Luận án Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm a / h5n1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGUYỄN THỊ THU HẰNG 
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP 
LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
HÀ NỘI, 2019 
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
Nguyễn Thị Thu Hằng 
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM 
VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT 
DI TRUYỀN NGƯỢC 
Chuyên ngành: Di truyền học 
Mã số: 9 42 01 21 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Trung Nam 
 Viện Công nghệ sinh học 
 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà 
 Viện Công nghệ sinh học 
Hà Nội, 2019 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
Luận án “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống 
cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” là công trình nghiên cứu của tôi và 
một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; 
Các số liệu và kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung 
thực, một phần đã đƣợc tác giả công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với 
sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; 
Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Tác giả 
Nguyễn Thị Thu Hằng 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn 
Trung Nam và PGS.TS. Chu Hoàng Hà - những ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, 
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, các cán bộ Phòng Quản lý tổng 
hợp, bộ phận Quản lý đào tạo Sau đại học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn 
lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi. 
Với lòng tri ân và biết ơn, tôi xin cảm ơn Dr. Robert G. Webster, Dr. 
Richard J. Webby (St. Jude Children's Research Hospital) đã cung cấp bộ plasmid 
pHW2000. Luận án đƣợc thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên 
cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” 2016 - 2018 (Mã số 
SPQG.05b.03). 
 Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của 
ThS. Lê Hùng Chí, TS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ của Phòng Công 
nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật và PTN trọng điểm Công 
nghệ gen, Viêṇ Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện CNSH Lâm 
nghiệp, các đồng nghiệp đang công tác tại Trƣờng Đại học Lâm nghiệp vì đã tạo 
điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập. 
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia 
đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó 
khăn của những ngƣời thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực 
cao trong quá trình nghiên cứu. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Thị Thu Hằng 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii 
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... viii 
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... xi 
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ..................................................................... xiii 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 
1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N ................................................................. 5 
1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................... 5 
1.1.2. Danh pháp ...................................................................................................... 6 
1.1.3. Hình thái và cấu trúc ...................................................................................... 6 
1.1.4. Chu trình nhân lên ........................................................................................ 13 
1.1.5. Tiến hóa của virus ........................................................................................ 15 
1.1.6. Độc lực của virus ......................................................................................... 18 
1.2. Tình hình dịch bệnh và di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 .... 19 
1.2.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 độc lực cao .................................................... 19 
1.2.2. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ................................................ 20 
1.3. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 .......................................................... 23 
1.3.1. Phân loại vaccine cúm A/H5N1 ................................................................... 23 
1.3.2. Nguyên tắc phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ............ 25 
1.3.3. Thành tựu trong nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 ....................... 26 
iv 
1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong nghiên cứu tạo chủng 
virus ứng viên vaccine cúm A .................................................................. 30 
1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật ................................................................................ 30 
1.4.2. Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 31 
1.4.3. Các bƣớc của quá trình phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A 
bằng di truyền ngƣợc ................................................................................... 34 
1.4.4. Ƣu điểm của việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong phát triển 
chủng virus vacine cúm A ............................................................................ 35 
1.5. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A ..................................................... 36 
1.5.1. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm vô hoạt ............................................... 37 
1.5.2. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm sống giảm độc lực ............................. 38 
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 39 
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 39 
2.1.1. Chủng virus, vi sinh vật, plasmid, tế bào và một số vật liệu khác ............... 39 
2.1.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................................ 40 
2.1.3. Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 42 
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 43 
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 44 
2.2.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 ............. 44 
2.2.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade 
1.1 và 2.3.2.1c .......................................................................................... 47 
2.2.3. Khuếch đại và chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen đích..... 49 
2.2.4. Ghép nối các phân đoạn gen virus cúm vào plasmid pHW2000 tạo hệ 
thống plasmid đơn gen ................................................................................. 51 
2.2.5. Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào 293T và MDCK .............................................. 52 
v 
2.2.6. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo 
virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ........................... 54 
2.2.7. Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 
trong trứng gà sạch có phôi .......................................................................... 56 
2.2.8. Phân lập và bảo quản chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 
clade 2.3.2.1c ................................................................................................ 59 
2.2.9. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác 
định tính ổn định di truyền của virus ........................................................... 60 
2.2.10. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-
A/H5N1 clade 2.3.2.1c .................................................................................. 61 
2.2.11. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên 
gà của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.................... 62 
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 63 
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 64 
3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào 
plasmid pHW2000 ........................................................................................ 64 
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn 
gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 .................................................... 64 
3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung ..... 64 
3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 ....................... 72 
3.2. Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và 
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 ....................................................... 79 
3.2.1. Thiết kế gen kháng nguyên HA ................................................................... 79 
3.2.2. Khuếch đại gen HA ...................................................................................... 82 
3.2.3. Tạo dòng plasmid pHW2000 mang gen HA ........................................... 83 
vi 
3.3. Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và 
clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000  .................................................. 84 
3.3.1. Thiết kế gen kháng nguyên NA ................................................................... 84 
3.3.2. Khuếch đại gen NA ...................................................................................... 87 
3.3.3. Dòng hóa gen NA vào plasmid pHW2000 .................................................... 88 
3.4. Tạo chủng virus tái tổ hợp bằng di truyền ngƣợc ............................. 89 
3.4.1. Tách chiết DNA plasmid và nuôi cấy tế bào 293T ...................................... 89 
3.4.2. Tối ƣu điều kiện chuyển nhiễm cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 
và rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T........................................... 92 
3.4.3. Kết quả tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1clade 
2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc ...................................................................... 95 
3.5. Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi ........................................ 98 
3.6. Phân lập và kiểm tra tính ổn định di truyền của chủng 
virus. .......................................................................................... 104 
3.7. Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí 
nghiệm và xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch 
của vaccine ................................................................................................ 108 
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ................................................................ 114 
4.1. Ƣu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong di truyền ngƣợc 
tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A ............................................... 114 
4.2. Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus 
A/PR/8/34 trong việc nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng 
virus ứng viên vaccine cúm A ................................................................. 117 
4.3. Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không 
chứa các amino acid kiềm độc ................................................................ 120 
vii 
4.4. Ảnh hƣởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm A tái 
tổ hợp ......................................................................................................... 123 
4.5. Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi và tính ổn 
định di truyền gen kháng nguyên của virus .......................................... 125 
4.6. Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1 
clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm .................................. 126 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 128 
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN 
ĐẾN ĐỀ TÀI .......................................................................................................... 129 
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 130 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 135 
PHỤ LỤC 
viii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết 
tắt 
Chữ viết đầy đủ (tiếng Anh) 
Nghĩa tiếng Việt 
ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ 
CPE Cytopathic Effect 
 Hiệu ứng cytopathic (hiệu ứng 
hủy hoại tế bào) 
cRNA Complementary Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bổ sung 
DNA Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid 
EID50 50% Eggs Infectious Dose 
 Liều lƣợng virus lây nhiễm 50% 
trứng 
FAO Food and Agriculture Organization 
 Tổ chức Nông lƣơng Liên Hiệp 
Quốc 
FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê 
FDA Food and Drug Administration 
 Cơ quan Quản lý Thực phẩm 
và Thuốc Hoa Kỳ 
Gal Galactose Galactose 
GMT Geometric Mean Titer Giá trị HI trung bình hình học 
HA Hemagglutinin Hemagglutinin 
HAU Hemagglutinin unit Đơn vị Hemagglutinin 
HI Hemagglutination Inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu 
HPAI High Pathogenic Avian Influenza Virus cúm độc lực cao 
IIV Inactivated Influenza Vaccine Vaccine cúm bất hoạt 
ix 
LAIV Live Attenuated Influenza Vaccine Vaccine cúm sống nhƣợc độc 
LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Virus cúm độc lực thấp 
M Matrix/Marker Protein M/Marker 
MDCK Madin-Darby Canine Kidney Tế bào thận chó thƣờng trực 
ml Milliliter Milliliter 
mRNA Messenger Ribonucleic Acid RNA thông tin 
NA Neuraminidase Neuraminidase 
NCR Non Coding Region Vùng không mã hóa 
NEP Nuclear Export Protein Protein ngoài nhân 
NK Natural Killer Tế bào miễn dịch NK 
nm Nanometer Nanometer 
NP Nucleoprotein Protein NP 
NS Non-Structural protein Protein không cấu trúc 
PA Polymerase Acidic Protein PA 
PB1 Polymerase Basic 1 Protein PB1 
PB2 Polymerase Basic 2 Protein P ...  
nồng độ pha loãng 10-3 - 10-9 cấy truyền vào trứng gà sạch có phôi. Liều gây nhiễm 
50% trứng gà có phôi (hiệu giá EID50) của virus đƣợc tính theo công thức của Reed-
Muench: 
LogEID50 = LogA + Xlgf 
Trong đó: 
A : Số mũ nồng độ có HA cận trên 50% 
A': Tỷ lệ % trứng bị nhiễm cận trên 50% 
B': Tỷ lệ % trứng bị nhiễm cận dƣới 50% 
f: Cơ số pha loãng virus 
Kết quả xác định hiệu giá EID50 của chủng virus ứng viên rg-A/H5N1 clade 1.1 
Nồng độ pha loãng virus Số trứng có HA ≥ 1: 160 Tỷ lệ trứng có HA ≥ 1: 160 
10
-3
 20/20 100 
10
 -4
 16/16 100 
10
 -5
 12/12 100 
10
-6
 8/8 100 
10
-7
 3/5 60 
10
-8 
2/4 50 
10
-9 
0/7 0 
Tính toán theo công thức của Reed-Muench, hiệu giá EID50 của chủng virus 
ứng viên rg-A/H5N1 clade 1.1 là 1 x 107 EID50/0,1 ml hay 1 x 10
8 
EID50/1 ml. 
Kết quả xác định hiệu giá EID50 của chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 
clade 2.3.2.1c 
Nồng độ pha loãng virus Số trứng có HA ≥ 1: 160 Tỷ lệ trứng có HA ≥ 1: 160 
10
-3
 23/23 100 
10
 -4
 17/17 100 
10
 -5
 13/13 100 
10
-6
 9/9 100 
10
-7
 5/6 83 
10
-8 
2/7 28 
10
-9 
0/9 0 
Tính toán theo công thức của Reed-Muench, hiệu giá EID50 của chủng virus 
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c là 1 x 10
7,6 
EID50/0,1 ml hay 1 x 10
8,6 
EID50/1 ml. 
PHỤ LỤC 05 
PHƢƠNG PHÁP BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO KHẢ 
BIẾN E. COLI DH5α 
Phƣơng pháp dựa trên phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt của Cohen năm 
1972. Tế bào sử dụng là tế bào E. coli DH5α đã đƣợc xử lý làm cho thành tế bào 
mỏng đi, yếu đi tạo điều kiện cho plasmid dễ chui vào nguyên sinh chất một cách dễ 
dàng khi nhiệt độ đột ngột thay đổi. Plasmid trong nguyên sinh chất sẽ nhân lên 
cùng tế bào chủ khi đƣợc nuôi trên môi trƣờng thích hợp. 
- Lấy tế bào khả biến từ tủ -80ºC và để tan từ từ trên đá trong 10 – 15 phút. 
- Lấy 5µl sản phẩm phản ứng ghép nối gen đích vào plasmid bổ sung vào 
50µl tế bào khả biến, để trên đá trong 10 phút rồi ủ ở 42oC trong đúng 90 giây và 
sau đó đặt ngay vào đá 10 phút. 
- Bổ sung 300µl môi trƣờng LB lỏng để nuôi phục hồi tế bào trong 1 giờ. 
- Sử dụng que cấy trải, trải dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ 
sung 100 mg/l Cabemycine, 0,001% X- gal, 100µM IPTG. Ủ đĩa ở 37ºC trong 16h. 
PHỤ LỤC 06 
PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG 
KIT HIGH PURE PLASMID ISOLATION 
Sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức) theo hƣớng dẫn của 
nhà sản xuất, gồm các bƣớc: 
- Hút 2 ml dịch khuẩn E. coli DH5α đã nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB 
lỏng vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm 6000 vòng/ phút trong 1 phút để thu tế bào. 
- Hút 250 µl Suspension Buffer có bổ sung RNase, trộn đều bằng pipet. 
- Bổ sung 250 µl Lysis Buffer, đảo nhẹ và ủ ở 15-25ºC trong 5 phút. Không 
để phản ứng phân giải quá 5 phút. 
- Bổ sung 350 µl Binding Buffer (đã đƣợc để trong đá lạnh), đảo nhẹ, sau 
đó để ngay vào đá trong 5 phút. 
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút. Hút dịch nổi vào cột Fitter. 
- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. 
- Rửa cột bằng bằng cách bổ sung 500 µl dung dịch Washing Buffer I và ly 
tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. 
- Tiếp tục bổ sung 700 µl dung dịch Washing Buffer II, ly tâm 13000 vòng/ 
phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột và ly tâm bổ sung 13000 vòng/ phút 
trong 1 phút để loại bỏ hết Buffer rửa. 
- Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5 ml mới. Hòa tan DNA bằng cách 
bổ sung 40 µl dH2O, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút. 
- Đo nanodrop và điện di trên gel agrarose 1% để kiểm tra nồng độ và độ 
tinh sạch của plasmid thu đƣợc. 
PHỤ LỤC 07 
CÁC PHẢN ỨNG CẮT PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG ENZYME GIỚI HẠN 
Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng BsmBI 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 H2O 6,5 
2 10x Buffer Tango 2 
3 Plasmid (30 ng/µl) 10 
4 DTT 20mM 1 
5 BsmBI (1U/µl) 0,5 
Tổng thể tích 20 
Bổ sung lần lƣợt các thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ 
ở ở 37ºC trong 4 - 6 giờ. 
Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng BsaI 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 H2O 6,5 
2 10x Buffer G 2 
3 Plasmid (30 ng/µl) 10 
4 BsaI (1U/µl) 0,5 
Tổng thể tích 20 
Bổ sung lần lƣợt các thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ 
ở ở 37ºC trong 4 - 6 giờ. 
Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng SacI 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 H2O 6,5 
2 10X Buffer SacI 2 
3 Plasmid (30 ng/µl) 10 
4 SacI (1U/µl) 0,5 
Tổng thể tích 20 
Bổ sung lần lƣợt các thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ 
ở ở 37ºC trong 4 - 6 giờ. 
Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme NheI + SmaI 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 H2O 3 
2 10X Buffer Tango 2 
3 Plasmid (30 ng/µl) 14 
4 NheI (1U/µl) 0,5 
Bổ sung các thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, 
trộn đều, ủ ở ở 37ºC trong 2 - 4 giờ. 
5 SmaI (1U/µl) 0,5 
Bổ sung SmaI vào phản ứng, trộn đều và ủ ở 30ºC trong 4 giờ 
Tổng thể tích 20 
PHỤ LỤC 08 
PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO 293T VÀ MDCK BẰNG 
BUỒNG ĐẾM TẾ BÀO 
Một buồng đếm tế bào đƣợc chia làm hai khu vực: A và B, đƣợc sử dụng cho 
2 lần đếm tế bào riêng biệt nhƣ hình sau: 
Buồng đếm tế bào đƣợc chia thành một mạng lƣới gồm 9 hình vuông nhỏ 
bên trong khi nhìn dƣới kính hiển vi, mỗi hình vuông có diện tích là 1 mm2.. Mỗi 
hình vuông lớn có diện tích bề mặt là 1,0 mm2, và độ dày của buồng đếm là 0.1 
mm, do đó thể tích của mỗi hình vuông là 0,0001 ml nhƣ hình dƣới đây: 
Những tế bào có kích thƣớc lớn sẽ đƣợc đếm trong 4 hình vuông lớn ở bốn 
góc của buồng đếm tế bào. Trong khi đó, những dịch nuôi cấy tế bào có mật độ tế 
bào cao và kích thƣớc tế bào nhỏ sẽ đƣợc đếm ở 4 hình vuông 1/25 mm2 của hình 
vuông trung tâm. 
Công thức tính số lƣợng tế bào: 
Số lƣợng tế bào/ml = Lƣợng tế bào trung bình của 4 ô vuông x độ pha loãng 
PHỤ LỤC 09 
CHUẨN BỊ HỒNG CẦU GÀ 0,5% LÀM NGUYÊN VẬT LIỆU ĐỂ THỰC HIỆN 
THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HA VÀ HIỆU GIÁ HI 
1. Chuẩn bị các loại dung dịch: 
- Dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2): 
+ Chuẩn bị 100ml dung dịch stock PBS 25X: Cân 2,74 g Na2HPO4 + 0,79 g 
NaH2PO4 . H2O, dẫn H2O đến 100 ml. 
+ Cân 8,5 g NaCl, hòa tan trong 40 ml dung dịch stock PBS 25X và dẫn H2O 
đến thể tích 1 lít đƣợc dung dịch PBS 0,01 M 
+ Điều chỉnh pH dung dịch PBS 0,01 M đến pH 7,2 bằng dung dịch NaOH 
1N hoặc HCl 1N. 
+ Khử trùng dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2) bằng lọc qua màng lọc có kích 
thƣớc lỗ lọc 0,22 µm. 
+ Bảo quản dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2) ở 4ºC không quá 3 tuần trong 
quá trình sử dụng. 
- Dung dịch Alsever (chống đông máu): 
+ Chuẩn bị 1 lít dung dịch gồm các chất: 20,5 g dextrose + 8 g sodium citrate 
dihydrate (Na3C6H5O7 . 2H2O) + 4,2 NaCl + 0,55 g citric acid (C6H8O7). Trộn đều 
để hòa tan chất. 
+ Điều chỉnh pH dung dịch 6,1 ± 0,1 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N. 
+ Khử trùng dung dịch bằng lọc dung dịch qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 
0,22 µm. 
2. Lấy máu của gà trống trƣởng thành , khỏe maṇh, chƣa tiêm phòng vaccine 
cúm A/H5N1: Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoăc̣ tim ) bằng bông cồn 
70%. Dùng bơm tiêm đã ch ứa sẵn dung dịch chống đông Alsever và hút một thể 
tích tƣơng đƣơng máu gà ở vị trí tĩnh mạch. Bơm máu đã đƣợc chống đông vào ống 
ly tâm 50 ml. 
3. Rƣ̉a hồng cầu: Ly tâm dung dịch máu chống đông ở 1200 vòng/phút trong 
10 phút. Loại bỏ huyết tƣơng B (NaCl 0,85%) vào ống lấy máu , môṭ lƣơṇg gấp đôi 
lƣơṇg máu trong ống, lắc đều. Ly tâm ở 1200 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ đệm 
PBS ở pha trên thu nhận hồng cầu ở đáy ống ly tâm. Lặp lại 2 lần bƣớc rửa hồng 
cầu bằng đệm PBS. 
4. Pha loãng hồng cầu đến nồng độ 0,5% . Ví dụ: 0,5 ml hồng cầu và 99,5 ml 
đệm PBS pH 7,2. 
(Dung dịch hồng cầu có thể bảo quản ở nhiệt độ từ 4ºC đến 8ºC trong môṭ 
tuần). 
PHỤ LỤC 10 
XÁC ĐỊNH LOẠI HÓA CHẤT THÍCH HỢP CHO CHUYỂN NHIỄM HỆ 
THỐNG 6 + 2 PLASMID ĐƠN GEN VÀO TẾ BÀO 293T 
Chuyển nhiễm bằng Lipofectamine-2000 
- Pha loãng Lipofectamine-2000 trong Opti-MEM I để chuẩn bị dung dịch 
Lipo-OM theo công thức: 22 l Lipofectamine-2000 trong 440 l thể tích cuối cùng 
của hỗn hợp Lipo-OM. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 
- Bổ sung 440 l hỗn hợp Lipo-OM vào 440 l hỗn hợp DNA Plasmid-OM, 
trộn đều hỗn hợp và ủ tại nhiệt độ phòng trong 30 phút. 
- Loại bỏ dịch nuôi cấy trên đĩa tế bào 6 giếng, bổ sung 880 l hỗn hợp Lipo-
OM từ từ vào đĩa 6 giếng. Khẽ lắc nhẹ để trộn đều hỗn hợp và ủ đĩa tại nhiệt độ 
phòng trong 60 phút ở thí nghiệm tối ƣu loại hóa chất chuyển nhiễm; ủ ở các 
khoảng thời gian khác nhau (10 phút, 20 phút, 30 phút và 60 phút) trong thí nghiệm 
tối ƣu thời gian ủ; ủ ở 30 phút trong thí nghiệm tối ƣu nồng độ plasmid. 
Chuyển nhiễm bằng TransIT-LT 
- TransIT-LT đƣợc giữ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút để hoà tan các thành 
phần. 
- Bổ sung 18-20 l TransIT-LT vào hỗn hợp DNA-OM, ủ ở nhiệt độ phòng 
trong 30 phút. 
- Loại bỏ dịch nuôi cấy trên đĩa tế bào 6 giếng, bổ sung 800 l OM vào 200 
l hỗn hợp DNA-LT, trộn đều hỗn hợp và chuyển nhiễm từ từ vào đĩa nuôi cấy. 
- Ủ đĩa tế bào 293T đã lây nhiễm virus trong tủ ấm 37C, 5% CO2 
- Loại bỏ dịch nuôi cấy, bổ sung 1,4 ml môi trƣờng nuôi cấy virus (Opti-
MEM I với 0,3% BSA). Tại thời điểm này đƣợc tính mốc thời gian 0h sau chuyển 
nhiễm (hpt-hour post transfection). 
- Tiếp tục ủ đĩa tế bào 293T đã chuyển nhiễm plasmid ở 37C, 5% CO2 trong 
48h. 
- Thu nhận dịch nuôi cấy tế bào có khả năng chứa virus tái tổ hợp, cấy truyền 
vào trứng gà sạch có phôi 9 - 11 ngày tuổi, ủ trứng ở 35ºC, 5% CO2 trong 36h, thu 
hoạch dịch niệu để xác định hiệu giá HA của virus. 
PHỤ LỤC 11 
VÔ HOẠT VIRUS VÀ SẢN XUẤT VACCINE CÚM A/H5N1 TỪ CHỦNG rg-
A/H5N1 clade 1.1 VÀ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c DÙNG CHO GIA CẦM 
Vô hoạt virus 
Phƣơng pháp vô hoạt virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 
2.3.2.1c để sản xuất vaccine cúm A.H5N1 dùng cho gia cầm đƣợc thực hiện theo 
hƣớng dẫn của WHO. 
- Thu nhận dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1/rg-
A/H5N1 clade 2.3.2.1c. 
- Loại bỏ cặn thô bằng li tâm 6000v/phút trong 10 phút. 
- Kiểm tra hiệu giá HA của virus trong dịch niệu và pha loãng để đồng nhất 
hiệu giá HA của các mẫu dịch niệu đến HA = 1: 1024. 
- Vô hoạt virus: Bổ sung formalin (37% formaldehyde) vào dung dịch virus 
để có nồng độ cuối cùng là 1/2000 (1 ml dung dịch 37% formaldehyde cho 2 lít dịch 
virus). Điều kiện vô hoạt là ở nhiệt độ 4oC có khuấy nhẹ trong thời gian 5 ngày. 
- Kiểm tra vô hoạt: Bƣớc kiểm tra nhằm đảm bảo chắc chắn rằng không còn 
virus sống trong dung dịch virus sau bất hoạt. 
Tiến hành: Lấy mẫu dịch virus đã vô hoạt, trung hoà formaline trong mẫu 
bằng dung dịch 8,8% NaHSO3 (5 µl cho 1ml vaccine vô hoạt). Sau khi trung hoà, 
cấy 0,2 ml dung dịch virus ở các nồng độ không pha loãng, pha loãng 10-1 lần và 10-
2
 lần vào khoang niệu của trứng gà có phôi 11 ngày tuổi, mỗi nồng độ virus cấy 10 
trứng. Ủ trứng ở 33oC trong 3 ngày. Sau khi ủ, phải có ít nhất 8/10 trứng còn sống 
tƣơng ứng với mỗi nồng độ virus. Thu hoạch 0,5 ml dịch niệu từ mỗi quả trứng 
sống hòa trộn đều tƣơng ứng với mỗi nồng độ virus. Tiếp tục cấy 0,2 ml dịch niệu 
trứng tƣơng ứng với mỗi nồng độ virus vào 10 trứng có phôi tiếp theo (30 trứng cho 
3 nồng độ gốc), mỗi quả 0,2 ml từ mỗi dung dịch trộn chung (không pha loãng). Ủ 
trứng ở 33oC trong 3 ngày. Thu hoạch riêng rẽ dịch niệu trong từng quả trứng và 
xác định hiệu giá gây ngƣng kết hồng cầu (hiệu giá HA). Kết quả kiểm tra phải 
không phát hiện thấy phản ứng gây ngƣng kết hồng cầu ở tất cả các trứng khi đó 
trứng mới đƣợc vô hoạt hoàn toàn. 
Tạo vaccine vô hoạt nhũ dầu 
Trộn kháng nguyên virus đã vô hoạt với dầu Montanide với tỷ lệ 1/1. Dùng 
máy nhũ dầu chuyên dụng tạo dạng nhũ dầu của vaccine. 
PHỤ LỤC 12 
KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VI SINH VẬT NGOẠI LAI TRONG 
DỊCH NIỆU TRỨNG VÀ CHẾ PHẨM VACCINE ĐÃ TẠO RA 
TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM 
Chuẩn bị môi trƣờng kiểm tra vi sinh vật ngoại lai 
TT 
Môi trƣờng kiểm tra 
sự có mặt của vi sinh 
vật ngoại lai thuộc 
nhóm 
Thành phần 
Hàm lƣợng 
(g/L) 
pH 
1 
Vi khuẩn hiếu khí 
(môi trƣờng thạch-
thịt-dịch chiết nấm 
men) 
Cao thịt bò (Beef extract) 
Yeast extract 
NaCl 
Agar 
10 
5 
5 
15 
7,0 – 7,2 
2 Vi khuẩn kỵ khí 
Peptone 
Glucose 
MgSO4 
Sodium thioglycollate 
L-Cystine 
NaCl 
4 
10 
1 
0,5 
0,5 
2,5 
7,0 – 7,2 
3 
Nấm mốc, nấm men 
(môi trƣờng 
Sabauroud) 
Glucose 
Peptone 
Agar 
40 
10 
15 
5,6 – 5,8 
Ghi chú: Môi trƣờng kiểm tra sự có mặt vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc và nấm men 
phân phối vào đĩa petri. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí phân phối vào ống nghiệm, 
sau khi cấy vật liệu cần kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn kỵ khí vào môi trƣờng thì tráng bề 
mặt môi trƣờng bằng một lớp agar lỏng (45ºC) lên bề mặt môi trƣờng. 
Kiểm tra sự có mặt của các vi sinh vật ngoại lai 
Sự có mặt của vi sinh vật ngoại lai trong dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp 
rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 tƣơng ứng với từng 
mẫu virus đƣợc gộp lại để cấy truyền lên các môi trƣờng kiểm tra vi sinh vật ngoại 
lai (vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí, nấm) đã chuẩn bị. Bên cạnh đó, hai chế 
phẩm vaccine từ hai chủng virus ứng viên tƣơng ứng với hai clade virus cúm 
A/H5N1 tái tổ hợp (clade 1.1 và clade 2.3.2.1c) cũng đƣợc xác định sự có mặt của 
vi sinh vật ngoại lai. Bố trí công thức môi trƣờng đối chứng cấy nƣớc cất vô trùng. 
- Đặt đĩa petri chứa môi trƣờng kiểm tra vi khuẩn hiếu khí và ống nghiệm 
chứa môi trƣờng kiểm tra vi khuẩn kỵ khí vào tủ ấm ở 37ºC; môi trƣờng kiểm tra 
nấm đặt ở 25ºC. 
- Xác định kết quả: Dịch niệu trứng và chế phẩm vaccine làm đảm bảo độ 
voo trùng nếu các đĩa/ống nghiệm cấy mẫu không xuất hiện bất cứ vi sinh vật ngoại 
lai nào. 
Kết quả kiểm tra sự có mặt của vi sinh vật ngoại lai trong các mẫu dịch niệu 
trứng thế hệ P1 của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 
Mẫu 
Ký hiệu 
mẫu virus 
Xác định sự có mặt của loại vi sinh vật ngoại lai 
Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn kỵ khí Nấm 
Đối chứng (cấy nƣớc vô trùng) - - - 
Dịch niệu trứng 
chứa virus rg-
A/H5N1 clade 1.1 
P1.1.1 - - - 
P1.1.2 - - - 
P1.1.3 - - - 
P1.2.1 - - - 
P1.2.2 - - - 
P1.2.3 - - - 
P1.3.1 - - - 
P1.3.2 - - - 
P1.3.3 - - - 
Dịch niệu trứng 
chứa virus rg-
A/H5N1 clade 
2.3.2.1c 
P1.1.1 - - - 
P1.1.2 - - - 
P1.1.3 - - - 
P1.2.1 - - - 
P1.2.2 - - - 
P1.2.3 - - - 
P1.3.1 - - - 
P1.3.2 - - - 
P1.3.3 - - - 
Ghi chú: (-) không xuất hiện vi sinh vật ngoại lai 
Kết quả kiểm tra sự có mặt của vi sinh vật ngoại lai trong vaccine đƣợc sản 
xuất từ hai chủng ứng viên rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 
Mẫu 
Xác định sự có mặt của loại vi sinh vật ngoại lai 
Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn kỵ khí Nấm 
Đối chứng (cấy nƣớc 
vô trùng) 
- - - 
Vaccine từ virus rg-
A/H5N1 clade 1.1 
- - - 
Vaccine từ virus rg-
A/H5N1 clade 1.1 
- - - 
Ghi chú: (-) không xuất hiện vi sinh vật ngoại lai