trùng ASTEC(Nhật) 
Japan 811-2207 
Model No: AH-160 
2 
Serial No: BO61700283 
Power:AC220V 8A 50Hz 
Máy kéo kim Mỹ 
Model: P-1000 
Sutter Instrument Co. P1000/M-1775 
100-240V 50/60Hz 300W 
NOVATO, CA 94949, USA 415-883-0128 
Máy xung điện 
PRIME TECH 
Nhật 
PMM Controller 
Model: PMAS-CT4G 
Serial No: 41333 
100-240VAC 50/60Hz, 60VA. 
Kính hiển vi soi 
nổi Nikon 
Nhật (Nikon) 
Model: II-PS 100W/A No.2119528. 
Input AC100V 150VA 50/60Hz 
KCC-REM-NYC-TI-PS100WA 
Hệ thống máy 
piezo và hệ 
thống vi thao tác 
Nhật 
(NAISHIGE) 
Module name: MM-93B 
Serial No. 15234 
Cân điện tử 
METTLER 
TOLEDO-Thụy 
Sỹ 
Model: XS250DUV 
TDNR 18.6.3.1084.895 
X250BDUV 
Service info, SNR B548772774 
Kính hiển vi soi 
nổi 
OLYMPUS 
Tokyo 163-
0914, Nhật Bản 
Microscope 
KCC-REM-OLY-022400002 
Model BX53F 
100-120/220-240 
3 
1.7/0.8A 50/60Hz, SN 6L 44666 201611 
Máy kéo kim 
Narishige 
Model: MF-900 
Serial No: 15125 
Tokyo 157-0062.japan 
Đĩa nuôi 4 giếng 
Swedesboro,NJ,
 USA 
Nunc MultiDishes, Thomas,Scientific, 
Đĩa petri 60 mm 
Thomas, 
Scientific, Mỹ 
Falcon 351007 
Buồn đếm Neubauer-Đức Mariendeld 
Cryovials 
Shizuoka, Nhật 
Bản 
Cryotop-Kitazato Biopharma 
Kính hiển vi 
huỳnh quang 
Tokyo, Nhật 
Bản 
BX-51, Olympus, Tokyo, Nhật Bản 
Tủ lạnh Panasonic 
4 
PHỤ LỤC 2. 
MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 
1. Môi trường rửa buồng trứng: Dulbecco’s phosphate-buffered saline (Sigma-
Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) bổ sung kháng sinh (100 units/mL 
penicillin G potassium) (Sigma-Aldrich Corp) và 0.1 mg/mL streptomycin 
sulfate (Sigma-Aldrich Corp) 
2. Môi trường rửa trứng: có chứa TCM-199 (Hank’s salts; Sigma-Aldrich Corp) 
bổ sung 5% huyết thanh thai bò (Gibco; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 
20 mmol/L HEPES (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) và kháng sinh 
3. Môi trường nuôi thành thục trứng-Tissue Culture Medium 199 bổ sung 10% 
dịch nang trứng, 0.6 mmol/L cysteine, 50 mol/Lβ-mercaptoethanol, 1 mmol/L 
dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma-Aldrich Corp), 10 IU/mL eCG (Serotropin; 
ASKA Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan), và 10 IU/mLhCG (500 units; 
Puberogen, Novartis Animal Health, Tokyo, Japan). 
4. Dầu khoáng (Paraffin Liquid; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) 
5. Môi trường thụ tinh Pig-FM có chứa 90 mmol/L NaCl, 12 mmol/L KCl, 25 
mmol/L NaHCO3, 0.5 mmol/L, NaH2PO4, 0.5 mmol/L MgSO4, 10 mmol/L 
sodium lactate (Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan), 10 mmol/L Hepes 8 
mmol/L CaCl2, 2 mmol/L sodium pyruvate (Sigma), 2 mmol/L caffeine và 5 
mg/mL BSA (fraction V; Sigma) 
6. Môi trường TCM-199 rửa tinh 
Thành phần mM g/1000 ml 
Nước 1000 ml 
TCM-199 bột 9,900 mg (1 túi) 
NaHCO3 2.2g 
HEPES 25.00 5.657 g 
Penicillin G + Streptomycin 100 IU/ml PG và 0.1 
mg/ml SM 
 1000 ul 
7. Môi trường tách tế bào cận noãn: 0.1% hyaluronidase 
5 
8. Môi trường rửa tinh: M 199 với Earle’s salts, Gibco, pH 7.8) 
9. Môi trường cố định trứng: acetic acid 1:ethanol 3 
10. Môi trường rửa trứng khi nhuộm: glycerol:acetic acid:nước (1:1:3) 
11. Môi trường TALP-PVA bổ sung 10 mM Na-lactate (60% syrup; Sigma L-
1375), 0,10 mM Na-pyruvate (Sigma P-2256), 2mM hoặc 5 mM Caffeine-
sodium benzoate (Sigma C-4144), 3mg/ml BSA, pH=8,1 
12. Môi trường rửa: Nước muối sinh lý 0,9% bổ sung 240mg gentamycin. 
13. Môi trường nuôi tế bào: DMEM 10% FBS 
14. Môi trường đông lạnh tế bào: DMEM bổ sung thêm 10% DMSO 
15. Dung dịch cố định lam kính: Vaseline: Paraffine 12:1 (Paraffine: Nacalai, 
26031+Vaseline trắng Wako: 224-00165) 
16. Thuốc nhuộm trứng: Aceto-Orcein (1%) 
17. Môi trường cân bằng dùng trong đông lạnh phôi: 2% (v/v) ethylene glycol và 
2% (v/v) propylene glycol 
18. Môi trường đông lạnh phôi: 17.5% ethylene glycol, 17.5% propylene glycol, 
0.3M sucrose và 50 mg/ml polyvinylpyrrolidone 
19. Môi trường thuốc nhuộm phôi: 25 µg/ml Hoechst 33342 (H33342, Calbiochem, 
San Diego, CA, USA) trong 99.5% ethanol 
20. Môi trường nuôi phôi PZM-3: PZM bổ sung 3 mg/ml huyết thanh thai bò 
21. Môi trường xung điện Manitol 0,28mM 
22. Môi trường rửa kim trong NBVT: IVC Pyrulac+20% PVP 
23. Môi trường cấy nhân trong NBVT: IVC Pyrulac+5 µg/ml Cytochalasin B 
24. Môi trường cấy nhân: IVC Pyrulac 
25. NCSU-37+10% pFF (porcine follicular fluid), 0.6 mM cysteine, 50 μM β-
mercaptoethanol, 1 mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma-Aldrich), 10 IU/ml 
eCG (Serotropin; ASKA Pharmaceutical, Tokyo, Japan) và 10 IU/ml hCG (500 
units; Puberogen, Novartis Animal Health, Tokyo, Japan). 
26. NCSU-37: Kháng minh dạng ống đóng sẵn mua theo hãng (Meiji Seika Kaisha; 
~ 2ml / ống) chứa 100mg / ml Streptomycin sulfate và 105 IU / ml Penicillin G 
kali. Chia 8ml (4 ống x 2ml) thành 16 ống (250µl / ống). Bảo quản ở -20oC. 
27. TCM-199Air Stock (1000 ml) 
Nước 1000ml 
6 
TCM-199 bột 9,900 mg* 
NaHCO3 350 mg 
HEPES 4,776 mg 
Kháng sinh 1 ml 
Thêm khoảng 0,95 ml NaOH 1N để điều chỉnh pH đến 7,4 Bột TCM-199: Muối Hank 
với L-glutamine, không có NaHCO3 và HEPES (Sigma M0393). Pha loãng toàn bộ 
bột TCM 199 trong 1l nước. Ngoài ra, có thể sử dụng Gibco 12350-039 loại lỏng, 
trong trường hợp đó, việc bổ sung NaHCO3 và HEPES là không cần thiết! 
28. TCM-199 stock (dùng trong nuôi thành thục trứng) 
Thành phần Lượng 
Nước 1000ml 
TCM-199 bột 9,900 mg (gói) 
NaHCO3 2.2g 
Kháng sinh 1 ml 
Bột TCM-199: Muối Earl`s với L-glutamine, không có NaHCO3 và HEPES (GIBCO 
31100-035). Pha loãng toàn bộ gói bột TCM 199 trong 1l nước và sau đó chia 600: 
400 hoặc 700: 300. 
29. TCM-199 stock rửa tinh (1000 ml)* 
Thành phần Lượng 
Nước 1000ml 
 TCM-199 bột 9,900 mg (gói) 
NaHCO3 2.2g 
HEPES (25 mM) 5.657 g 
Kháng sinh 1 ml 
30. Dung dịch stock 100x Cysteine 
Thành phần Lượng Nồng độ(mM) 
Cysteine (Sigma, C7352) 0.218 g 60 
TCM199 (IVM) stock 30ml 
Chia thành 20 ống (1ml / ống) và bảo quản ở -20oC 
31. 100x Hormone stock solution 
Thành phần Lượng Nồng độ(mM) 
7 
eCG (Serotropin 1000 IU/tube) 6 ống 1000 IU 
hCG (Puberogen 1500 IU/tube) 
(Sankyo) 
4 ống 1000 IU 
TCM199 (IVM) stock 6 ml 
 Chia ra 24 ống (250µl/ống). Giữ ở -20oC. 
32. 100x dbcAMP stock solution 
Thành phần Lượng Nồng độ(mM) 
dbcAMP (Sigma, D0627) 0.250g 100 
TCM199 (IVM) stock 5.09 ml 
 Chia ra 20 ống (250µl/ống). Giữ ở -20oC. 
33. 1000x 2-ME (Beta Mercaptoethanol) stock solution 
 Thành phần Lượng Nồng độ(mM) 
14.3M 2-ME (Wako) 35µl 50 
TCM199 (IVM) stock 10ml 
 Chia ra 40 ống (250µl/ống). Giữ ở -20oC. 
34. NCSU-37 Stock dung dịch A (Để nuôi phôi) 
Thành phần Lượng (g) Nồng độ (mM) 
NaCl (Nacalai; 313-20) 3.971 136.00 
KCl (Nacalai; 28514) 0.223 5.98 
CaCl2.2H2O (Nakalai, 06731) 0.156 2.13 
KH2PO4 (Nacalai, 28721) 0.101 1.49 
MgSO4.7H2O (Nakalai, 21003) 0.183 1.49 
Glutamine (Nakalai, 16919) 0.091 1.25 
0.5 % Phenol red sol. (Sigma, 
P0290) 
250µl 
8 
Nước 500ml 
 Lọc với màng lọc 0.2µm và giữ ở 4oC. 
35. NCSU-37 Stock Solution B (for embryo culture) 
Thành phần Lượng 
Nồng 
độ(mM) 
NaHCO3 (Nacalai 31213) 2.106g 125 
Phenol red (Sigma, P0290) 100µl 
Nước 200ml 
Lọc với màng lọc 0.2µm và giữ ở 4oC. 
36. Môi trường giải đông tinh trùng: M 199 ( Earle’s salts, Gibco, pH 7.8) 
37. Môi trường pha loãng tinh dịch: Trong 1 lít môi trường pha loãng tinh có 
chứa 60g D-Gluco; 3,75 g Sodium citrate; 3,7 g EDTA; 1,20 g Na-Bicarbonat; 
1.000.000 ui Penicilin và 1,0 g Streptomycin. Dung dịch sau pha được bảo quản ở-
80oC trong ống ly tâm 50 ml. 
38. Môi trường đông lạnh NSF.Ib: Trong 0,5 lít môi trường pha loãng tinh có 
chứa 44 g Lactose; 100 ml Lòng đỏ trứng, 500.000 ui Penicillin, 0,5 g Streptomycin. 
Dung dịch sau pha được bảo quản ở-80oC trong ống ly tâm 50 ml. 
39. Môi trường đông lạnh NSF.Iib: Trong 0,5 lít môi trường pha loãng tinh có 
chứa 44 g Lactose; 100 ml Lòng đỏ trứng; 60 ml Glycerol; 14,8 ml OEP; 500.000 ui 
Penicillin và 0,5 g Streptomycin. Dung dịch sau pha được bảo quản ở-80oC trong ống 
ly tâm 50 ml. 
40. Môi trường TALP-PVA: Môi trường thụ tinh: TALP-PVA bổ sung 3.0 
mmol/L calcium lactate, 2.0 mmol/Lcaffeine-sodium benzoate và 3.0 mg/mL BSA 
Cách pha: 
Chuẩn bị dịch nang trứng (pFF) 
pFF thu từ nang trứng có kích thước từ 3-6 mm. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 90 
min ở 4oC. Giữ ở - 20oC với lượng đủ 200 ml sau đó lọc với màng lọc millipore 
kích cỡ 0,45 µm. Giữ trong ống ly tâm 10ml ở - 20oC đến khi sử dụng. 
TALP-PVA (1 dung dịch stock) 
9 
Thành phần mM g/500 ml 
PVA (Sigma P-8136) 0.5 
Penicillin-G (Sigma P-3032) 0.0375 
Streptomycin sulfate (Sigma S-9137) 0.025 
Phenol red (Sigma P-5530) 0.001 
D-Glucose (Sigma G-7021) 5.00 0.450 
NaCl 114.0 3.33 
KCl 3.16 0.12 
MgCl2 (Anhydrous) 0.5 0.0238 
NaH2PO4.H2O 0.35 0.0242 
NaHCO3 (Sigma S-5761) 25.00 1.05 
CaCl2.2H2O 4.72 0.3422 
• Hòa tan các chất theo thứ tự trừ CaCl2 trong 450 ml nước Mini Q 
• Dung dịch được khuấy từ trong thời gian từ 30-60 phút để hòa tan hoàn toàn 
PVA 
• Hòa tan CaCl2 trong 50 ml nước Mini Q và thêm từ từ dung dịch đến khi bột tan 
hoàn toàn. 
• Lọc tiệt trùng và bảo quản ở 4oC tối đa 3 tháng. 
Môi trường TALP-PVA 
Thành phần mM Amount 
Stock Solution 50 ml 
Na-lactate (60% syrup; Sigma L-1375) 10.0 92.5 µl 
Na-pyruvate (Sigma P-2256) 0.10 0.6 mg 
Caffeine-sodium benzoate (Sigma C-4144) 2.00 39.8 mg 
Ca-lactate2 (Hemicalcium salt; Sigma L-4388) 3.0 32.8 mg 
BSA 150 mg 
10 
• Cho tất cả thành phần vào dung dịch stock và khuấy đều cho đến khi BSA tan 
hoàn toàn 
• Trước khi điều chỉnh pH thì cần đo pH phải đạt ~ 8,1 
• Điều chỉnh pH đến 7.6 
• Lọc tiệt trùng và bảo quản ở 4oC tối đa 2 tuần. 
41. D-manitol 0,28 M 
 D-Mannitol (Nakalai, 21303) 10.2g 
 CaCl2.2H2O* (Nakalai, 06731) 200µl 0.075g CaCl2.2H2O trong 5ml 
nước 
 MgSO4.7H2O** (Nakalai, 21003) 200µl 0.124g MgSO4.7H2O trong 5ml 
nước 
 HEPES (Dojindo 346-01373) 0.024g 
 BSA (Fraction V; Sigma A4919) 0.02g 
 Nước 200ml 
42. Môi trường POM 
EGF stock (1000x) được chuẩn bị theo 2 bước sau: 
 Thành phần Lượng Nồng độ 
EGF (Sigma, D0627) 1 mg 1mg /ml 
POM bicarb stock + 10 mg/ml BSA 1ml 
EGF 1 mg/ml stock 10 µl 10µg/ml 
POM bicarb stock + 10 mg/ml BSA 990µl 
Stock giữ ở -20oC trong ống 200ml 
Môi trường POM sử dụng trong nghiên cứu có bổ sung 10 ng/ml EGF 
Vậy cứ 100 ml môi trường POM bổ sung 100µl stock EGF 
 Dung dịch Stock POM/PZM (1x) 
Thành phần mM g/500 ml 
NaCl 108.00 3.156 
KCl 10.00 0.373 
KH2PO4 0.35 0.024 
11 
MgSO4.7H2O 0.40 0.049 
NaHCO3 25.07 1.053 
Penicillin G + Streptomycin 
sulfate (1000x dung dịch stock) 
100 IU/ml PG và 
 0.1 mg/ml SM 
500 ul 
Hòa tan các thành phần trên trong 450 ml nước Mini Q. Thêm nước mini Q cho 
đến khi có thể tích 500 ml Lọc tiệt trùng. Bảo quản ở 4 ° C tối đa 3 tháng 
Môi trường POM 
Thành phần mM Trong 50 ml 100 ml 
POM/PZM3 bicarb stock 
solution 
 47.75 ml* 97.5* 
Na-pyruvate 0.20 0.0011 g** 0.0022** 
Ca-(lactate)2.5H2O 2.00 0.0308 g 0.06166 
Glucose 4 0.036 g 0.07200 g 
L-Glutamax (200 mM, 100x) 1.00 0.25 ml 0.5 ml 
Hypotaurine 5.00 0.0273 g 0.05455 g 
L-cysteine (stock)$ 0.6 0.5 ml 1 ml 
BME Amino Acids Solution 
(50x, Sigma) 
20.00 ml/L 1.0 ml 2 ml 
MEM Non-Essential Amino 
Acids Solution (100x, Sigma) 
10.00 ml/L 0.5 ml 1 ml 
PVA 3.0 mg/ml 0.150 g 0.3 
Cách pha: Đầu tiên lấy 45 ml hoặc 90 ml dung dịch POM stock. Sau đó cho các chất 
tiếp theo. Bổ sung nốt dung dịch POM stock 0,022g/ml để đạt thể tịch 50 ml hoặc 
100 ml. Chỉnh pH đến 7,5-7,55. 
43. Thuốc nhuộm Hoechst 33342 
Stock 1: 25 mg thuốc nhuộm Hoechst 33342 (Sigma, B2261) được pha loãng trong 5 
ml DPBS hoặc PBS-để đạt nồng độ 5mg/ml (giữ ở-30oC). Stock 2: Pha 20 µl Stock 1 
với 10ml PBS để đạt nồng độ 5 µg/ml 
12 
Dung dịch nhuộm: Pha 1 ml Stock 2 với 9 ml Glycerol, sục đều trong 20 phút rồi giữ 
trong ống thủy tinh, phủ dầu khoáng và tránh ánh sáng. 
Dung dịch Working: Pha loãng 200 µl Stock 2 với 800 µl PBS để đạt nồng độ 1µg/ml.