Luận án Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
-------------------------------------------------- 
PHẠM MỸ DUNG 
NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG 
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
HÀ NỘI, 2018 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
-------------------------------------------------- 
PHẠM MỸ DUNG 
NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG 
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9 42 02 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
 Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT 
 (2) GS. TS. LÊ HUY HÀM 
HÀ NỘI, 2018 
 i 
LỜI CẢM ƠN 
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới 
PGS.TS. Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ và GS.TS. Lê Huy 
Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, những người thầy đã định hướng, truyền 
dạy những kiến thức khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi 
vượt qua những khó khăn và trở ngại trong suốt quá trình thực hiện luận án. 
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, 
Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo của Viện Khoa học 
Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và 
giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm luận án. 
Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại 
học Vinh, Viện Nông Nghiệp và Tài Nguyên đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn 
thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu trong bốn năm qua. 
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại 
học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân của Trường Đại học Vinh 
đã hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. 
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người 
thân đã luôn bên cạnh chia sẻ, và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và 
hoàn thành luận án của mình. 
Hà Nội, ngày. tháng năm 2018 
 ii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
- Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả này cộng 
tác với các cộng sự khác. 
- Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã 
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho 
phép của các đồng tác giả 
 Hà Nội, ngày.. tháng năm 2018 
 Tác giả luận án 
 Phạm Mỹ Dung 
 iii 
MỤC LỤC 
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i 
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. ii 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v 
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................................... ix 
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 5 
1.1. GELATIN ....................................................................................................................... 5 
1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin ........................................................................................ 5 
1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá ..................................................................................... 6 
1.2. GELATINASE .............................................................................................................. 11 
1.2.1. Đặc điểm, chức năng của gelatinase .......................................................................... 11 
1.2.2. Phân loại gelatinase ................................................................................................... 13 
1.2.3. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase ............................................................. 16 
1.2.4. Tính chất chung của gelatinase .................................................................................. 19 
1.2.5. Nguồn sản xuất gelatinase ......................................................................................... 25 
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP ...................................................... 27 
1.3.1. Gen mã hóa gelatinase ............................................................................................... 27 
1.3.2. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp .................................................................................... 32 
1.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM ..... 41 
1.4.1. Nghiên cứu sản xuất gelatinase.................................................................................. 41 
1.4.2. Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá ............................................... 42 
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 50 
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 50 
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .......................................................................................... 50 
2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................................... 50 
2.2.2. Thiết bị ....................................................................................................................... 51 
2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ....................................................................................... 52 
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 52 
2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase................................................ 52 
2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp ............................................................................. 55 
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL .................................................. 61 
2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL ............................................. 63 
 iv 
2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra ........................................................... 65 
2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu....................................................................... 71 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 72 
3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE .............................................. 72 
3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao .................................. 72 
3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn........ 74 
3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP ........................................................................................ 79 
3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. faecalis MD4 ..... 79 
3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase .................................................................... 79 
3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE ............................................................................ 81 
3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli BL21(DE3) ............ 84 
3.2.5. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE .............................................................. 86 
3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL ................................................................................... 87 
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL .................................................................... 88 
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL ............................................................ 89 
3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL ................................................................ 93 
3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp ....................................... 95 
3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL ................................................. 96 
3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL ......................................................................................... 96 
3.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp .............................................................................. 99 
3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA ................................... 106 
3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL ................. 106 
3.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen ....... 111 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 118 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 121 
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 145 
 v 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
 Chữ viết tắt Tên đầy đủ 
ADG : Average daily growth 
ADN : Acid deoxyribonucleic 
AMP : Ampicillin 
ARN : Acid ribonucleic 
BLAST : Basis Local Aligment Search Tool 
bp : base pair 
BSA : Bovine Serum Albumin 
Dal : Dalton 
E : Enzym 
EC : Classification enzyme 
EDTA : Ethyllene diamine tetraacetic acid 
EtBr : Ethidium Bromide 
FCR : Feed change rate 
IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside 
kDa : Kilo Dalton 
Kb : Kilo base 
LB : Lubria – Bertani 
MMP 2 : Matrix metalloprotease 2 
MMP 9 : Matrix metalloprotease 9 
MMPs : Matrix metalloproteases 
NST : Nhiễm sắc thể 
OD : Optical density (mật độ quang) 
PBS : Phosphate buffer 
PCR : Polymerase Chain Reactions 
rGelE : recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp) 
 vi 
RE : Restriction enzyme (enzyme giới hạn) 
S : Cơ chất 
SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis 
SGR : Special growth rate 
sprE : serine proteinase 
TAE : Tris - acetate - EDTA 
TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí 
TTHĐ : Trung tâm hoạt động 
UV : Ultra violet 
VT TTH : vector tái tổ hợp 
VSV : vi sinh vật 
 vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias 
gariepinus) ........................................................................................................ 8 
Bảng 1.2. Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và 
bì lợn (thành phần trong 1000g) ...................................................................... 10 
Bảng 1.3. Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs .......................................... 14 
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn ..................................................... 68 
Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm ........... 69 
Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm .............. 69 
Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn 
phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. ...... 72 
Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng 
của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C. ................................................. 75 
Bảng 3.3. Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình 
tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) .......... 77 
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E. 
faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên 
GenBank .......................................................................................................... 81 
Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn của gen gelE của 
chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được 
đăng kí trên GenBank ...................................................................................... 84 
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện 
GEL ................................................................................................................. 93 
Bảng 3.7. Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp .......................................... 97 
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL 
tái tổ hợp ........................................................................................................ 103 
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân ....... 106 
Bảng 3.10. Thành phần axít amin của sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra
 ....................................................................................................................... 110 
 viii 
Bảng 3.11. Diễn biến các yếu tố môi trường nước trong quá trình ương cá Mú 
chấm đen ....................................................................................................... 111 
Bảng 3.12. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo 
khối lượng ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau .................... 113 
Bảng 3.13. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo 
chiều dài ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau ....................... 114 
Bảng 3.14. Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Mú ở các mức bổ sung chế phẩm 
axit amin khác nhau ...................................................................................... 116 
Bảng 3.15. Hệ số biến động của cá Mú chấm đen giai đoạn giống .............. 117 
 ix 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Hình 1.1 . Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B có nguồn gốc từ người ... 17 
Hình 1.2. Cấu trúc của các enzym gelatinase ................................................. 18 
Hình 1.3. Sơ đồ trình tự axit amin dự đoán của gelatinase ............................ 28 
Hình 1.4. A) Hệ thống điều hòa sự biểu hiện của gen gelE bởi operon ......... 31 
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein ................................. 61 
Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) ............................... 67 
Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí nghiệm ..................................................... 67 
Hình 2.3. Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen ........................... 68 
Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của 
chủng MD4 ...................................................................................................... 73 
Hình 3.2. Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn ....................... 73 
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới 
kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) ........ ... n of Gelatin 
from Catfish (Clarias gariepinus) Skin”, Sains Malaysiana 42(12): 
pp.1697–1705. 
[132]. Sayed EEM., Saad MM., Awad HM., Selim MH. and Hassan HM. 
(2012), “Optimization conditions of extracellular proteases production 
from a newly isolated Streptomyces pseudogrisiolus NRC-15”, E-
Journal of Chemistry; 9(2), pp.949-961. 
[133]. Schellman J.A. (1997), Temperature, stability, and the hydrophobic 
interaction. Biophys. J. 73: 2960-2964. 
[134]. Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R. (2007), “Escherichia coli 
physiology in Luria-Bertani broth”, Journal Bacteriol. 189(23), pp. 
8746-8749. 
[135]. Shaheen M., Shah AA., Hameed A., Hasan F. (2008), “Influence of 
culture conditions on production and activity of protease from Bacillus 
subtilis BS1”, Pak.J.Bot; 40(5): pp.2161- 2169. 
[136]. Shahidi F. (1994), Proteins from seafood processing discards. In Z.E. 
Sikorski, B. S. Pan, & F. Shahidi (Eds.). Seafoods proteins. NewYork, 
NY: Chapman and Hall, pp.171-193. 
[137]. Shanmugasundaram Senthil Balan, Rajendiran Nethaji, Sudalayandi 
Sankar, Singaram Jayalakshmi (2012), “Production of gelatinase 
enzyme from Bacillus spp isolated from the sediment sample of Porto 
Novo Coastal sites”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 
S1811-S1816. 
[138]. Sharma A., Dour, P. & Gupta P. (2006), “Screening of 
Enterobacterial Contamination During Gelatin Production and its 
 140 
Effect on Pharmaceutical Grade Gelatin”, World J Microbiol 
Biotechnol 22, pp.1049-1054. 
[139]. Shin CS, Hong MS, Bae CS, Lee J. (1997), Enhanced production of human 
mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia 
coli BL21(DE3)[pET-3aT2M2] Biotechnol Prog. 13:249–257. doi: 
10.1021/bp970018m 
[140]. Shiau S.-Y., Lan, C.-W. (1996), « Optimum dietary protein level and 
protein to energy ratio for growth of grouper (Epinephelus 
malabaricus)”, Aquaculture 145, pp.259–266. 
[141]. Shojaosadati SA, Kolaei SMV, Babaeipour1 V, Farnoud AM (2008), 
Recent advances in high cell density cultivation for production of 
recombinant protein. Iranian J Biotechnol 6(2): 63-77. 
[142]. Small B.C., & Soares J.H. Jr.(2000), “Quantitative dietary lysine 
requirement of Juvenline striped bass Morone saxatilis”, Aquaculture 
Nutrition 6. pp.207-212. 
[143]. Stack MS, Gray RD. (1990), “The effect of pH, temperature, and D2O 
on the activity of porcine synovial collagenase and gelatinase”. Arch 
Biochem Biophys 281(2), pp.257–263. 
[144]. Stainsby, G. (1987), Gelatin gels, in A.M. Pearson, T.R. Dutson, and 
A.J. Bailey (eds.), Advances in Meat Research 4: pp.209-222. 
[145]. Steck Natalie, Hoffmann, Irina G.Sava, Sandra C.Kim; HannesHahne; 
Susan L.Tonkonogy, KatrinMair; DagmarKrueger; MihaelaPruteanu, 
FergusShanahan; RogerVogelmann; MichaelSchemann; 
BernhardKuster; BalforSartor R. (2011), Enterococcus 
faecalis Metalloprotease Compromises Epithelial Barrier and 
Contributes to Intestinal Inflammation. Gastroenterology Volume 141, 
Issue 3, pp.959-971. 
[146]. Steffensen B, Wallon UM, Overall CM. (1995), “Extracellular matrix 
binding properties of recombinant fibronectin type II-like modules of 
 141 
human 72-kDa gelatinase/type IV collagenase. High affinity binding to 
native type I collagen but not native type IV collagen”, Journal Biol 
Chem. 12;270(19), pp.11555-11566. 
[147]. Sternlicht MD, Werb Z., (2001), How matrix metalloproteinases 
regulate cell behavior. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol 17: pp:463-516. 
[148]. Strandberg L, Enfors SO. (1991), Factors influencing inclusion body 
formation in the production of a fused protein in Escherichia coli. Appl 
Environ Microbiol. 57:1669–1674. 
[149]. Su Y. A., Sulavik M. C., He P., Makinen K. K., Makinen P. L., Fiedler 
S., Wirth R. & Clewell, D. B. (1991), “Nucleotide sequence of the 
gelatinase gene (gelE) from Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens”, 
Infect Immun 59, pp.415–420. 
[150]. Susanna Monaco, Valentina Sparano, Magda Gioia, Diego 
Sbardella, Donato Di Pierro, Stefano Marini,Massimo Coletta. (2006) 
“Enzymatic processing of collagen IV by MMP-2 (gelatinase A) 
affects neutrophil migration and it is modulated by extracatalytic 
domains”, Protein Science 15(12), pp.2805–2815. 
[151]. Teixeira Neuza, Sofia Santos, Paulo Marujo, Ryoji 
Yokohata, Vijayalakshmi S. Iyer, Jiro Nakayama, Lynn E. 
Hancock, Pascale Serror, and Maria de Fátima Silva Lopes., (2012), “ 
The incongruent gelatinase genotype and phenotype in Enterococcus 
faecalis are due to shutting off the ability to respond to the gelatinase 
biosynthesis-activating pheromone (GBAP) quorum-sensing signal”, 
Microbiology 158(Pt 2), pp.519–528. 
[152]. Tong A., Reich A., Genin O., Pines M., Monsonego-Ornan E. (2003), 
“Expression of chicken 75-kDa gelatinase B-like enzyme in 
perivascular chondrocytes suggests its role in vascularization of the 
growth plate”, Journal Bone Miner Res. 18(8), pp.1443-1452. 
 142 
[153]. Tran LH, Nagano H. (2002), “Isolation and Characteristics of Bacillus 
subtilis CN2 and its Collagenase Production”, Journal of Food Science 
67(3), pp.1184- 1187. 
[154]. Tuan L.A., Kevin C. Williams (2007), “Optimum dietary protein and 
lipid specifications for juvenile malabar grouper (Epinephelus 
malabaricus)”, Aquaculture 267, pp.129–138. 
[155]. Urban A, Ansmant I, Motorin Y. (2003), Optimisation of expression 
and purification of the recombinant Yol066 (Rib2) protein 
from Saccharomyces cerevisiae. J Chromatogr B Biomed Sci 
Appl. 786(1–2):187–195. 
[156]. Brammachary U. and Paily K. (2014), Gelatinase activity of 
metabolites of Pseudomonas fluorescens Migula on larvae and pupae of 
culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae), Int Journal Pharm Bio 
Sicence 2014 July 5(3): Pp, 234-245. 
[157]. Van den Steen PE, Van Aelst I, Hvidberg V, Piccard H, Fiten 
P, Jacobsen C, Moestrup SK, Fry S, Royle L, Wormald MR, Wallis 
R, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G., (2006), “The hemopexin and 
O-glycosylated domains tune gelatinase B/MMP-9 bioavailability via 
inhibition and binding to cargo receptors”, Journal Biol 
Chem. 7;281(27), pp.18626-18637. 
[158]. Van den Steen PE., Proost P., Wuyts A., Van Damme J., Opdenakker 
G. (2000), “Neutrophil gelatinase B potentiates interleukin-8 tenfold by 
aminoterminal processing, whereas it degrades CTAP-III, PF-4, and 
GRO-alpha and leaves RANTES and MCP-2 intact”, Blood. 96, 
pp.2673–2681. 
[159]. Van den Steen PE., Dubois B., Nelissen I., Rudd PM., Dwek 
RA, Opdenakker G. (2002), Biochemistry and molecular biology of 
gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit Rev Biochem 
Mol Biol. 37(6), pp.375-536. 
 143 
[160]. Van den Steen P.E., Dubois B., Nelissen I., Rudd P.M., Dwek R. and 
Opdenakker G. (2013), "Biochemistry and molecular biology of 
gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)"; Critical Reviews 
in Biochemistry and Molecular Biology, 37(6): 375–386. 
[161]. Vandooren J., Van den Steen P. E., Opdenakker G. 
(2013), Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix 
metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade. Crit. Rev. Biochem. 
Mol. Biol. 48, pp.222–272. 
[162]. Verma, R. P. and Hansch, C. (2007), “Matrix metalloproteinases 
(MMPs): Chemical biological functions and (Q)SARs”, Bioorganic & 
Medicinal Chemistry 15(6), pp.2223-2268. 
[163]. Veis, A. (1964), The Macromolecular Chemistry of Gelatine. 
Academic Press NY, p6-44. 
[164]. Visse R, Nagase H. (2003), Matrix metalloproteinases and tissue 
inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. 
Circ Res. 92(8):827-39 
[165]. Wachirattanapongmetee K, Thawornchinsombut S, Pitirit T, 
Yongsawatdigul J, Park JW. (2009), “Functional properties of protein 
hydrolysates prepared from alkali-aided protein extraction of hybrid 
catfish frame”, Trends Research in Science and Technology 1: p71-81 
[166]. Williamson RA, Martorell G., Carr MD., Murphy G., Docherty AJP., 
Freedman RB., Feeney J. (1994), “Solution structure of the active 
domain of tissue inhibitor of metalloproteinases-2. A new member of 
the OB fold protein family”. Biochemistry. 33, pp.11745–11759. 
[167]. Woolley DE., Roberts DR., Evanson JM. (1975), “Inhibition of human 
collagenase activity by a small molecular weight serum protein”, 
Biochem Biophys Res Commun. 66, pp.747–754. 
 144 
[168]. Xia T., Akers K., Eisen AZ, Seltzer JL. (1996), “Comparison of 
cleavage site specificity of gelatinases A and B using collagenous 
peptides”, Biochim Biophys Acta. 16;1293(2): pp.259-266. 
[169]. Yang, H., Wang, Y., Jiang, M., Oh, J.H., Herring, J. & Zhou, P. (2007), 
“2-Step optimization of the extraction and subsequent physical 
properties of channel catfish (Ictalurus punctatus) skin gelatin”, Journal 
of Food Science72, pp.C188-C195 
[170]. Ye Q.Z., Hupe D., &Johnson L., (1996), “Catalytic domains of matrix 
metalloproteinases: A molecular biology approach to drug discovery”, 
Current Medicinal Chemistry, 3(6), pp.407-418. 
[171]. Zeng Jing, Teng Fang, Murray Barbara E.., (2005), “Gelatinase Is 
Important for Translocation of Enterococcus faecalis across Polarized 
Human Enterocyte-Like T84 Cells”, Infect Immun. 73(3): pp.1606–
1612. 
[172]. Zhou P., Mulvaney S. J., & Regenstein J. M., (2006), “Properties of 
Alaska pollock skin gelatin: a comparison with Tilapia and pork skin 
gelatins”, Journal of Food Science, 71, C313–C321. 
[173]. Zitka O., J. Kukacka, S. Krizkova, D. Huska, V. Adam, M. Masarik, R. 
Prusa and R. Kizek, (2010), Matrix Metalloproteinases. Current 
Medicinal Chemistry, 17, p3751-3768. 
[174]. 
enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.35&onlyTable=Disease). 
[175].  
[176]. https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.24; 
[177]. https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.35; 
[178].  
[179].  
 145 
PHỤ LỤC 
Phụ lục 1: Vector pET 22b(+) 
Phụ lục 2: Vector pJET1.2 
 146 
Phụ lục 3: Vector pJet1.2/Blunt 
Phụ lục 4: Trình tự nucleotide gen 16S rRNA của chủng MD4 
 1 TGAAAGGCGC TTTCGGGTGT CGCTGATGGA TGGACCCGCG GTGCATTAGC TAGTTGGTGA 
 61 GGTAACGGCT CACCAAGGCC ACGATGCATA GCCGACCTGA GAGGGTGATC GGCCACACTG 
 121 GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT AGGGAATCTT CGGCAATGGA 
 181 CGAAAGTCTG ACCGAGCAAC GCCGCGTGAG TGAAGAAGGT TTTCGGATCG TAAAACTCTG 
 241 TTGTTAGAGA AGAACAAGGA CGTTAGTAAC TGAACGTCCC CTGACGGTAT CTAACCAGAA 
 301 AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGTGGCAAG CGTTGTCCGG 
 361 ATTTATTGGG CGTAAAGCGA GCGCAGGCGG TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC 
 421 TCAACCGGGG AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG CAGAAGAGGA GAGTGGAATT 
 481 CCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGATATA TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGGCTCT 
 541 CTGGTCTGTA ACTGACGCTG AGGCTCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT 
 601 GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTGGAG GGTTTCCGCC CTTCAGTGCT 
 661 GCAGCAAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGACC GCAAGGTTGA AACTCAAAGG 
 721 AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA 
 781 ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTTTGACCA CTCTAGAGAT AGAGCTTTCC CTTCGGGGAC 
 841 AAAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC 
 901 CGCAACGAGC GCAACCCTTA TTGTTAGTTG CCATCATTTA GTTGGGCACT CTAGCGAGAC 
 961 TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC 
 1021 TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGGAAGTA CAACGAGTCG CTAGACCGCG AGGTCATGCA 
 1081 AATCTCTTAA AGCTTCTCTC AGTTCGGATT GCAGGCTGCA ACTCGCCTGC ATGAAGCCGG 
 1141 AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCACGCCG CGGTGAATAC TTCCCGGGCC TTGT 
 147 
Trình tự gen gelE của chủng Enterococus faecalis MD4 
CTACAAATAAGGATACGGTGTCAGGCATCTTTGTTGGAAGTTCATGTCTATTTTCTTCAC 
TTTTTGTAGCAGCAGAAGAACAAGTTTATTCAGAAAGTGAAGTTTCAACAGTTTTATCGA 
AGTTGGAAAAGGAGGCAATTTCTGAGGCAGCTGCTGAACAATATACGGTTGTAGATCGAA 
AAGAAGATGCGTGGGGGATGAAGCATCTTAAGTTAGAAAAGCAAACGGAAGGCGTTACTG 
TTGATTCAGATAATGTGATTATTCATTTAGATAAAAATGGTGCAGTAACAAGTGTTACAG 
GAAATCCAGTTGATCAAGTAGTGAAAATTCAATCGGTTGATGCAATCGGTGAAGAAGGAG 
TTAAAAAAATTATTGCTTCTGATAATCTGGAAAATAAAGATCTTGTCTTTTTAGCTATTG 
ACCAACGTGTAAATAATGAAGGGCAATTATTTTATAAAGTCAGAGTAACTTCTTCACCAA 
CTGGTGACCCCGTATCATTGGTTTATAAAGTGAACGCTACAGATGGAACAATTATGGAAA 
AACAAGATTTAACGGAACATGTCGGTAGTGAAGTAACGTTAAAAAACTCTTTTCAAGTAA 
CGTTTAATGTACCAGTTGAAAAAAGCAATACGGGAATTGCTTTACACGGAACGGATAACA 
CAGGGGTTTACCATGCAGTAGTTGATGGCAAAAATAATTATTCTATTATTCAAGCGCCAT 
CACTAGCGACATTAAATCAGAATGCTGTTGACGCCTATACGCATGGAAAATTTGTGAAAA 
CATATTATGAAGATCATTTCCAACGACACAGTATTGATGATCGAGGGATGCCCATCTTGT 
CAGTTGTTGATGAACAACATCCAGATGCTTATGACAATGCTTTTTGGGATGGAAAAGCAA 
TGCGTTATGGTGAAACAAGTACACCAACAGGAAAAACGTATGCTTCCTCTTTAGATGTAG 
TTGGTCATGAAATGACACATGGTGTGACGGAACATACTGCCGGTTTAGAATATTTAGGAC 
AATCAGGTGCCTTGAATGAATCTTATTCTGATTTGATGGGTTATATTATTTCGGGTGCAT 
CTAATCCAGAAATTGGTGCGGATACTCAGAGTGTTGACCGAAAAACAGGTATTCGAAATT 
TACAAACGCCAAGTAAACACGGACAACCAGAAACCATGGCTCAATACGACGATCGAGCAC 
GGTATAAAGGAACGCCTTATTATGATCAAGGCGGTGTTCATTATAATAGTGGAATTATTA 
ATCGGATTGGTTACACCATTATCCAGAACTTAGGCATTGAAAAAGCACAGACTATTTTCT 
ACAGCTCGTTAGTAAATTACTTAACACCTAAAGCACAATTCAGTGATGCTCGTGATGCGA 
TGCTTGCTGCTGCAAAAGTTCAATATGGCGATGAAGCAGCTTCAGTGGTGTCAGCAGCCT 
TTAACTCTGCTGGAATCGGAGCTAAAGAAGACATCAGG 
Phụ lục 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính rGEL 
Nhiệt độ 
(ᵒC) 
Hoạt tính gelatinase 
(U/ml) 
20ᵒC 1,16±0,03 
30ᵒC 1,45±0,04 
37ᵒC 2,57±0,04 
40ᵒC 2,89±0,02 
45ᵒC 2,60±0,03 
55ᵒC 1,73±0,03 
pH 
Hoạt tính rGEL 
(U/ml) 
5,0 0,87±0,09 
6,0 1,30±0,12 
6.5 2,60±0,09 
7,0 2,92±0,14 
7,5 2,89±0,17 
8,0 2,60±0,20 
8,5 2,54±0,23 
9,0 2,31±0,03 
10 1,73±0,06 
11 1,45±0,12 
12 0,58±0,09 
 148 
Phụ lục 6. Hình ảnh nuôi sinh khối chủng tái tổ hợp trong môi trường LB lỏng 
Hình ảnh nuôi sinh khối 
chủng tái tổ hợp trên môi 
trường LB lỏng. 
Phụ lục 7: Một số hình ảnh sản xuất bột axit amin thủy phân từ da cá Tra bằng 
gelatinase 
Da cá cấp đông đá khi lấy từ nhà máy chế biến Da cá sau khi xử lý tiền thủy phân 
 149 
Sản phẩm thủy phân: Bột axit amin 
Phụ lục 8: Một số hình ảnh thí nghiệm ứng dụng bổ sung bột axit amin thủy phân từ 
da cá Tra vào thức ăn cho cá Mú giống. 
Hệ thống giai thí nghiệm Cá Mú chấm đen thí nghiệm 
Đo chiều dài cá thí nghiệm Kiểm tra tăng trưởng cá theo khối lượng 
 150 
Phụ lục 9. Thành phần một số phản ứng 
(1) Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme HindIII 
Thành phần Thể tích 
(µl) 
Điều kiện xử lý 
H2O 60 
Ủ 370C trong 2 giờ 
Đệm 10X 15 
pET 22(b+) /GelE 70 
HindIII 5 
Tổng thể tích 150 
(2) Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme SalI 
Thành phần Thể tích 
(µl) 
Điều kiện xử lý 
H2O 33 
Ủ 370C trong 2 
giờ 
Đệm 10X 10 
pET 22(b+) /GelE 54 
SalI 3 
Tổng thể tích 100 
(3)Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen 
Thành phần Thể tích 
(µl) 
Điều kiện xử lý 
T4 ligase buffer 2 
Ủ 40C qua đêm 
gelE cắt bằng SalI và 
HindIII, 
10 
pET 22(b+) cắt bằng 
SalI và HindIII, 
7 
T4 DNA ligase 1 
Tổng thể tích 20 
 151 
Phụ lục 10. Đường chuẩn định lượng Leucine 
Phương trình Đường chuẩn định lượng Lysine Y= 93,90726x + 89,52055 (R2 = 0,99989)