Luận án Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
KHOA NÔNG NGHIỆP 
ĐỖ VIẾT PHƯƠNG 
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ 
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI 
(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL 
LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ 
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 
2020
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
KHOA NÔNG NGHIỆP 
ĐỖ VIẾT PHƯƠNG 
MSNCS: P1114004 
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ 
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI 
(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL 
LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ 
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 
Mã ngành: 62.54.01.01 
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 
PGS. TS. LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY 
TS. PHẠM VĂN TẤN 
2020
i 
LỜI CẢM ƠN 
Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực của 
chính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thân 
cùng bạn bè. Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị. 
Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Lê Nguyễn Đoan Duy, 
người hướng dẫn chính và TS. Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ. Hai thầy 
đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có 
những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của 
tôi. Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình. 
Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy. 
Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Hồ Quảng Đồ, PGS. 
TS. Nguyễn Văn Mười, PGS. TS. Lý Nguyễn Bình, PGS. TS. Nguyễn Công 
Hà, PGS. TS. Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi 
cho tôi trong suốt tiến trình học tập. 
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa 
Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực 
phẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiện thuận 
lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường. 
Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ 
Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 
lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Nhà trường và Viện đã hỗ trợ kinh phí, 
điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường 
Đại học Cần Thơ. Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảm và sự quan 
tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xin cảm ơn các bạn 
rất nhiều. 
Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn 
luôn ủng hộ, sát cánh bên tôi. Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng. 
 NCS 
Đỗ Viết Phương 
ii 
TÓM TẮT 
Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích 
hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta). Đồng thời, nghiên 
cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập 
được từ quả cà phê. Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy 
phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thương mại. Bên 
cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập các thông số cho 
quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu. 
Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenol 
trong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích ly 
thông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêu 
âm. Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiền 
xử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đến mức 
độ suy giảm hemicellulose và lignin. Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập 
nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn: đất trồng, 
quả cà phê, thân cành lá. Sau đó là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm 
mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khác nhau bao gồm: 
(NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone. Enzyme thu nhận được cùng với enzyme 
thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả kinh 
tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3. Bên cạnh đó, để đảm bảo cho quá 
trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phải được kiểm tra và loại 
bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men. Nội dung cuối cùng là khảo sát 
một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như là khảo sát một 
số phương pháp lên men khác nhau. 
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằng 
phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và 87,7% 
(đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại. Tuy nhiên, vì lý 
do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thường bằng nước 
nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol. Khi so sánh các 
phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phương pháp kết 
hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4% 
hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điều 
kiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở 120oC 
trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng 20 phút. 
Trong số 5 dòng nấm mốc phân lập được thì chủng Trichoderma asperellum 
QT5 (phân lập từ quả) có khả năng sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao nhất 
và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng cơ bản. 
Sau đó enzyme cellulase thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ 
iii 
enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL). 
Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủy phân 
và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởi enzyme 
cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằng enzyme 
thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp 
hơn 13,8%. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF 
cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt 
thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu quả thủy phân 
cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian như nhau. 
Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum, thu 
nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê. 
iv 
ABSTRACT 
The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment 
method for coffee pulp (Coffea robusta). In addition, the study also focused on 
recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries. After that, this enzyme 
was used in hydrolysis of the coffee pulp. Hydrolysis efficiency of the enzyme 
was compared with that of commercial enzymes. Besides, the condition of 
hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process 
were also studied. 
The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from 
coffee pulp using three different extraction methods including maceration, 
microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction. Then, 
experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid, 
alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on 
removing of hemicellulose and lignin. In the second research, the isolation of 
mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various 
sources such as soil, branches, trunks, coffee pods. The third research was the 
recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various 
precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone. The cellulase 
enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee 
pulp. Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared 
between the two enzymes. Besides, to ensure that the fermentation was perfect, 
the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to 
yeast. The final content was to study some main factors affecting the 
fermentation process as well as to investigate some different fermentation 
methods. 
 The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and 
polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3% 
and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively. These were higher than 
those of the other methods. However, due to economic aspects and feasibility, 
the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process. 
When comparing different pretreatment methods, it revealed that the 
pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the 
most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was 
retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed 
under treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes, alkali 
pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, and microwave 
at 327 W for 20 minutes. Among five strains of molds isolated, Trichoderma 
asperellum QT5 had the highest activity of cellulase biosynthesis and reached 
v 
to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium. 
Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was 
1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL). In addition, 
when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentation 
processes, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzate using 
the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercial 
Viscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower. Furthermore, 
result of the study also showed that the SHF fermentation method was more 
effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring the fermentation time. 
By contrast the SSF fermentation method was more effective hydrolysis than 
the others in the same fermentation time. 
Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp, 
enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum. 
vi 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên 
cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận 
án cùng cấp nào khác. 
Cần Thơ, ngày tháng năm 
 Người hướng dẫn Người thực hiện 
Lê Nguyễn Đoan Duy Đỗ Viết Phương 
vii 
MỤC LỤC 
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i 
TÓM TẮT ................................................................................................................... ii 
ABSTRACT ............................................................................................................... iv 
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... vi 
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. x 
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................ xii 
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................... xv 
Chương 1: GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1 
1.1 Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3 
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 3 
1.2.2 Mục tiêu cụ thể .................................................................................................... 3 
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 3 
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: ........................................................................................ 3 
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu: ............................................................................................ 3 
1.4 Ý nghĩa của luận án ................................................................................................ 4 
1.4.1 Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 4 
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 4 
1.5 Điểm mới của luận án ............................................................................................ 4 
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5 
2.1 Nguyên liệu cà phê ................................................................................................. 5 
2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối........................................................................... 5 
2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê ...................................................................... 8 
2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol ................................... 10 
2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học) ....................... 11 
2.2.1 Cấu tạo và tính chất của cellulose ..................................................................... 13 
2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose ............................................................. 15 
2.2.3 Cấu tạo và tính chất của lignin .......................................................................... 18 
2.3 Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê ...................................................................... 19 
2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose .................................................................. 20 
2.3.2 Cơ chế thủy phân hemicellulose ....................................................................... 22 
2.3.3 Cơ chế phân hủy lignin ..................................................................................... 26 
2.4 Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose ..................................... 27 
2.4.1 Tiền xử lý bằng acid .......................................................................................... 28 
2.4.2 Tiền xử lý bằng kiềm ........................................................................................ 31 
viii 
2.4.3 Tiền xử lý bằng vi sinh vật ................................................................................ 33 
2.5 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus và Trichoderma ........................................... 36 
2.5.1 Giới thiệu về Aspergillus niger ......................................................................... 36 
2.5.2 Giới thiệu về Trichoderma ................................................................................ 37 
2.5.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp enzyme 
cellulase ...................................................................................................................... 38 
2.6 Thực trạng sản xuất ethanol  ... 
(mg/mL) 
Hoạt tính 
(U/mL) 
Hoạt tính riêng 
(U/mg) 
Hiệu suất 
thu hồi (%) 
Đối chứng 0,96a 13,6b 14,16e 100 
0 ÷ 15% 0,315
d 6,09e 18,66d 36,17 
15 ÷ 20% 0,374cd 7,95d 21.44cd 42,35 
20 ÷ 25% 0,496b 12,12c 24,03bc 62,67 
25 ÷ 30% 0,471bc 16,42a 33,42a 78,36 
30 ÷ 35% 0,516b 14,15b 26,8b 52,13 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
192 
Bảng Multiple Range Tests protein 
NaCl Count Mean Homogeneous Groups 
0÷15 3 0.314683 X 
15÷20 3 0.374401 XX 
25÷30 3 0.471161 XX 
20÷25 3 0.496185 X 
30÷35 3 0.516493 X 
Doi chung 3 0.96 X 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính 
NaCL Count Mean Homogeneous Groups 
0÷15 3 6.09 X 
15÷20 3 7.95 X 
20÷25 3 12.12 X 
Doi chung 3 13.6 X 
30÷35 3 14.145 X 
25÷30 3 16.42 X 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính riêng 
NaCl Count Mean Homogeneous Groups 
Doi chung 3 14.16 X 
0÷15 3 18.66 X 
15÷20 3 21.44 XX 
20÷25 3 24.03 XX 
30÷35 3 27681 X 
25÷30 3 33.42 X 
Bảng PL B.19: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với 
ethanol 
Ethanol/enzyme thô 
(v/v) 
Protein 
(mg/mL) 
Hoạt tính 
(U/mL) 
Hoạt tính riêng 
(U/mg) 
Hiệu suất 
thu hồi (%) 
Đối chứng 0,96a 13,6c 14,16e 100a 
1,5 0,365
d 7,2g 19,72d 47,81b 
2,0 0,4cd 10,77f 26.92c 68,85c 
2,5 0,44cd 12,41d 28,2c 76,51d 
3,0 0,47c 17,07b 36,32b 82,49e 
3,5 0,438cd 21,72a 49,59a 89,43e 
4,0 0,66b 11,5e 17,42de 69,41c 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests protein 
Etahnol Count Mean Homogeneous Groups 
1,5 3 0.365 X 
2,0 3 0.4 XX 
3,5 3 0.4375 XX 
2,5 3 0.44 XX 
3,0 3 0.4695 X 
4,0 3 0.66 X 
Doi chung 3 0.96 X 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính 
Ethanol Count Mean Homogeneous Groups 
1,5 3 7.205 X 
2,0 3 10.77 X 
4,0 3 11.5 X 
2,5 3 12.41 X 
Doi chung 3 13.6 X 
3,0 3 17.065 X 
3,5 3 21.715 X 
193 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính riêng 
Ethanol Count Mean Homogeneous Groups 
Doi chung 3 14.16 X 
4,0 3 17.42 XX 
1,5 3 19.72 X 
2,0 3 26.92 X 
2,5 3 28.21 X 
3,0 3 36.32 X 
3,5 3 49.59 X 
Bảng PL B.20: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với 
acetone 
Acetone /cellulase 
thô (v/v) 
Protein 
(mg/mL) 
Hoạt tính 
(U/mL) 
Hoạt tính riêng 
(U/mg) 
Hiệu suất 
thu hồi (%) 
Đối chứng 0,96a 13,6a 14,16d 100 
1,0 0,349
d 5,21c 15,53d 13,29 
1,5 0,328d 7,19b 20.74b 22,35 
2,0 0,507b 13,8a 26,78a 43,54 
2,5 0,414c 7,83b 18,22c 33,18 
3,0 0,354d 5,67c 16,53d 18,86 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests protein 
Acetone Count Mean Homogeneous Groups 
1,5 3 0.328337 X 
1,0 3 0.34924 X 
3,0 3 0.354006 X 
2,5 3 0.413874 X 
2,0 3 0.507155 X 
Doi chung 3 0.96 X 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính 
Acetone Count Mean Homogeneous Groups 
1,0 3 5.21 X 
3,0 3 5.67 X 
1,5 3 7.19 X 
2,5 3 7.83 X 
Doi chung 3 13.6 X 
2,0 3 13.8 X 
Bảng Multiple Range Tests hoạt tính riêng 
Acetone Count Mean Homogeneous Groups 
Doi chung 3 14.16 X 
1,0 3 15.53 X 
3,0 3 16.53 X 
2,5 3 18.22 X 
1,5 3 20.74 X 
2,0 3 26.78 X 
194 
Bảng PL B.21: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và 
glucose được giải phóng sau quá trình thủy phân 
Chủng loại 
enzyme 
Hoạt tính 
(UI/mL) 
Nồng độ Thể tích 
enzyme 
(mL) 
Đường khử 
(g/L) 
Glucose 
(g/L) 
Cellulase* 43 FPU/mL, 
21,72 CMC/mL 
25 FPU/g 8,72 12,15±0,19f 8,35±0,19f 
Viscozyme 79 FPU/mL, 
48 CMC/mL 
25 FPU/g 4,75 24,43±0,31e 17,46±0,21e 
Celluclast 1.5L 576 FPU/mL, 
385 CMC/mL 
25 FPU/g 0,65 27,39±0,21c 18,65±0,24d 
Glucosidase 540 CBU/mL 30 CBU/g 0,83 
Cellulase* + 
Glucosidase 
 25 FPU/g + 
30 CBU/g 
8,72 + 
0,83 
26,02±0,25d 21,26±0,14c 
Viscozyme + 
Glucosidase 
 25 FPU/g + 
30 CBU/g 
4,75 + 
0,83 
43,26±0,35b 31,39±0,28b 
Celluclast 1.5L 
+ Glucosidase 
 25 FPU/g + 
30 CBU/g 
0,65 + 
0,83 
45,34±0,41a 33,09±0,16a 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng đường khử 
Enzyme Count Mean Homogeneous Groups 
Cellulase* 3 12.15 X 
Viscozyme 3 24.43 X 
Cellulase*+ Glucosidase 3 26.02 X 
Celluclast 1.5L 3 27.39 X 
Viscozyme + Glucosidase 3 38.21 X 
Celluclast 1.5L + Glucosidase 3 39.17 X 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng glucose 
Cellulase* Count Mean Homogeneous Groups 
Viscozyme 3 8.345 X 
Celluclast 1.5L 3 17.46 X 
Cellulase*+ Glucosidase 3 18.65 X 
Viscozyme + Glucosidase 3 21.26 X 
Celluclast 1.5L + Glucosidase 3 30.36 X 
Cellulase* 3 31.09 X 
Bảng PL B.22: Chi phí khi sử dụng các loại enzyme khác nhau 
Chủng loại 
enzyme 
Giá 
thành 
/1 mL 
(đồng) 
Thể 
tích 
enzyme 
(mL) 
Chi phí 
(đồng) 
Đường khử 
(g/L) 
Glucose 
(g/L) 
Ethanol 
(g/L) 
Giá/1g 
ethanol 
(đồng) 
Cellulase* 1.200 8,72 10.464 12,15±0,19f 8,35±0,19f 6,28±0,07f 1.666e 
Viscozyme 4.000 4,75 19.000 24,43±0,31e 17,46±0,21e 8,45±0,09e 2.249c 
Celluclast 1.5L 35.000 0,65 22.750 27,39±0,21c 18,65±0,21d 9,08±0,05d 2.506a 
Glucosidase 6.800 0,83 5.644 
Cellulase* + 
Glucosidase 
 8,72 + 
0,83 
16.108 26,02±0,25d 21,26±0,14c 10,06±0,13c 1.601f 
Viscozyme + 
Glucosidase 
 4,75 + 
0,83 
24.644 43,26±0,35b 31,39±0,28b 11,67±0,15b 2.112d 
Celluclast 1.5L 
+ Glucosidase 
 0,65 + 
0,83 
28.394 45,34±0,41a 33,09±0,16a 12,02±0,12a 2.362b 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
195 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng ethanol 
Enzyme Count Mean Homogeneous Groups 
Glucosidase 3 4.95 X 
Cellulase* 3 6.28 X 
Cellulase* + Glucosidase 3 8.45 X 
Viscozyme 3 10.055 X 
Celluclast 1.5L 3 10.675 X 
Viscozyme + Glucosidase 3 11.28 X 
Celluclast 1.5L + Glucosidase 3 12.015 X 
Bảng PL B.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase bổ sung vào quá trình 
thủy phân 
Nồng độ (IU/g) Viscozyme (FPU/g) Glucosidase (CBU/g) 
5 6,42±0,26f 4,42±0,26f 
10 14,3±0,25e 9,3±0,25e 
15 21,75±0,16d 14,75±0,3d 
20 24,3±0,38c 17,65±0,25c 
25 25,2±0,43b 18,81±0,47b 
30 25,7±0,38ab 21,05±0,38a 
35 26,02±0,25a 21,37±0,38a 
40 26,05±0,38a 21,28±0,28a 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests nồng độ Viscozyme 
Nong do Count Mean Homogeneous Groups 
5 2 6.42 X 
10 2 14.3 X 
15 2 21.745 X 
20 2 24.3 X 
25 2 25.2 X 
30 2 25.695 XX 
35 2 26.02 X 
40 2 26.05 X 
Bảng Multiple Range Tests nồng độ Glucosidase 
Nong do Count Mean Homogeneous Groups 
5 2 4.42 X 
10 2 9.3 X 
15 2 14.745 X 
20 2 17.65 X 
25 2 18.805 X 
30 2 21.045 X 
40 2 21.275 X 
35 2 21.37 X 
Bảng PL B.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng đường khử 
Nhiệt 
độ 
Đối 
chứng 35 40 45 50 55 60 
Đườ
ng 
khử 
(g/L) 
11,18±0,
94e 
16,88±0,
98d 
20,78±0,
52c 
24,78±0,3
8aa 
26,1±0,
67a 
22,88±0,
47b 
8,18±0,
26f 
Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở 
p<0,05 
196 
Bảng Multiple Range Tests đường khử theo nhiệt độ 
Nhiet do Count Mean Homogeneous Groups 
60 2 8.175 X 
ĐC 2 11.08 X 
35 2 16.88 X 
40 2 20.78 X 
55 2 22.885 X 
45 2 24.785 X 
50 2 26.1 X 
Bảng PL B.25: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử 
Thời 
gian 
Đối 
chứng 1 2 3 4 5 6 7 
Đườ
ng 
khử 
(g/L
) 
11,08±0
,94e 
15,08±0
,43d 
18,33±0
,31c 
22,49±0
,23b 
26,1±0,
67a 
26,71±0
,56a 
26,95±0
,07a 
26,63±
0,6a 
Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests đường khử theo thời gian 
Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 
ĐC 2 11.08 X 
1 2 15.075 X 
2 2 18.33 X 
3 2 22.485 X 
4 2 26.1 X 
7 2 26.625 X 
5 2 26.71 X 
6 2 26.945 X 
Bảng PL B.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự 
hình thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân 
Phương pháp TXL Furfural (g/L) HMF (g/L) 
VSV 0g 0g 
Acid-Kiềm-Vi sóng 3,37±0,09b 2,11±0,08c 
Kiềm-Acid 2,27±0,07d 2,66±0,07a 
Acid-Kiềm 3,06±0,1c 1,82±0,08d 
Kiềm 2,04±0,08e 2,43±0,04b 
Acid 3,61±0,06a 1,47±0,07e 
Đối chứng 0,74±0,05f 0,38±0,02f 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng furfural theo các phương pháp tiền xử lý 
Phuong phap Count Mean Homogeneous Groups 
VSV 3 0.0 X 
Doi chung 3 0.74 X 
Kiem 3 2.04 X 
Kiem-Acid 3 2.265 X 
Acid-Kiem 3 3.055 X 
Acid-Kiem-Vi song 3 3.365 X 
Acid 3 3.605 X 
197 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng HMF theo các phương pháp tiền xử lý 
Phuong phap Count Mean Homogeneous Groups 
VSV 3 0.0 X 
Doi chung 3 0.38 X 
Acid 3 1.47 X 
Acid-Kiem 3 1.82 X 
Acid-Kiem-Vi song 3 2.11 X 
Kiem 3 2.425 X 
Kiem-Acid 3 2.655 X 
Bảng PL B.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests pH 
The tich Ca(OH)2 Count Mean Homogeneous Groups 
0 3 4.8 X 
1 3 6.8 X 
2 3 7.8 X 
3 3 8.595 X 
4 3 9.4 X 
5 3 9.8 X 
6 3 10.2 X 
Bảng Multiple Range Tests thể tích Ca(OH)2 
The tich Ca(OH)2 Count Mean Homogeneous Groups 
0 3 0.0125 X 
1 3 0.095 X 
2 3 0.1125 X 
3 3 0.185 X 
4 3 0.23 X 
5 3 0.385 X 
6 3 0.405 X 
Bảng PL B.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến quá trình lên men 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng glucose 
Mat do nam men Count Mean Homogeneous Groups 
5 3 1.16 X 
4 3 2.3 X 
3 3 5.405 X 
2 3 6.505 X 
1 3 7.51 X 
Thể tích Ca(OH)2 mL pH Trọng lượng kết tủa (mg) 
0 4,8g 0,01±0,035e 
1 6,8f 0,1±0,007d 
2 7,8e 0,11±0,0035d 
3 8,6d 0,19±0,007c 
4 9,4c 0,23±0,014b 
5 9,8b 0,39±0,007a 
6 10,2a 0,41±0,021a 
cfu/mL Glucose (g/L) Ethanol (g/L) 
1 7,51±0,29a 8,97±0,14bc 
2 6,51±0,2b 9,67±0,37ab 
3 5,41±0,24c 10,05±0,42a 
4 2,3±0,15d 8,59±0,02c 
5 1,16±0,24e 7,71±0,21d 
198 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng ethanol 
Mat do nam men Count Mean Homogeneous Groups 
5 3 7.705 X 
4 3 8.585 X 
1 3 8.965 XX 
2 3 9.665 XX 
3 3 10.05 X 
Bảng PL B.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng ethanol 
Nhiet do Count Mean Homogeneous Groups 
50 2 1.8 X 
45 2 5.015 X 
25 2 8.105 X 
30 2 9.155 X 
40 2 9.91 X 
35 2 10.1 X 
Bảng PL B.30: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol 
Thời gian lên 
men (giờ) 
Glucose 
(g/L) 
Ethanol 
(g/L) 
Sản lượng lên 
men Yp/s (g 
Et/g Glucose) 
Hiệu suất lên 
men 
Yet (%) 
0 29,82±0,43 
24 8,41±0,35a 6,71±0,17c 0,3±0,007c 58,72±1,44c 
48 6,07±0,18b 9,02±0,14b 0,36±0,003ab 71,45±0,59ab 
72 4,88±0,24c 10,06±0,19a 0,39±0,003a 75,96±0,75a 
72 (Control) 3,67±0,2de 4,67±0,14d 0,17±0,003d 33,71±0,62d 
96 4,39±0,3cd 9,46±0,14ab 0,36±0,003ab 70,16±0,58ab 
120 3,25±0,14e 9,25±0,21ab 0,33±0,003bc 65,73±0,68bc 
Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests hàm lượng ethanol 
Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 
Control 2 4.665 X 
24 2 6.705 X 
48 2 9.02 X 
120 2 9.245 XX 
96 2 9.455 XX 
72 2 10.05 X 
Bảng Multiple Range Tests sản lượng ethanol 
Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 
Control 2 0.171908 X 
24 2 0.299458 X 
120 2 0.335208 XX 
96 2 0.357796 XX 
48 2 0.364382 XX 
72 2 0.387398 X 
Nhiệt độ (oC) Ethanol (g/L) 
25 8,1±0,13c 
30 9,15±0,27b 
35 10,1±0,28a 
40 9,91±0,21a 
45 5,01±0,33d 
50 1,8±0,42e 
199 
Bảng Multiple Range Tests hiệu suất ethanol 
Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups 
Control 2 33.7074 X 
24 2 58.7173 X 
120 2 65.7271 XX 
96 2 70.1562 XX 
48 2 71.4475 XX 
72 2 75.9604 X 
Bảng PL B.31: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF 
Thời gian 
thủy phân 
(ngày) 
Thời gian 
lên men 
(ngày) 
Nhiệt độ 
thủy 
phân/lên 
men (oC) 
Ethanol (g/L) 
SHF SSF SHF+SSF 
1 1 50/37 5,34±0,18a 4,76±0,14
a
2 2 50/37 9,02±0,1a 8,13±0,14
b
 8,96±0,09
a
3 3 50/37 11,28±0,19a 10,09±0,08
b
 9,43±0,16
c
4 4 50/37 11,38±0,21a 10,79±0,15
b
 10,08±0,13
c
5 5 50/37 10,29±0,13ab 10,72±0,11
a
 10,23±0,16
b
6 6 50/37 7,1±0,12b 10,44±0,13
a
 10,26±0,06
a
Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 1-1 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SSF 3 4.755 X 
SHF 3 5.34 X 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 2-2 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SSF 3 8.13 X 
SHF+SSF 3 8.955 X 
SHF 3 9.015 X 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 3-3 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SHF+SSF 3 9.425 X 
SSF 3 10.09 X 
SHF 3 11.275 X 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 4-4 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SHF+SSF 3 10.075 X 
SSF 3 10.79 X 
SHF 3 11.38 X 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 5-5 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SHF+SSF 3 10.23 X 
SHF 3 10.285 XX 
SSF 3 10.72 X 
Bảng Multiple Range Tests theo thời gian thủy phân và thời gian lên men: 6-6 
Phương pháp Count Mean Homogeneous Groups 
SHF 3 7.095 X 
SHF+SSF 3 10.255 X 
SSF 3 10.435 X 
200 
PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH 
1. Kết quả định danh các chủng vi sinh vật phân lập được 
a. Aspergillus niger 
201 
202 
b. Trichoderma longibrachitaum 
203 
204 
c. Trichoderma asperellum 
205 
206 
d. Phanerochaete chrysosporium 
207 
208 
2. Kết quả phân tích caffeine, ethanol, glucose bằng HPLC 
209 
PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 
Hình PL D.1: P. chrysosporium nuôi cấy 7 ngày 
Hình PL D.2: Nhân giống chủng P. chrysosporium 
210 
Hình PL D.3: Quả cà phê mốc 
Hình PL D.4: Đất trồng cà phê 
Hình PL D.5: Thân cành cà phê 
211 
Hình PL D.6: Vi sinh vật phát triển trên đất, cành lá và quả cà phê 
Hình PL D.7: A. niger và T. asperellum phân lập được từ cà phê 
Hình PL D.8: T. longibrachiatum và P. Chrysosporium phân lập được từ cà 
phê 
212 
Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu 
Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý 
Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ 
213 
Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý 
Hình PL D.13: Tiền xử lý bằng chủng P. chrysosporium sau 10, 15 và 20 ngày 
Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thô 
214 
Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn 
Hình PL D.16: Nhân giống nấm men 
Hình PL D.17: Dịch thủy phân 
Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân