Luận án Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
TRẦN THỊ HỒNG 
SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ 
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia 
vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
HÀ NỘI, 2020 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
TRẦN THỊ HỒNG 
SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ 
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia 
vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT 
NAM 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
1. PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường 
 2. PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc 
Hà Nội, 2020 
i 
LỜI CÁM ƠN 
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới 
PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa 
học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học 
mẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về 
tinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua 
rất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua. 
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, 
Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kết 
hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt 
tính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trong 
suốt thời gian thực hiện luận án. 
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử 
tôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất Hữu 
Đạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điều 
kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung 
trong nghiên cứu này. 
Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ 
Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi 
thủ tục cần thiết trong quá trình học tập. 
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn 
bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, 
nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Tác giả 
 NCS. Trần Thị Hồng 
ii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các 
cộng sự khác; 
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả 
lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng 
ý và cho phép của các đồng tác giả. 
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Tác giả 
NCS. Trần Thị Hồng 
iii 
MỤC LỤC 
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Lời cam đoan ............................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................ vi 
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii 
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................................... ix 
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên .................................................................. 3 
1.1.1. Giới thiệu về hải miên................................................................................................... 3 
1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên ......................................................................................... 6 
1.2. Sơ lược về metagenomics ........................................................................................... 14 
1.3. Chất ức chế protease (PIs) ......................................................................................... 19 
1.3.1. Sơ lược protease ............................................................................................................ 19 
1.3.2. Chất ức chế protease và phân loại ................................................................................ 20 
1.3.3. Cơ chế hoạt động của PIs.............................................................................................. 25 
1.3.4. Ứng dụng của chất ức chế protease .............................................................................. 28 
1.3.5. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và 
ngoài nước ..................................................................................................................... 
 31 
1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris ................................ 35 
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 37 
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 37 
2.1.1 Vật liệu.. .................................................................................................................... 37 
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu.. ............................................................................................. 39 
2.1.3. Hóa chất. ................................................................................................................... 39 
2.1.4. Máy móc thiết bị ........................................................................................................... 39 
2.1.5. Dung dịch và môi trường sử dụng ................................................................................ 40 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 42 
2.2.1. Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên ............................... 43 
iv 
2.2.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử .................................................................. 43 
2.2.3. Phân tích dữ liệu metagenomics ................................................................................... 43 
2.2.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế 
plasmid mang gen PIs ................................................................................................... 
47 
2.2.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ 
biểu hiện E. coli (DE3) ................................................................................................ 
48 
2.2.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ 
biểu hiện nấm men Pichia pastoris .............................................................................. 
49 
2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease ......................................................... 50 
2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs 
tái tổ hợp ....................................................................................................................... 
52 
2.2.9. Phân tích thống kê ......................................................................................................... 52 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 53 
3.1. Thu thập mẫu hải miên .............................................................................................. 53 
3.2. Kết quả tách chiết DNA metagenome ....................................................................... 54 
3.2.1. Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển 
Quảng Trị ...................................................................................................................... 
 54 
3.2.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử .......................................................... 55 
3.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết 
hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt 
Nam bằng tin sinh học ................................................................................................ 
56 
3.3.1. Lắp ráp reads của DNA metagenome ........................................................................... 56 
3.3.2. Kết quả dự đoán gen ..................................................................................................... 58 
3.3.3. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen ............................................................... 60 
3.3.4. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia 
vesparium QT2 biển Quảng Trị ................................................................................... 
 64 
3.3.5. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ 
liệu (CSDL) metagenomics ......................................................................................... 
 71 
3.4. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia 
coli ................................................................................................................................. 
 75 
3.4.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT ................................ 76 
v 
3.4.2. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs ..................................................... 78 
3.4.3. Biểu hiện gen PIs trong E. coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 79 
3.4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT 
ở trạng thái tan cao nhất ................................................................................................ 
81 
3.4.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng 
khối phổ ........................................................................................................................ 
87 
3.4.6 Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease .................................. 89 
3.5. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men 
Pichia pastoris .............................................................................................................. 
91 
3.5.1. Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT ........................................................................... 91 
3.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT ..................................... 92 
3.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168 ........................................ 93 
3.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm 
men ................................................................................................................................ 
96 
3.5.5. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS-
PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % ........................................................................ 
97 
3.5.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. pastoris SMD 
1168 [pPIC9/PI-QT] ..................................................................................................... 
 98 
3.5.7. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P. 
pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B .................................................. 
 104 
3.5.8. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT ......................................................... 106 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 112 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .......................................................... 113 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 114 
vi 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
ACN Acetonitrile 
Amp Ampicillin 
BLAST Basic Local Alignment Search Tool 
bp, kb, kDa Base pair, Kilo base, Kilo dalton 
CFU Colony forming units 
CSDL Cơ sở dữ liệu 
CTAB Cetyl trimêtylamôni brômua 
ĐC Đối chứng 
DN Đà Nẵng 
DNA Deoxyribonucleic Acid 
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 
đtg Đồng tác giả 
DTT Dithiothreitol 
E. coli Escherichia coli 
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 
EtBr Ethidium bromide 
FA AntiFoam 
HMA High microbial abundance 
IAA 3-Indolebutyric acid 
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 
KH&CN Khoa học và Công nghệ 
LB: Luria-Bertani 
LMA Low microbial abundance 
mRNA Messenger RNA 
NCBI National Center for Biotechnology Information 
P. pastoris Pichia pastoris 
PCR Polymerase Chain Reaction 
PIs Protein inhibitors 
QT Quảng Trị 
vii 
RNA Ribonucleic acid 
RNase Ribonuclease 
SCUBA Self contained underwater breathing apparatus 
SDS Sodium dodecyl sulphate 
TAE Tris-Acetic-EDTA 
Taq polymerase Polymerase Thermus aquarius 
TBS Tris-buffered saline 
TE Tris- EDTA 
TFA Axit trifluoroacetic 
TQ Trung Quốc 
VSV Vi sinh vật 
viii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.2. Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên 32 
Bảng 2.1. Thành phần của bản gel polyacryamide ....................................................................... 42 
Bảng 3.1. Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển 
Quảng trị ....................................................................................................................... 
54 
Bảng 3.2. Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2 ........................................................ 57 
Bảng 3.3. Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen 
(mẫu QT2) .................................................................................................................... 
59 
Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2) ......................................................... 60 
Bảng 3.5. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia 
vesparium QT2 theo giới và ngành ............................................................................... 
65 
Bảng 3.6. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia 
vesparium QT2 đến lớp và bộ ....................................................................................... 
66 
Bảng 3.7. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia 
vesparium QT2 đến họ; chi ......................................................................................... ... AGGC GAGTACTGGT CAGCCGCCCT TCCTCTCGAA AGCCCCGACT GCTCTTCGTT 
351 GCAGTGGTCG GGTAGTCCGG GACGTTTACT TTGAAAAAAT TAGAGTGTTC AAGGCAGGCC 
421 TACGCCTGAA TACATTAGCA TGGAATAATG GAAGAGGACC TCGGTCCTAT TTTGTTGGTT 
491 TCCAGGGCCG AAGTAATGAT TAAGAGGGAC AGTTGGGGGC ATTCGTATTT AATTGTCAGA 
561 GGTGAAATTC TCGGATTTAT GAAAGACGAA CAACTGCGAA AGCATTTGCC AAGGATGTTT 
631 TCATTAATCA AGAACGTTAG TTAGGGGTTC GAAGACGATC AGATACCGTC GTAGTCCTAA 
701 CCATAAACTA TGCCGACTAG GGATCGGTGG ATGTTAGCGT TTGACTCCAT CGGCACCTTA 
771 TGAGAAATCA AAGTCTTTGG GTTCCGGGGG GAGTATGGTC GCAAGGCTGA AACTTAAAGG 
841 AATTGACGGA AGGGCACCAC CAGGAGTGGA GCCTGCGGCT TAATTTGACT CAACACGGGG 
911 AAACTCACCA GGTCCAGACA TAGTAAGGAT TGACAGATTG AGAGCTCTTT CTTGATTCTA 
981 TGGGTGGTGG TGCATGGCCG TTCTTAGTT 
22 
Phụ lục 10. Blast một số trình tự axit amin được chú giải là chất ức chế 
protease từ CSDL metagenomics QT2 
contig000433 Prokka_41698 Serpin B8 
Met N T G K T S K R P F L W L Met C L V S L L F A G C N N L S A I F S D E G R D E P E T V S I D T N 
V V T A N T Q F G F D L F N E I R K I E Q D K N I F I S P L S I S I A L A MetT L N G A S G E T E Q A 
Met A N T L H L Q G L G S E A I N P G Y A G L R Q A L Q V A D P K V I L T I A N S L W A R Q D V P 
F K Q D F L Q R N T E Y F G A E V S T L N F T D P N T L P T I N Q W I N T N T N G K I T K I L D E I N 
P D T V L F L I N A I Y F K G T W Q T E F D P S R T R D G T F Y L A T G A E K Q I P Met Met T R T G 
D Y P Y Y E N N D A K F Q A I S L P Y G D G R Met S Met Y I F L P Y P E S D I N T F L D G L N T E N 
W E S W V S Q L R D Q E L F L S Met P K F K L E Y E K T L N N P L Q S L G Met G I A F A P G L A D 
F S Q Met A D L E A L G Q N L Y I G E V L H K A V V E V N E E G T E A A A V T S V G I R A T S A P 
P A F Met A N R P F F F A I R D N E T K T V L F Met G T V V D P Stop 
23 
contig000046 Prokka_10704 Serpin (serine protease inhibitor) 
Met T K Q L I N A T I I A C V G L I Y L L G C S G E E D V L H E D E L L E Met S L E E G A P T A P D 
G C A I L A K P A G F T D N A L S E A N A K F G F K L L A E L Y N Q K P N K N V F I S P L S I S I A L 
T Met T Y N G A R G A T K Q A Met A K T L E I E G Met D L G A V N Q A N A E L R E I L K S A D P Q 
I E L A I A N S I W L R N T F D E V N P D F L D R N D R F F G A E I A S L D F D D P Q T V E T I N Q 
W V N T N T Q G K I K E I L G E I E E H E V Met F L I N A I Y F K G G W K G K F D A S K T Q D G V 
F H L L D G G E K Q V P Met Met S H T C N Y S Y L E S G D F R A V G L P Y G E G R V S Met Y I F L 
P E H S S N L D E F L A D L N A E N W E N W L S R F W N E R D L R F I Met P R F R L E Y G Met L L 
N D A L K A L G Met E I A F I P Y V A N L E G I A P L L F I E K V I H K T F L E V N E E G T E A A A V 
T L V S P P P A S T P G P F V V N R P F F F A I H D N W T N T I L F Met G I V V E P MetStop 
24 
contig003635, Prokka_126438 Serpin B9 
Met I K R Q H P E P T G R G R N A G R G R R F S I P A A L L L L S P A G C G L L E P D V E E I Met R 
L P R A L T A G E I E V I R A S N R F A F D L L A Q A N E A N E N L F L S P L S A S Met A L G Met S 
Met N G A D G E T W N Q Met R D V L G F G S L A E E E I N D S Y K S L I E L L V G L D P T V E T A I 
G N S V W T R S G F P V V P D F L N T V R E V F G A E V A E L D F A S P S A S E R I N E W V N D A 
T R G R I E D I V P D V I P A G V V Met Y L L N A I Y F K G S W T F Q F D P S K T R T E P F H L D D 
G S T R T V P L Met T L S K T L P Y R E D G R F Q A V D L P Y G G R A F T Met T V L L P G Q G V S 
V D T L A A N L D A G E W E D V A D G F R D T D V T L F L P R F R Met S Y E R Met L N D D L A A 
L G Met V D A F D P Y R A D F T R L S P V A P L A I S E V K Q K S W V D V N E E G T E A A A V T S 
A G T Y T G G V P V V R A D R P F L F F I R E R L S G T I L F A G K F A S P T A E Stop 
25 
contig000199 Prokka_21375 Serpin 
MDNEQSEHRPDSGNRVRGAARRGWLPGAGAVLLLAAAGCGGPSTVPVPGLPPIPGVPPADPPSAPELPR
ALSATEVDVIAAGNRFGFDLLREANRPGDNLFLSPFSASMALGMTMNGAGGETWNQMRDALGFGGLT
EEEINAGYASLIQVLTELDPAVETAIGNSVWTRLGFPLRAEFVDVLREFFGAEAAELDFAGPSASGRVNE
WVRSATGGHIEEIVPDPIPPAVLMFLINAIYFNAPWTFEFDPDDTRTEPFYPEDRSPREVPLMTILRDFLYL
ETSRFQAVDLPYGGGAFSMTVLVPREDVRVDDVVASLDAPAWSDVTGGFEETEVELFLPRFRMEYERE
LKDDLAALGMVDAFSPGKADLTRLSPVDLSISSVRQKALVEVTEEGTEAAAATVVIGVTSAPPPPVTVR
ADRPFLFFIRERLTGAIIFVGKVAHPPPR 
26 
Prokka_130363 
Met K T Q L T L L L A L L A P L P A L S I G Y V Y T G V G D D G R Q H L E L T S V T V D V Q I D E 
R I A R T R T D Q I F T N H A E W E V E G I Y E F T L P E G A I I T D L V L W I G D K R I Q G E V L E 
K E E A R R T Y D D I V G R R I D P A L I E Q V S P N Q F R L S I F P F P A K G S R R V E F E Y Met Q 
L L E S H S G R L D Y S F P L A P E T D Q P L Q Met E L F V L R A Q V R S Q H A F E A T T S G L P R 
L T E I D R P D A H R A N I F F G D E K I K P R E D F T L T I R Q T D D R P K P T V L S F A P R A N D 
D L G Y Y A L W L P P L P E L T R D G P L P R S L T F V I D I S S S Met Q E G K L R A V K G A L T A 
A I D A L D A G D L F N I V V F T H R A N S F A A A P V P A D P D N K K A A T A F I N Q Q D A L G 
V S N F E A G L G R A Met Q Q A F P A N R V N H V I F L T D G L P T I G E L E L A S L S E Met V G E 
W S A G Q A R L F T I G V G Q D V D Q G F L S G L A E D H R G E A Y F L S E E G D I E A A L Q E L 
F E S F T F P I L L L D E L S F D Q V E I H D V H P R G L E T L A A G R E L F Q V G R Y R G G G T F 
T L S L A G H Met G E E N Met S L D F P L E F T Q T D V S G S L I P R L W A Y Q K I Q A L E E Q I S 
R F G E K Q E L L D D I L A L G L E Y R L V T R R T S L F A P D D G V E V N P Q P R D Q V A L N F 
G G I D D L F D S S S E S D Q E E D D E F F S T A V N D A R P T T H W L G R D F F L Y D E V W I D L 
A Y Q P G Met P R E L Y E S R T Y Q P A E L A H F A R L G Q A Met L V V V E E R A Y E I P A D A Q 
G S R P V L L Q N A P N P F N A S T T I S F L I P F R L A N E P T R L S I Y N L A G Q L V R V L Q L E 
A L Q A G E H R L S W D G R D D Y G R E V A S G V Y I Y R L D V G E W A V H R R Met L L L R Stop 
27 
Phụ lục 11. Trình tự gen, axít amin của PI-QT 
Trình tự gen 
1 ATGACAAAAC AGTTGATTAA TGCAACGATC ATCGCATGTG TCGGATTGAT TTATCTGCTT GGGTGTTCAG 
71 GTGAAGAAGA TGTGTTGCAT GAGGATGAAC TTCTTGAGAT GTCTCTTGAA GAAGGAGCCC CAACGGCACC 
141 TGATGGGTGT GCAATTTTAG CAAAGCCTGC TGGTTTCACC GATAATGCAC TGTCCGAAGC AAATGCAAAG 
211 TTCGGCTTTA AACTACTCGC CGAACTGTAT AATCAAAAAC CCAACAAAAA CGTCTTTATC TCCCCATTAA 
281 GCATTTCGAT AGCTTTGACC ATGACATATA ATGGTGCCAG AGGCGCAACA AAACAGGCAA TGGCAAAGAC 
351 GCTAGAGATC GAGGGAATGG ACCTGGGTGC GGTCAACCAA GCTAACGCCG AGTTACGAGA AATCCTTAAG 
421 AGCGCAGATC CCCAGATTGA ACTTGCCATC GCCAACTCGA TCTGGCTACG GAACACGTTT GATGAAGTAA 
491 ATCCCGATTT CCTTGACCGA AATGATCGAT TCTTTGGCGC AGAGATTGCT TCGCTTGATT TTGACGATCC 
561 GCAAACAGTA GAGACCATCA ACCAATGGGT GAACACGAAC ACACAGGGAA AAATCAAGGA GATTCTAGGT 
631 GAAATTGAGG AGCACGAAGT TATGTTCCTG ATTAACGCCA TCTATTTTAA GGGCGGCTGG AAAGGAAAGT 
701 TCGACGCATC AAAAACACAG GACGGTGTTT TCCATCTGTT GGATGGTGGC GAGAAGCAGG TGCCCATGAT 
771 GTCCCACACC TGCAATTATT CGTATCTTGA GAGCGGAGAC TTTAGGGCTG TTGGCTTACC TTATGGAGAG 
841 GGACGTGTAA GCATGTATAT CTTTCTGCCG GAGCATTCCT CCAATCTTGA CGAATTTCTT GCAGATTTGA 
911 ACGCCGAGAA CTGGGAGAAC TGGCTGTCGC GGTTTTGGAA TGAACGGGAT TTGAGATTTA TAATGCCTCG 
981 CTTTAGACTA GAGTATGGAA TGCTTCTCAA TGACGCGCTC AAAGCACTCG GCATGGAAAT TGCCTTTATT 
1051 CCGTACGTAG CCAATCTTGA GGGCATTGCG CCTCTTTTGT TTATTGAAAA AGTCATACAC AAAACTTTTT 
1121 TGGAAGTCAA CGAAGAAGGC ACCGAAGCGG CTGCCGTAAC GTTGGTTAGT CCACCACCGG CGAGCACTCC 
1191 GGGGCCCTTT GTTGTAAACC GCCCCTTTTT CTTCGCCATC CATGACAATT GGACAAACAC AATATTGTTC 
1261 ATGGGAATTG TCGTCGAACC GATGTAG 
Trình tự axit amin 
Met T K Q L I N A T I I A C V G L I Y L L G C S G E E D V L H E D E L L E Met S L E 
E G A P T A P D G C A I L A K P A G F T D N A L S E A N A K F G F K L L A E L Y N 
Q K P N K N V F I S P L S I S I A L T Met T Y N G A R G A T K Q A Met A K T L E I E 
G Met D L G A V N Q A N A E L R E I L K S A D P Q I E L A I A N S I W L R N T F D E 
V N P D F L D R N D R F F G A E I A S L D F D D P Q T V E T I N Q W V N T N T Q G 
K I K E I L G E I E E H E V Met F L I N A I Y F K G G W K G K F D A S K T Q D G V F 
H L L D G G E K Q V P Met Met S H T C N Y S Y L E S G D F R A V G L P Y G E G R 
V S Met Y I F L P E H S S N L D E F L A D L N A E N W E N W L S R F W N E R D L R 
F I Met P R F R L E Y G Met L L N D A L K A L G Met E I A F I P Y V A N L E G I A P 
L L F I E K V I H K T F L E V N E E G T E A A A V T L V S P P P A S T P G P F V V N 
R P F F F A I H D N W T N T I L F Met G I V V E P MetStop 
28 
So sánh trình tự acid amin nhằm tìm kiếm chức năng gen tương đồng trên ngân 
hàng dữ liệu Uniprot. 
Phụ lục 12. So sánh kết quả giải trình tự gen tách dòng trong pUC57, pET-
32a(+) với gen đích 
Chú thích: gen MK359987.1 là mã số trình tự gen đích đăng ký trên NCBI 
29 
Phụ lục 13. Các phương pháp sử dụng trong thu hồi và nhận diện protein 
PI-QT 
13.1. Thu protein từ môi trường nuôi cấy bằng phương pháp tủa muối 
Môi trường nuôi cấy tế bào được ly tâm 5000 v/p, 10 phútthu dịch nổi. Sau đó 
tủa protein bằng muối (NH2)2SO4. Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi 
để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein. Tủa bằng muối là một phương 
pháp phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: 
đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối Ở nồng độ 
muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, 
tính tan của protein giảm mạnh (salting out).Vì vậy, khi muốn tách 1 protein từ một 
hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao 
cho phù hợp nhất với protein mục tiêu. 
Tiến hành tủa protein ở 4 dải nồng độ muối khác nhau ở điều kiện 4 ºC với 2 loại muối 
(NH2)2SO4. 1 loại của Trung Quốc, 1 loại của hãng Merk (Đức). 
Nồng độ Khối lượng muối; thể tích cuối cùng 
0-30 % 16.98 g; 109.02 ml 
30-50 % 12.04 g; 106.39 ml 
50-75 % 16.36 g; 108.69 ml 
75-100 % 17.92 g; 109.52 ml 
Bổ sung lượng muối cần thiết vào phần dịch sau ly tâm, lắc ở 4 ºC, trong vòng 12 h. Ở 
mỗi nồng độ muối, sau khi tủa chúng tôi tiến hành thu dịch tủa và ly tâm 12000 v/p 
trong 30 phút ở 4 ºC để thu protein. Sau đó, lượng tủa protein được hòa lại trong đệm 
Tris/HCl 50 mM, pH 7.0, vortex cho tan đều và ly tâm 1 lần nữa để loại bỏ cặn còn sót 
lại. Các hỗn hợp protein được tủa ở các nồng độ khác nhau được kiểm tra bằng điện di 
SDS-PAGE.Sau đó dựa vào kích thước lý thuyết protein quan tâm, chúng tôi cắt băng 
30 
protein ra khỏi bản gel và tiến hành thủy phân, tách chiết protein để nhận diện bằng 
khối phổ MS/MS. 
13.2 Tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel với cột Sephacryl-S200 trên hệ thống 
FPLC 
Sắc ký lọc gel dùng để phân tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước 
các phân tử. Hỗn hợp protein thu được sau khi tủa với muối (NH4)2SO4được loại muối 
bằng phương pháp thẩm tích ở 4 ºC trong 24 h. Dịch protein sau loại muối được cho 
qua cột sắc kí lọc gel với chất giá Sephacryl-S200. Mẫu được thôi bằng hệ thống thôi 
mẫu tự động FPLC với tốc độ dòng 0.5 ml/ phút bằng dung dịch đệm Tris/HCl 50mM 
pH 7.0 có bổ sung Sodium azide (NaN3) 0.2 %,thu mỗi phân đoạn 2 ml. Kiểm tra các 
phân đoạn bằng điện di SDS-PAGE. Sau đó gộp các phân đoạn chứa protein quan tâm 
và cho qua màng lọc cut off 30 kDa (Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit) sản 
phẩm thu được sẽ gồm 2 phần: phần hỗn hợp protein30 kDa.2 phần 
sản phẩm được kiểm tra điện di SDS-PAGE. Dựa vào kích thước tính toán lý thuyết 
của protein quan tâm, chúng tôi tiến hành nhận diện băng protein bằng các phương 
pháp thủy phân trong gel, tách chiết và nhận diện protein mục tiêu bằng phân tích khối 
phổ MS (quy trình như mục 5.4). 
13.3. Thu protein từ vi khuẩn E. coli 
Thu 1L dịch tế bào và ly tâm ở 4000 v/p trong 10 phút ở 4 ºC loại môi trường. Cặn 
tế bào được rửa và hòa lại trong 100 mL dung dịch đệm lysis buffer (Tris/HCl 50mM, 
Triton X-100 0.5 %, lysozyme 10 µg/mL, pH 7.0) ủ ở 30ºC trong 30 phút. Sau đó tế 
bào được phá vỡ bằng siêu âm với xung ngắn (200-300 µA) khoảng 3s trong đá lạnh. 
Siêu âm cho đến khi dịch tế bào hết nhầy và tan đều. Tiếp tục ly tâm dịch tế bào 14000 
v/p, 30 phút ở 4 ºC để tách phần dịch nổi và cặn tế bào.Kiểm tra điện di phần dịch nổi 
và cặn tế bào bằng điện di SDS-PAGE.Đưa phần dịch nổi qua cột sắc kí ái lực Ni-NTA 
agarose và rửa các protein không bám bằng đệm Tris HCL 50 mM với 5 mM 
Imidazol.Protein bám cột được thôi bằng Imidazol với các nồng độ ,100 mM, 300 mM 
và 500 mM. Các phân đoạn sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE. 
31 
Sau đó băng protein quan tâm được bằng các phương pháp thủy phân trong gel, tách 
chiết và nhận diện protein mục tiêu bằng phân tích khối phổ MS (quy trình như mục 
5.4). 
13.4. Nhận diện và phân tích protein bằng phương pháp proteomics/tin sinh học 
Nhận dạng protein bằng khối phổ: Quá trình thực hiện khối phổ liên tiếp được tiến 
hành trên máy khối phổ QSTAR - XL, vận hành ở chế độ IDA (Information Dependent 
Acquisition) để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm 
trong dải khối (TOF mass) từ 400 đến 1200 sang khối phổ liên tiếp trên 3 ion phân tử 
có mật độ cao nhất và lớn hơn 15 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst 
QS v1.4 (AppliedBiosystems, Mỹ). Sai số về khối (mass tolerance) được đặt ở mức 
100 ppm, thời gian thực hiện không lặp lại MS/MS đối với mỗi mảnh là 90 giây. Hiệu 
điện thế được đặt để ion hoá mẫu trong dung dịch đi ra từ đầu Fused Silica PicoTip là 
2200V. Các protein được nhận dạng thông qua phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience 
Ltd., London, Anh). 
Tìm kiếm protein bằng phần mềm Mascot v1.8 : Dữ liệu phổ khối (MS/MS) được phân 
tích bằng phần mềm Mascot v1.8. Đây là phần mềm có khả năng phân tích dữ liệu phổ 
MS/MS để nhận dạng protein dựa trên thuật toán Mowse được phát triển bởi Matrix 
Science (Matrix Science Ltd., London, Anh) (Pappin et al., 1993). Ngân hàng Dữ liệu 
được dùng để tìm kiếm trong Mascot là Uniprot, một Ngân hàng Dữ liệu các protein 
không lặp lại và toàn diện về hệ protein của người mới nhất được cài đặt trên một máy 
tính HP Proliant Server (s/n:2UA5100LXZ). Các thông số tìm kiếm bằng phần mềm 
Mascot như sau: 
Enzyme thủy phân: Trypsin; 
Sai số khối lượng peptide: ± 0,5 Da; 
Sai số khối lượng của các mảnh ion trong phổ MS/MS: ± 0,5 Da; 
Trạng thái điện tích của ion phân tử được chọn: + 2,+ 3, và +4; 
Cải biến cố định: Carbamindomethyl (C); 
Cải biến biến đổi: oxy hóa (methionin) xảy ra trong quá trình thủy phân; 
32 
Mức độ chính xác được đặt mặc định: 99,5 %. 
Việc phân tích dữ liệu phổ khối giới hạn trong Ngân hàng Dữ liệu protein của vi sinh 
vật của toàn bộ Ngân hàng Dữ liệu Uniprot. Với các thông số như trên phần mềm 
Mascot đưa ra những protein/peptide có điểm số > 30 sẽ đảm bảo độ tương đồng cao 
giữa các phổ thực nghiệm và phổ lý thuyết với mức ý nghĩa p < 0,05. Sau đó, các 
protein được xác nhận lại bằng phần mềm Peak (Canada). 
33 
Phụ lục 14: Phân tích nhận diện phổ MS/MS của các mảnh peptide từ 
protein tái tổ hợp đã được thủy phân bằng Trypsin 
Coverage: 30.3% 
34