Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
LÊ THIÊN MINH 
NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS 
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN 
TRÊN NGÔ VÀ LẠC 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 62420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
Hà Nội – 2014 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
LÊ THIÊN MINH 
NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS 
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN 
TRÊN NGÔ VÀ LẠC 
 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
 Mã số: 62420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU 
2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM 
Hà Nội - 2014 
 i
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa 
Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều 
kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên 
trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông 
nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ 
môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường 
Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều 
kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi 
thực hiện luận án này. 
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng 
Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực 
hiện luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại 
học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn 
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh. 
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và 
các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện 
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện 
Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học 
Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ 
quý báu đó. 
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt 
nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ 
của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi. 
 Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014 
 Lê Thiên Minh 
 ii
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng 
tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực 
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào 
khác. 
 Hà nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014 
 Tác giả 
Lê Thiên Minh 
 iii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
ADN Axit deoxyribonucleic 
ARN Axit ribonucleic 
EDTA Axit etylen diamin tetra axetic 
SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate 
TCA Axit trichloroaxetic 
v/p vòng / phút 
v/v Thể tích/thể tích 
vvm thể tích/thể tích/phút 
w/v Trọng lượng /thể tích 
X Axit amin bất kỳ 
WHO Tổ chức Y tế thế giới 
Tm Nhiệt độ tan chảy 
FDA Cục quản lý Thực phNm và Dược phNm Hoa kỳ 
TE Tris EDTA 
PCR Polymerase chain reaction 
SDS Sodium dodecyl sulfate 
TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) 
EtBr Ethydium bromit 
dNTP Deoxiribonucleotit triphosphat 
A. flavus Aspergillus flavus 
A. parasiticus Aspergillus parasiticus 
NOR Norsolorinic acid 
AVN Averantin 
HAVN 5’ hydroxyaverantin 
OAVN Oxoaverantin 
AVNN Averufanin 
AVF Averufin 
VHA Versiconal hemiacetal acetate 
VAL Versiconal 
VERB Versicolorin B 
VERA Versicolorin A 
DMST Demethylsterigmatocystin 
DHDMST Dihydro demethylsterigmatocystin 
ST Sterigmatocystin 
DHST Dihydro sterigmatocystin 
OMST O-methylsterigmatocystin 
DHOMST Dihydro-O-methylsterigmatocystin 
AFB1 Aflatoxin B1 
AFB2 Aflatoxin B2 
AFG1 Aflatoxin G1 
AFG2 Aflatoxin G2 
 iv
Danh môc c¸c b¶ng 
STT Tên bảng Trang 
1 Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin 8 
2 Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực ph
m 12 
3 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò 12 
4 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi 13 
5 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus 14 
6 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2 40 
7 Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt 
Nam 
44 
8 Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và 
lạc 
45 
9 Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô 
và lạc 
47 
10 Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu 
ngô và lạc 
48 
11 Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các 
mẫu ngô và lạc 
49 
12 Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các 
mẫu ngô và lạc 
50 
13 Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập 52 
14 Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên 
môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin 
54 
15 Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo 
tỉ lệ 1:1 
55 
16 Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi 58 
17 Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng 60 
18 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng cơ thể chuột 63 
19 Bảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi 
trường khác nhau 
66 
 v
20 Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy 
khác nhau 
67 
21 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ 
m môi trường đến khả năng tạo bào tử của 
chủng A. flavus DA2 
68 
22 Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2 69 
23 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A. flavus DA2 70 
24 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus 
DA2 
71 
25 Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian 
bảo quản khác nhau 
72 
26 Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế ph
m A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 
bằng sắc ký TLC 
76 
27 Bảng 3.19 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các 
tỷ lệ khác nhau 
77 
28 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển 
sinh khối của A.flavus DA2 
80 
29 Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số 
tỉnh Việt Nam 
82 
30 Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 
trong đất trồng ngô sử dụng chế ph
m AF 
84 
31 Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên 
ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch 
86 
32 Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế ph
m AF trên 
ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng 
89 
33 Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin 
trong đất trồng lạc được bón chế ph
m AF 
91 
34 Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên 
lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch 
92 
35 Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên 
lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng 
93 
 vi
Danh môc c¸c h×nh 
STT Tên hình Trang 
1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin 6 
2 Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền 9 
3 Hình 1.3 Khu
n lạc A.flavus 15 
4 Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi 15 
5 Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 17 
6 Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi tỷ lệ AF36 tăng 29 
7 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14 52 
8 Hình 3.2 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus 
DA2 
53 
9 Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus 
nuôi cấy trên cơ chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC) 
54 
10 Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14 
trên đĩa thạch 
56 
11 Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5% 59 
12 Hình 3.6 Sản ph
m multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus 
AF14 
59 
13 Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15 
thế hệ 
61 
14 Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus 
DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ 
61 
15 Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2 65 
16 Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau 75 
17 Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế ph
m A.flavus DA2 ở các thời điểm 
cấy khác nhau 
78 
18 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của 
thuốc bảo vệ thực vật 
81 
 vii
19 Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô 83 
20 Hình 3.14 Khu
n lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô 
được bón chế ph
m AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/2007-
6/2008) 
85 
21 Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế 
ph
m AF 
87 
22 Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế ph
m AF 88 
23 Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế ph
m AF 88 
24 Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế ph
m AF sau thời gian bảo 
quản 6 tháng 
90 
25 Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên 
đất trồng lạc 
92 
26 Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế ph
m AF sau thời gian bảo 
quản 6 tháng 
94 
1??C L?C
Trang
L?I ??M ?N.i
L?I CAM ?OAN..ii
DANH M?C CÁC KÝ HI?U VÀ CH? VI?T T?T.......iii
DANH M?C CÁC B?NG...iv
DANH M?C CÁC HÌNH ?NH, ?? TH?....vi
M????U....4
CH??NG I. T?NG QUAN TÀI LI?U................................................................................ 6
1.1 T?NG QUAN V? AFLATOXIN................................................................................... 6
1.1.1 C?u t?o.................................................................................................................... 6
1.1.2 Tính ch?t hóa lý...................................................................................................... 7
1.1.3 ??c tính c?a aflatoxin............................................................................................ 8
1.1.4 Th?c tr?ng nhi?m aflatoxin trên ngô, l?c ............................................................. 9
1.1.5 Gi?i h?n aflatoxin cho phép trong nông s?n th?c ph?m .................................. 11
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS ......................................................................................... 13
1.2.1 ??c ???m hình thái ............................................................................................... 13
1.2.2 Các y?u t???nh h??ng ??n s? sinh tr??ng c?a A. flavus ................................ 15
1.2.3 ???u ki?n sinh aflatoxin ....................................................................................... 16
1.3 PHÒNG CH?NG S? NHI?M AFLATOXIN............................................................... 19
1.3.1 Bi?n pháp canh tác nông nghi?p ........................................................................ 19
1.3.2 Bi?n pháp sau thu ho?ch..................................................................................... 20
1.3.3 Bi?n pháp sinh h?c .............................................................................................. 21
1.4 PHÒNG CH?NG AFLATOXIN B?NG CH?NG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN ................................................................................................................... 22
1.4.1 C? ch? ki?m soát n?m m?c và aflatoxin b?ng các ch?ng A.flavus không sinh
aflatoxin......................................................................................................................... 22
1.4.2 Tuy?n ch?n các ch?ng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân ??i kháng
....................................................................................................................................... 24
1.5 NGHIÊN C?U ?NG D?NG CH? PH?M N?M A. FLAVUS KHÔNG SINH ??C T?
TRONG PHÒNG CH?NG AFLATOXIN ......................................................................... 26
21.5.1 S?n xu?t ch? ph?m A. flavus không sinh aflatoxin ........................................... 26
1.5.2 ?ánh giá hi?u qu? c?a ch? ph?m A. flavus không sinh aflatoxin ? quy mô
phòng thí nghi?m và nhà kính ..................................................................................... 27
1.5.2 ?ánh giá hi?u qu? c?a ch? ph?m A. flavus không sinh aflatoxin ? quy mô
??ng ru?ng.................................................................................................................... 28
1.5.3 ?ánh giá tác ??ng c?a ch? ph?m ....................................................................... 30
1.5.4 Các y?u t???nh h??ng ??n hi?u qu? ch? ph?m................................................. 31
CH??NG II. V?T LI?U VÀ PH??NG PHÁP NGHIÊN C?U......................................... 33
2.1 V?T LI?U, HÓA CH?T VÀ THI?T B? NGHIÊN C?U................................................ 33
2.1.1 V?t li?u nghiên c?u.............................................................................................. 33
2.1.2 Hóa ch?t, d?ng c? nghiên c?u............................................................................ 33
2.1.4 Môi tr??ng nghiên c?u ....................................................................................... 34
2.2 PH??NG PHÁP NGHIÊN C?U............................................................................... 34
2.2.1 Ph??ng pháp l?y m?u ......................................................................................... 34
2.2.2 Ph??ng pháp phân l?p........................................................................................ 35
2.2.3 Sàng l?c s? b? các ch?ng sinh và không sinh aflatoxin b?ng ph??ng pháp
phát quang .................................................................................................................... 36
2.2.4 Phân tích aflatoxin b?ng s?c ký ??n m?ng ........................................................ 36
2.2.5 Phân tích aflatoxin b?ng s?c ký l?ng cao áp ..................................................... 36
2.2.6 Nuôi c?y n?m m?c A. flavus cho vi?c nghiên c?u kh? n?ng t?o aflatoxin ...... 36
2.2.6 Xác ??nh kh? n?ng c?nh tranh c?a các ch?ng A. flavus không sinh aflatoxin
??i v?i ch?ng A. flavus sinh aflatoxin......................................................................... 37
2.2.7 Nghiên c?u kh? n?ng t?o bào t? c?a ch?ng A. flavus DA2 ? các ???u ki?n nuôi
??y khác nhau ............................................................................................................... 37
2.2.8 Quy trình nuôi c?y n?m m?c A. flavus DA2 ? qui mô phòng thí nghi?m......... 38
2.2.9 T?o ch? ph?m ch?a bào t? ch?ng A. flavus DA2 (ch? ph?m AF)..................... 38
2.2.10 ??nh l??ng m?t ?? bào t? A. flavus trong  ...  feed in North
Vietnam. Natural toxin 3: 445-449.
130.Wicklow D. T., Bobell J. R., Palmquist D. E. (2003) Effect of intraspecific
competition by Aspergillus flavus on aflatoxin formation in suspended disc culture.
Mycological Research. 107: 617–623.
131.Widstrom N. W., Wilson D. M., McMillian W. W. (1981) Aflatoxin contamination
of preharvest corn as influenced by timing and method of inoculation. Applied and
Environmental Microbiology, 42: 249–251.
132.Willian and Wilkins (1994) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Baltimore, Maryland 21202 USA
133.World health organization (1979) Mycotoxin. Published under the joint sponorship of
United Nation Enviroment Programme and the World Health Organization,
134.Yabe K., Ando Y. (1987) Simple method for screening aflatoxin producing molds by
UV photography. Applied and environmental Microbiology, 53: 230 -234.
108
135.Yang G., Rose M. S., Turgeon B. G., Yoder O. C. (1996) A polyketide synthase is
required for fungal virulence and production of the polyketide T-toxin. Plant Cell 8:
2139–2150.
136.Yang Z. Y., Shim W. B., Kim J. H., Chung D. H. (2004) Detection of aflatoxin ?
Production Mold in Korean Fermented Food and Grain by Multiplex PCR. Journal of
Food Protection, 67:2622-2626.
137.Yu J. (2008) Aspergillus flavus strain 70 O-methyltransferase (omt-1) gene,
complete cds. Genbank L25835.1
138.Yu J., Chang P. K., Ehrlich K. C., Cary J. W., Bhatnagar D., Cleveland T. E., Payne
G. A., Linz J. E., Roloshuk C. P., Bennett J. W. (2004) Clusted Pathway Genes in
Aflatoxin Biosynthesis. American Society for Microbiology, 70: 1253-1262.
139.Yu J., Woloshuk C. P., Bhatnagar D., Cleveland T. E. (2000) Cloning and
characterization of avfA and omtB gene involved in aflatoxin biosynthesis in three
Aspergillus species. Gen 248:157-167.
140.Zhu C. R., Du M. J., Lei D. N., Wan L. Q. (1989) A study on the inhibition of
aflatoxin B1 induced hepatocarcinogenesis by the Rhizopus delemar. Materia
Medica Polona, 21: 87-91.
109
DANH M?C CÁC CÔNG TRÌNH ?Ã CÔNG B? C?A LU?N ÁN
1. Lê Thiên Minh, Nguy?n Ti?n Nam, Nguy?n Thùy Châu. (2010). Hi?u qu? c?a ch?
ph?m Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin ?? phòng ch?ng afltoxin trên l?c.
??p chí Nông nghi?p và Phát Tri?n Nông thôn, (5/2010). pp (81-85).
2. Lê Thiên Minh, Nguy?n Thùy Châu. (2010). Tác d?ng c?a ch?ng A. flavus DA2 không
sinh và phòng ch?ng aflatoxin trên ngô ? giai ???n ngoài ??ng và trong quá trình b?o
qu?n. T?p Chí Nông nghi?p và Phát tri?n Nông thôn, (6/2010). pp (30-34)
3. Lê Thiên Minh, Nguy?n H?ng Hà, Nguy?n Th? Xuân Sâm, Nguy?n Thùy Châu. (2011).
Nghiên c?u s?n xu?t ch? ph?m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin ?? phòng ch?ng
aflatoxin. H?i ngh? Khoa h?c Toàn qu?c v? C?????n Nông nghi?p và B?o qu?n Ch? bi?n
Nông s?n, Th?c ph?m. NXB Khoa h?c và K? thu?t. (1/2011). pp.213-219
110
PH? L?C
Ph? l?c 1. ???ng chu?n aflatoxin B1
Ph? l?c 2: ??u trúc b?ng có cu?ng th? bình và th? bình c?a ch?ng A. flavus DA2
111
Ph? l?c 3: Khu?n l?c ch?ng A. flavus AF14
Ph? l?c 4: Ch?ng A. flavus AF14 phát quang trên môi tr??ng th?ch
112
Ph? l?c 5: ?óng túi cho kh? trùng môi tr??ng cám tr?u chu?n b? nhân nuôi A.flavus DA2
Ph? l?c 6: Nuôi c?y b? m?t A.flavus DA2
113
Ph? l?c 7 ?? th?ng lên men b? m?t s?n xu?t ch? ph?m AF
Ph? l?c 8 Sinh kh?i n?m A. flavus DA2 trong quá trình nuôi cây b? m?t
114
Ph? l?c 9 Ch? ph?m AF s?n xu?t t? ch?ng A. flavus DA2
Ph? l?c 10 Cán b? Vi?n C?????n nông nghi?p và cán b? phòng nông nghi?p huy?n Yên L?c, V?nh
Phúc h??ng d?n s? d?ng ch? ph?m và ki?m tra mô hình s? d?ng ch? ph?m AF cho cây l?c
115
Ph? l?c 11 Ru?ng l?c s? d?ng ch? ph?m AF
Ph? l?c 12 Ru?ng l?c không s? d?ng ch? ph?m AF
116
Ph? l?c 13 ??c l?c s? d?ng ch? ph?m (A) và không s? d?ng ch? ph?m (B) AF
Ph? l?c 14 Mô hình b?o qu?n l?c s? d?ng ch? ph?m AF
117
Ph? l?c 14 Mô hình s? d?ng ch? ph?m AF cho cây ngô
Ph? l?c 15 Mô hình b?o qu?n ngô s? d?ng ch? ph?m AF
118
Ph? l?c 15 Thi?t k? các c?p m?i ??c hi?u aflR, nor, omt và ver b?ng ph?n m?m PC/GENE
===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE===
*********************
* PRIMER EVALUATION *
*********************
PCR product: 1034 bp
Sequence selected is AFLRGENE.
Total number of bases is: 1692.
Amplified region is the complete sequence.
Plus strand primer is user-defined.
Minus strand primer is user-defined.
Tm parameters
 Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+]
 Optimal Tm: 73
 Acceptable Tm range: 58-88
 Salt concentration: 50 mM
 Primer DNA concentration: 250 pM
Primer composition parameters
 Optimal primer length: 20
 Acceptable primer lengths: 15-25
 Maximum single base repetition: 3
 Number of bases for 3' GC clamp: 2
 Acceptable range for %GC: 40-60 %
Primer binding parameters
 Maximum number of bases for primer self-complementarity: 4
 Maximum allowable stem size in stem-loop formation: 4
 Maximum percent of bases complementary to other template regions: 70 %
 Maximum number of bases complementary between + and - primers: 3
 ---------------------------------------
Plus strand primer evaluation
=============================
 Plus strand primer is (5' --> 3') TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
 Origin of primer is FILE AFLR1
 Tm: 72
 DeltaG: -62
 Length: 24
 %GC: 71
 Restriction enzyme site(s):
 AhyI AvaI BssKI CauII
 HpaII ScrFI SecI SfaNI
 SmaI
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
119
 - a single base repeat containing more than 3 bases is present.
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to itself.
 - primer forms a stem-loop.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Plus strand primer - template binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
PLUS-PRIMER TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG
 ||||||||||||||||||||||||
AFLRGENE ATAGAGGGGGGCCCGTAGAGGGCC LOCATION: 193 to 216
 ---------------------------------------
Minus strand primer evaluation
==============================
 Minus strand primer is (5' --> 3') CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
 Origin of primer is FILE AFLR2
 Tm: 67
 DeltaG: -53
 Length: 24
 %GC: 67
 Restriction enzyme site(s):
 AlwNI BsrI
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - %GC is not within the acceptable range.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Minus strand primer - template' binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
MINUS-PRIMER CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG
 ||||||||||||||||||||||||
AFLRGENE GGCAGTCTGTCGGTGACCTGTGCC LOCATION: 1203 to 1226
===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE===
*********************
* PRIMER EVALUATION *
*********************
PCR product: 399 bp
Sequence selected is NOR_1.
Total number of bases is: 1503.
Amplified region is the complete sequence.
Plus strand primer is user-defined.
Minus strand primer is user-defined.
120
Tm parameters
 Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+]
 Optimal Tm: 72
 Acceptable Tm range: 57-87
 Salt concentration: 50 mM
 Primer DNA concentration: 250 pM
Primer composition parameters
 Optimal primer length: 20
 Acceptable primer lengths: 15-25
 Maximum single base repetition: 3
 Number of bases for 3' GC clamp: 2
 Acceptable range for %GC: 40-60 %
Primer binding parameters
 Maximum number of bases for primer self-complementarity: 4
 Maximum allowable stem size in stem-loop formation: 4
 Maximum percent of bases complementary to other template regions: 70 %
 Maximum number of bases complementary between + and - primers: 3
 ---------------------------------------
Plus strand primer evaluation
=============================
 Plus strand primer is (5' --> 3') ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC
 Origin of primer is FILE NOR1
 Tm: 73
 DeltaG: -62
 Length: 25
 %GC: 72
 Restriction enzyme site(s):
 AciI Cfr10I Eco56I HpaII
 MwoI NaeI
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - GC clamp has less than 2 bases.
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to itself.
 - primer binds to the other primer.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Plus strand primer - template binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
PLUS-PRIMER ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC
 |||||||||||||||||||||||||
NOR_1 TGGCGATGCGGCCGTGAGAGCCGTG LOCATION: 501 to 525
 ---------------------------------------
Minus strand primer evaluation
121
==============================
 Minus strand primer is (5' --> 3') GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG
 Origin of primer is FILE NOR2
 Tm: 72
 DeltaG: -60
 Length: 25
 %GC: 68
 Restriction enzyme site(s):
 AciI AluI CfrI Fnu4HI
 HaeIII TaqI
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to the other primer.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Minus strand primer - template' binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
MINUS-PRIMER GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG
 |||||||||||||||||||||||||
NOR_1 CAACCGGCGGTCGAAGCTGTGAGGC LOCATION: 875 to 899
===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE===
*********************
* PRIMER EVALUATION *
*********************
PCR product: 795 bp
Sequence selected is OMT_1.
Total number of bases is: 2969.
Amplified region is the complete sequence.
Plus strand primer is user-defined.
Minus strand primer is user-defined.
Tm parameters
 Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+]
 Optimal Tm: 69
 Acceptable Tm range: 54-84
 Salt concentration: 50 mM
 Primer DNA concentration: 250 pM
Primer composition parameters
 Optimal primer length: 20
 Acceptable primer lengths: 15-25
 Maximum single base repetition: 3
 Number of bases for 3' GC clamp: 2
 Acceptable range for %GC: 40-60 %
Primer binding parameters
122
 Maximum number of bases for primer self-complementarity: 4
 Maximum allowable stem size in stem-loop formation: 4
 Maximum percent of bases complementary to other template regions: 70 %
 Maximum number of bases complementary between + and - primers: 3
 ---------------------------------------
Plus strand primer evaluation
=============================
 Plus strand primer is (5' --> 3') GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC
 Origin of primer is FILE OMT1
 Tm: 68
 DeltaG: -52
 Length: 28
 %GC: 60
 Restriction enzyme site(s):
 AsuI AvaII MaeI Tth111I
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - GC clamp has less than 2 bases.
 - primer binds to itself.
 - primer forms a stem-loop.
 - primer binds to the other primer.
 - primer pair Tm values are not within 5 degrees C.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Plus strand primer - template binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
PLUS-PRIMER GTGGACGGACCTAGTCCGACATCACTCG
 ||||||||||||||||||||||||||||
OMT_1 CACCTGCCTGGATCAGGCTGTAGTGAGC LOCATION: 964 to 991
 ---------------------------------------
Minus strand primer evaluation
==============================
 Minus strand primer is (5' --> 3') GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG
 Origin of primer is FILE OMT2
 Tm: 73
 DeltaG: -65
 Length: 23
 %GC: 76
 Restriction enzyme site(s):
 AcyI BbeI BsiYI BsrI
 Eco78I HaeII HgiCI HhaI
 Hin6I KasI NarI [others]
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - a single base repeat containing more than 3 bases is present.
123
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to itself.
 - primer binds to the other primer.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Minus strand primer - template' binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
MINUS-PRIMER GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGG
 |||||||||||||||||||||||
OMT_1 CAGCCGCGGTGCGTGACCCAACC LOCATION: 1734 to 1758
===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE===
*********************
* PRIMER EVALUATION *
*********************
PCR product: 537 bp
Sequence selected is VER_1.
Total number of bases is: 5498.
Amplified region is the complete sequence.
Plus strand primer is user-defined.
Minus strand primer is user-defined.
Tm parameters
 Tm = delta H/(delta S + R * ln(C/4)) - 273.15 + 16.6 log[Na+]
 Optimal Tm: 71
 Acceptable Tm range: 56-86
 Salt concentration: 50 mM
 Primer DNA concentration: 250 pM
Primer composition parameters
 Optimal primer length: 20
 Acceptable primer lengths: 15-25
 Maximum single base repetition: 3
 Number of bases for 3' GC clamp: 2
 Acceptable range for %GC: 40-60 %
Primer binding parameters
 Maximum number of bases for primer self-complementarity: 4
 Maximum allowable stem size in stem-loop formation: 4
 Maximum percent of bases complementary to other template regions: 70 %
 Maximum number of bases complementary between + and - primers: 3
 ---------------------------------------
Plus strand primer evaluation
=============================
 Plus strand primer is (5' --> 3') CCGTGAGGCCGCGGAGAAAGTGGT
 Origin of primer is FILE VER1B
124
 Tm: 70
 DeltaG: -59
 Length: 24
 %GC: 67
 Restriction enzyme site(s):
 AciI DsaI Fnu4HI FnuDII
 HaeIII NspBII SacII SecI
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - GC clamp has less than 2 bases.
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to itself.
 - primer binds to the other primer.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Plus strand primer - template binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
PLUS-PRIMER CCGTGAGGCCGCGGAGAAAGTGGT
 ||||||||||||||||||||||||
VER_1 GGCACTCCGGCGCCTCTTTCACCA LOCATION: 511 to 534
 ---------------------------------------
Minus strand primer evaluation
==============================
 Minus strand primer is (5' --> 3') GGGGATATACTCCCGCGACACAGCC
 Origin of primer is FILE VER2
 Tm: 67
 DeltaG: -57
 Length: 25
 %GC: 64
 Restriction enzyme site(s):
 AciI FnuDII
 PRIMER DOES NOT MEET ALL USER-DEFINED CRITERIA:
 - a single base repeat containing more than 3 bases is present.
 - %GC is not within the acceptable range.
 - primer binds to the other primer.
 PRIMER BINDS TO THE TARGET STRAND AT 1 SITE(S)
 PRIMER BINDS TO THE COMPLEMENTARY STRAND AT 0 SITE(S)
Minus strand primer - template' binding:
[Note: Locations are given relative to the original template sequence.]
MINUS-PRIMER GGGGATATACTCCCGCGACACAGCC
 |||||||||||||||||||||||||
VER_1 CCCCTATATGAGGGCGCTGTGTCGG LOCATION: 1023 to 1047
===18-MAR-2007====================PCRPLAN=====================PC/GENE===