Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm

1 
MỞ ĐẦU 
Tính cấp thiết của đề tài 
Khoa học công nghệ và ứng dụng của nó đời sống ngày càng 
được quan tâm của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Những 
ứng dụng của khoa học và công nghệ vào cuộc sống ngày càng thể 
hiện sự quan trọng của lĩnh vực này. Các hợp chất có nguồn gốc 
thiên nhiên dần thay thế các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Sự phát 
triển của công nghệ sinh học đã giúp xã hội phát triển theo hướng 
thích ứng với tự nhiên, quá trình tổng hợp các hợp chất tự nhiên từ vi 
sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Các hợp chất có 
nguồn gốc tự nhiên được thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ 
chu trình sống của chúng. So với các hợp chất được tổng hợp bằng 
con đường hóa học, tổng hợp bằng phương pháp sinh học có những 
ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện 
với môi trường và có tính chất bền vững. 
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất của một polyme, nó có 
thể được tạo ra bằng cách sử dụng axit glutamic thông qua phương 
thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai là sử dụng vi sinh vật 
có khả năng tổng hợp polyme từ quá trình sinh trưởng và phát triển 
của vi sinh vật đó. Bản chất là một polyme có khả năng phân hủy, 
không độc với con người, tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu 
và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý 
môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình 
lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học. Trong công 
nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ 
gia ổn định chất lượng sản phẩm, trong y dược γ-PGA được dùng 
như các chất mang, chất giữ ẩm... 
Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả 
năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ có trong các sản phẩm nước 
ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền 
thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, 
Chao Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng 
dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng 
hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus cũng như các sản 
phẩm và vi khuẩn này tạo. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có 
nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hướng phát triển, 
bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi 
2 
trường sống. Để đáp ứng nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng 
hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong 
thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi 
khuẩn Bacillus và tạo ra những sản phẩm mới đáp ứng những nhu 
cầu bức thiết của xã hội hiện nay. 
Mục tiêu nghiên cứu của luận án: 
 Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi 
sinh vật. 
 Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào trong các sản 
phẩm thực phẩm 
Nội dung nghiên cứu gồm 
 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có 
khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ các sản phẩm thực phẩm lên men 
truyền thống. 
 Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy cho chủng lựa 
chọn để thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic. 
 Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm của axit poly γ 
glutamic. 
 Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào một 
số sản phẩm thực phẩm. 
Những đóng góp mới của luận án 
 Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ 
thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng 
giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng 
hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc và 
đặc tính của γ-PGA. 
 Bước đầu ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong việc ổn định 
trạng thái, màu sắc, hương vị của nước cam và trong chế biến và bảo 
quản, cũng như cải thiện độ giòn, dai, màu sắc trong sản xuất giò. 
 Bố cục của luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số 
liệu 53 hình và 130 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước; trong đó: 
Mở đầu (2 trang); Chương 1 Tổng quan (37 trang), Chương 2 Vật 
liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương 3 Kết quả và 
thảo luận (58 trang), Chương 4 Kết luận (1 trang), Danh mục các 
công trình nghiên cứu với 4 bài báo đã công bố (1 trang), Tài liệu 
tham khảo (10 trang) 
Chương 1. TỔNG QUAN 
3 
Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và 
ngoài nước đề cập đến các vấn đề chính sau: 
1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic 
1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam 
1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. 
1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam 
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 
1.4 Tính chất γ-PGA 
1.5 Phân loại γ-PGA 
1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 
1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 
1.7.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng 
1.7.2. Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men 
1.7.3. Phương pháp lên men γ-PGA 
1.8 Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA. 
1.8.1. Định tính và định lượng γ-PGA 
1.8.2. Thu nhận và tinh sạch γ-PGA 
1.8.3. Đánh giá cấu trúc và khối lượng phân tử của γ-PGA 
1.8.4. Xác định khối lượng phân tử γ-PGA. 
1.9 Ứng dụng γ-PGA 
1.9.1. Trong lĩnh vực môi trường 
1.9.2. Trong lĩnh vực y dược 
1.9.3. Trong lĩnh vực nông nghiệp 
1.9.4. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm 
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu 
2.1.1. Nguồn phân lập: tương Bần, tương Nam Đàn, chao Đại 
Bình Dương, mắm Rươi Tứ Kỳ, Natto - Nhật Bản và Thua Nao -Thái 
2.1.2. Hóa chất: Agarrose (Merck), ethidium bromide, PCR 
buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs), kit 
tinh sạch sản phẩm PCR (Promega), cặp mồi đọc trình tự 16SF và 
16SR (Invitrogen), marker protein (hãng Sigma) 
2.1.3. Môi trường nuôi cấy: môi trường LB và đặc hiệu E. 
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị: Máy đo mật độ quang - Ultrospec 
2000 uv/vis (Pharmacia Biotech); Máy li tâm lạnh -Avanti TM 30 
Centifuge Beckman (Đức); Máy đo cấu trúc - Texture Analyser 
4 
TA.XT Plus (Đức); Máy đo phổ hồng ngoại Nicole 6700 FT-IR 
(Đức); Thiết bị lên men phòng thí nghiệm BioTron (Hàn Quốc) 
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 
2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử: sử dụng bộ kit 
API 50CHB (BioMérieux, Pháp) và giải trình tự gen 16S rRNA 
2.2.2. Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng 
hợp γ-PGA theo phương pháp đơn yếu tố 
2.2.3. Phương pháp toán học - tối ưu điều kiện nuôi cấy theo 
quy hoạch thực nghiệm - Box-Behnken với phần mềm Desgin Expert 
2.2.4. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh: Đo quang, 
HPLC, GPC, SDS-PAGE, đo độ quay cực, đo huyền phù Krop 
2.2.5. Phương pháp đánh giá cảm quan. 
2.2.6. Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γ-PGA 
đến chất lượng giò lụa bằng phương pháp đo lực nén, lực cắt và 
cường lực gel. 
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng 
hợp Poly γ-glutamic. 
Từ các mẫu, phân lập bằng môi trường thạch LB, sau đó quan sát 
hình thái khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, kết quả sau thu được 27 
chủng vi khuẩn trên tổng số 40 chủng vi sinh vật qua các phương 
pháp hình thái, nhuộm bào tử, nhuộm gram. Tiến hành nuôi cấy 27 
chủng vi khuẩn này trên môi trường đặc hiệu, thu được chủng phân 
lập được 7 chủng có khả năng phát triển mạnh trên môi trường đặc 
hiệu sau 72 h nuôi cấy. Từ 7 chủng thu được thông qua nuôi cấy trên 
môi trường đặc hiệu E, cho thấy hai chủng B5 và T1 là hai chủng tạo 
ra độ nhớt lớn nhất từ 5,2 – 5,3cp. 
Hình 3.1. Sự tạo màng của các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu 
5 
Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả năng sinh tổng hợp 
γ-PGA của các chủng chỉ mang tính chất định tính, được nhiều 
nghiên cứu sử dụng như thước đo γ-PGA. Tuy vậy chưa thể kết luận 
có γ-PGA trong thành phần dịch nhớt, để chứng minh trong dịch 
nhớt có γ-PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt và thủy phân kết tủa 
bằng HCL 6N, dịch sau thủy phân được đem đi thẩm tách loại muối 
và chạy sắc ký bản mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn là axit 
glutamic và chất hiển thị màu là ninhydrin. Kết quả cho thấy băng 
chạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng B5 chỉ xuất hiện một vết ở vị 
trí tương đương với vết của axit glutamic chuẩn. Điều đó chứng tỏ 
dịch nhớt của canh trường lên men có chứa γ-PGA. Để đánh giá 
chính xác hơn khả năng sinh γ-PGA, 7 chủng tạo màng trên một lần 
nữa được đem nuôi trên môi trường đặc hiệu và thu nhận sau 24 h. 
Đem đi xử lý và định lượng γ-PGA bằng đo phổ hấp thụ quang tại 
vùng tử ngoại. Nghiên cứu cho thấy cho thấy hàm lượng γ-PGA tạo 
thành cao nhất là hai chủng B5 và T1 với giá trị lần lượt là 5,564 g/l 
và 5,041 g/l sau 96h nuôi cấy và khả năng sinh γ-PGA mạnh nhất là 
thời điểm 96h của các chủng phân lập được. 
Dựa trên các kết quả đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA bằng 
phương pháp phổ tử ngoại và các đặc điểm hình thái thấy hai chủng 
vi khuẩn có mã hiệu B5 và T1 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA lớn 
nhất trong số 7 chủng vi khuẩn phân lập được. Trên cơ sở đó lựa 
chọn hai chủng vi khuẩn B5 và T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γ-
PGA. 
3.2. Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA 
3.2.1. Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng 
kit API 50CHB 
Dựa vào kết quả phân loại theo các đặc tính: hình thái khuẩn lạc, 
tế bào, khả năng sinh bào tử, khả năng nhuộm Gram, nhu cầu oxy, 
ảnh hưởng của pH, nồng độ muối... 
Đánh giá khả năng sử dụng các loại đường của 2 chủng với bộ Kit 
API 50 CHB và đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS để 
đánh giá thu được kết quả trong bảng 3.6 
6 
Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 
50 CHB 
TT Phép thử 
Khả năng 
sử dụng TT Phép thử 
Khả năng sử 
dụng 
B5 T1 B5 T1 
0 Đối chứng - - 25 Esculin + + 
1 Glycerol + + 26 Salixin + + 
2 Erythritol - - 27 Xelobiose + + 
3 D-Arabinose - - 28 Mantose + + 
4 L-Arabinose + + 29 Lactose + + 
5 Ribose + + 30 Melibiose + - 
6 D-Xylose - + 31 Saccarose + + 
7 L-Xylose - - 32 Trehalose + + 
8 Adonitol - - 33 Inulin - - 
9 -Metyl-D-Glucozit - - 34 Melezitose - - 
10 Galactose - - 35 Rafinose + + 
11 Glucose + + 36 Tinh bột + + 
12 Fructose + + 37 Glycogen + + 
13 Manose + + 38 Xylitol - - 
14 Sorbose - - 39 Gentiobiose + + 
15 Rhamnose - - 40 D-Turanose + - 
16 Dulxitol - - 41 D-Lyxose - - 
17 Inozitol + + 42 D-TAgartose - - 
18 Mannitol + + 43 D-Fucose - - 
19 Sorbitol + + 44 L-Fucose - - 
20 -Metyl-D-Manozit - - 45 D-Arabitol - - 
21 -Metyl-D-Glucozit + + 46 L-Arabitol - - 
22 N-Acetyl-Glucosamin - + 47 D-TAgartose - - 
23 Amygdalin - + 48 2-ketogluconat - - 
24 Arbutin + + 49 5-ketogluconat - - 
(+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính 
7 
Sau khi kết hợp giữa việc đánh giá dựa trên đặc điểm sinh lý, sinh 
hóa và phần mềm API PLUS cho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ 
tương đồng với B. subtilis là 98% và độ tương đồng của vi khuẩn T1 
với loài B. subtilis là 73%. 
3.2.2. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử: 
Trình tự đoạn gen được giải trình tự trên hệ thống máy ABI 
3103XL, xác định được đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 có 1250 
bp và của T1 là 1516bp (phụ lục). Phân tích mối quan hệ phát sinh 
loài được tiến hành dựa trên thuật toán Maximum Likelihood, sử 
dụng phần mềm Phylogeny với dữ liệu trên ngân hàng gen NBCI, 
cho thấy các chủng vi sinh vật B5 và T1 đều có quan hệ gần nhất 
(98-99%) với loài B. subtilis. 
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 
Kết quả định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương 
pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 là chủng vi khuẩn 
có độ tương đồng 98-99% với B. Subtilis BA-71. Từ kết quả trên, 
luận án đã đề xuất định tên cho chủng vi khuẩn này là Bacillus 
subtilis B5. Đối với chủng T1 sau khi định danh bằng phương pháp 
hóa sinh cho thấy có độ tương đồng là là 73% và phương pháp sinh 
học phân tử cho kết quả có độ tương đồng với B. subtilis C-3-9 (98-
99%) nên chưa thể kết luận chủng T1 thuộc loài B. subtilis 
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng 
hợp γ-PGA 
3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA 
Những nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA cho thấy tiền chất để 
tạo thành γ-PGA chủ yếu là hợp chất glutamic, glutamat hay bột đậu 
tương. Việc bổ sung đậu tương dạng bột vào canh trường lên men 
không làm tăng lượng γ-PGA, không những vậy khi bổ sung đậu 
tương còn gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, ảnh 
hưởng đến sự hình thành của γ-PGA. Trong môi trường có chứa natri 
glutamat, hàm lượng γ-PGA tạo thành cao hơn trong môi trường có 
8 
chứa glutamic. Như vậy có thể sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền 
chất trong quá trình tạo γ-PGA thay thế cho axit glutamic trong toàn 
bộ quá trình nghiên cứu. 
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 
B. subtilis là loài vi khuẩn ưa ấm có khả năng sinh trưởng và phát 
triển tốt ở dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC. Để có thể tìm ra một chế độ 
nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi 
trường nghiên cứu có natri glutamat, trong điều kiện nuôi tĩnh, lên 
men tại các nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC và 45oC và 50oC để nuôi cấy, 
thu nhận kết quả 24h một lần, kết thúc quá trình lên men sau thời 
gian 120h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua đồ thị hình 3.9. Kết 
quả nghiên cứu cho thấy chủng B. subtilis B5 có khả năng sinh tổng 
hợp γ-PGA cao nhất ở nhiệt độ 40oC, tạo ra γ-PGA đạt giá trị lớn 
nhất 9,07 g/l tại thời điểm 96h lên men. 
3.3.3.Ảnh hưởng của tốc độ lắc. 
Tốc độ lắc của quá trình lên men được khảo sát ở tốc đô từ 0 – 
200 v/p, tốc độ lắc là thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho 
môi trường lên men. 
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ 
đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 
Hình 3.10 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 
đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 
Kết quả biểu diễn ở hình 3.10 cho thấy: lượng γ-PGA đạt giá trị 
lớn nhất ở tốc độ 0 v/p (10,36 g/l ), khi tốc độ lắc càng cao xu hướng 
hình thành γ-PGA càng giảm. Đối với mẫu nuôi tĩnh do không tạo áp 
lực tác động lên lớp vỏ tế bào, nên sự hình thành γ-PGA không bị 
ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men trong 
bình tam giác của các mẫu thí nghiệm vừa đủ để vi khuẩn sinh 
trưởng và tổng hợp γ-PGA. Do vậy, phương án nuôi tĩnh được lựa 
chọn cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo trên quy mô thí nghiệm. 
9 
3.3.4. Ảnh hưởng của pH. 
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới chủng B. subtilis 
B5, tiến hành khảo sát ở các giá trị pH từ 5 – 9. Kết quả cho thấy sự 
ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi khuẩn B. 
subtilis B5 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 5 và pH =9, khả năng 
sinh tổng hợp γ-PGA hầu là không thấy. Sự hình thành γ-PGA tăng 
mạnh trong khoảng pH từ 6 đến 8 trong thời gian 96h. Giá trị γ-PGA 
cao nhất (13,03 g/l) tại thời điểm 96h trong môi trường có pH = 8. 
3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng 
hợp γ-PGA. 
Nguồn carbon là phần cốt lõi để tạo lên bộ khung tế bào vi sinh 
vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn carbon 
phù hợp sẽ giúp sự phát triển của vi khuẩn Bacillus  ... PGA 
bằng phương pháp điện di trên SDS Page các mẫu sau khi tinh sạch 
cho thấy khối lượng phân tử các mẫu sau khi chạy điện di với marker 
hiển thị màu chuẩn có thể xác định được khối lượng phân tử của γ-
PGA lớn hơn 176 kDa. 
Đánh giá khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm γ-PGA trên 
sắc ký lọc gel (GPC) kết quả được sau khi tính toán dựa trên peak 
thu nhận được khối lượng phân tử trung bình Mw của γ-PGA dao 
động trong khoảng từ 158 – 426 Kda. Đối chiếu và so sánh với các 
nghiên cứu về γ-PGA tạo ra bởi chủng Bacillus subtilis cho thấy 
thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 kDa. 
3.8.2. Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-
PGA 
Từ γ-PGA được tạo thành từ B. subtilis B5 sau khi thủy phân 
băng axit và làm sạch sản phẩm đến độ tinh khiết nhất định, tiến 
hành đo độ phân cực của hỗn hợp đồng phân quang học D và L 
glutamic. Sau khi tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit là 
47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi B. 
subtilis B5. Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định cho nguồn gốc 
chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA là B. subtilis. 
3.8.3. Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA. 
Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ-PGA trên các 
môi trường axit citric có nồng độ từ 0 – 30g/l qua việc xác định độ 
nhớt của dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nồng 
độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm của γ-PGA tại nồng độ 1 
g/l. 
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của axit đến tính chất của sản phẩm γ-PGA 
Axit citric 
(g/l) 0 5 10 15 20 25 30 
pH 7 3,45 2,94 2,74 2,6 2,46 2,38 
Độ nhớt 
(cp) 
4,5 ± 
0,04 
4,0 ± 
0,03 
4,0 ± 
0,03 
3,5 ± 
0,02 
3,0 ± 
0,01 
2,5 ± 
0,01 
3,0 ± 
0,01 
Kết quả khi nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả năng tạo nhớt 
của γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l sự biến đổi độ nhớt 
không có sự thay đổi nhiều. Qua khảo sát này kết luận có thể sử dụng 
γ-PGA trong các sản phẩm đồ uống có độ axit cao. 
3.8.4. Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ-PGA 
18 
Để tìm hiểu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của γ-PGA 
hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ 1 g/l để 
ở các nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC và 125oC trong thời gian 30 
phút. 
Hình 3.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA 
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ nhớt γ-PGA tỷ lệ nghịch với 
nhiệt độ, khi bị tác động của nhiệt độ càng cao độ nhớt của γ-PGA 
càng giảm. Mức độ giảm độ nhớt của γ-PGA là rất nhỏ trong khoảng 
nhiệt độ từ 75-100oC. Đây cũng là một đặc tính ưu việt khi sử dụng 
γ-PGA áp dụng cho mỗi loại sản phẩm trong thực tế. 
3.9. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA 
3.9.1. Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA 
Sau khi nghiên cứu trên thực nghiệm thu được kết quả sấy phun 
tốt nhất đối với chế phẩm γ-PGA trong bảng 3.14: 
Bảng 3.14. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA 
 3.9.2. Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng 
làm phụ gia thực phẩm. 
Căn cứ theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN 4-
21:2011/BYT) về phụ gia thực phẩm – với các loại phụ gia chất làm 
dày. Căn cứ vào công bố sử dụng γ-PGA sản xuất từ vi khuẩn B. 
Chỉ tiêu Thông số 
Chất trợ sấy: Maltodextrin 5% 
Nhiệt độ sấy 160 oC 
Tốc độ đĩa phun 11.00-12.000 v/ph 
Hiệu suất thu hồi 85,8 -90,4% 
Lưu lượng dịch cấp 5 lít/h 
Đánh giá cảm quan Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng, 
dễ lấy sau khi sấy phun. Độ hòa tan 
tốt, không bị vón khi hòa tan 
19 
subtilis của Công ty Ajinomoto đã công bố đến Cục quản lý thực 
phẩm và dược phẩm Hoa kỳ về việc chấp nhận sử dụng γ-PGA từ B. 
subtilis như một loại phụ gia thực phẩm an toàn. Sau khi áp dụng 
những quy chuẩn kỹ thuật, sản phẩm γ-PGA được đem đi phân tích 
kiểm nghiệm tại các phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận. Từ 
các kết quả phân tích cùng một số mẫu được kiểm tra tại cơ quan 
chức năng, sản phẩm γ-PGA đã được Cục vệ sinh An toàn thực phẩm 
xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm 
PGA. Liều dùng thấp hơn 0,1% khối lượng sử dụng. 
3.10. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong ổn định nước cam 
3.10.1. Khảo sát chất lượng nguyên liệu 
Kết quả khảo sát thể hiện cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C khá 
cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số ở mức 9,0% cùng với hàm 
lượng axit hữu cơ tổng số 0,6 %. Sau khi đánh giá các công thức, tỷ 
lệ phối trộn trong nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm 30% 
là phù hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. 
3.10.2. So sánh ảnh hưởng của γ-PGA đến độ ổn định của nước 
cam với các phụ gia khác 
3.10.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định 
khác thông qua chỉ số huyền phù: 
Sử dụng γ-PGA cùng các loại phụ gia ổn định khác như CMC, 
Xanthan Gum, Agar ở cùng một nồng độ như nhau là 0,05%, chế 
biến ở cùng một chế độ công nghệ, sau khi phối chế, thanh trùng, bảo 
ôn và sau bảo ôn được đem đi phân tích chỉ số huyền phù không bền 
theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ phân tách của sản phẩm, 
cho kết quả trong đồ thị hình 3.32. 
Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia 
thường dùng khác trong việc ổn định cho nước cam 
20 
Chỉ số huyền phù không bền được sử dụng để đánh giá độ ổn 
định của nước cam. Nếu chỉ số này càng cao đồng nghĩa với chất 
lượng nước cam càng kém ổn định. Trước thanh trùng mẫu nước 
cam có bổ sung CMC có chỉ số huyền phù không bền thấp nhất nên 
độ ổn định cao nhất, trong khi đó độ ổn định của mẫu chứa γ-PGA 
thấp nhất. Tuy nhiên, sau quá trình thanh trùng, độ ổn định của nước 
cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt và còn cao hơn cả mẫu chứa 
CMC. Sau quá trình bảo ôn chỉ số huyền phù không bền trong tất cả 
các mẫu đều tăng dần phản ánh độ ổn định giảm nhưng mẫu chứa γ-
PGA vẫn giữ được độ ổn định cao hơn mẫu không bổ sung hóa chất 
khá nhiều. Hơn nữa, độ ổn định của mẫu bổ sung γ-PGA này đạt 
được thậm chí là vượt so với các mẫu bổ sung hai loại phụ gia thông 
dụng như CMC và Xanthan gum. Do đó γ-PGA có thể sử dụng làm 
phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, bởi nó giữ cho nước 
cam được luôn ở trạng thái đồng nhất, không bị lắng cặn, tách lớp. 
3.10.2.2. Ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước cam 
thông qua sự biến đổi độ nhớt. 
Sự ảnh hưởng của các chất phụ gia đến chất lượng nước cam đối 
với các chất phụ gia được khảo sát cho thấy các chỉ số độ nhớt của 
các mẫu đều bị giảm sau quá trình thanh trùng, điều đó chứng tỏ sự 
ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc của các phụ gia. Lý giải cho 
hiện tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan là do nồng độ axít 
trong nước cam ảnh hưởng đến độ bền của các cấu trúc phân tử các 
phụ gia này gây ra hiện tượng phân cắt mạch làm giảm độ nhớt 
3.10.2.3. Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam. 
Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy sự 
thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy sự biến đổi nhiều nhất của 
mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum và mẫu CMC xu hướng biến đổi 
màu sắc của các mẫu nước cam này là màu nhạt đi, thiên về màu 
vàng, các mẫu sử dụng Agar và mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm 
không thay đổi nhiều, tuy nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang 
màu đen, giảm tính cảm quan của sản phẩm. 
3.10.2.4. Đánh giá tính chất cảm quan của sản phẩm nước cam 
có sử dụng γ-PGA và các loại phụ gia khác. 
Kết quả đánh giá cảm quan trên các tiêu chí mùi, vị và trạng thái 
các chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA và CMC cho điểm đánh 
giá cao, sản phẩm chất lượng đồng nhất sau quá trình bảo ôn. Qua 
21 
đánh giá cảm quan về chất lượng sản phẩm khi sử dụng γ-PGA và 
một số phụ gia khác trong ổn định chất lượng sản phẩm nước cam, 
cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trong môi trường nước quả có 
độ axít từ 3g/l đến 5 g/l, tương tự như các chất phụ gia cùng loại như 
CMC và Xanthan Gum 
3.10.3. Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam 
Tiến hành các thí nghiệm với các nồng độ γ-PGA là 0,05%; 
0,10%; 0,15% và 0,20% trong sản phẩm nước cam, sau đó đem đi 
đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm. 
Bảng 3.21. Chất lượng cảm quan của nước cam ép đục ở các tỷ lệ 
bổ sung γ-PGA 
Chỉ tiêu đánh giá 
cảm quan 
Nồng độ bổ sung γ-PGA trong nước cam (%) 
ĐC 0,05 0,10 0,15 0,20 
Tổng điểm chưa 
có hệ số trọng 
lượng 
12 13,5 13,2 12,1 11,7 
Điểm chất lượng 16,52 17,8 17,41 15,6 15,04 
Xếp loại Khá Khá Khá Khá TB 
Kết quả thu được với nồng độ γ-PGA là 0,05% cho điểm chất 
lượng cao nhất, có điểm cảm quan về màu sắc, mùi vị và hình thái 
cao. Lựa chọn công thức tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản 
phẩm là 0,05%. 
3.10.4. Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng cảm 
quan của nước cam 
Nhiệt độ 80oC, 90oC và thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có 
hương tốt và màu sắc thì không đổi vàng đẹp. Ở nhiệt độ 100oC thì 
thời gian là 5 phút thì màu sắc và hương vị không đổi nhưng thanh 
trùng ở 10 phút và 15 phút thì sản phẩm có mùi nấu chín. Do vậy 
nghiên cứu đã đưa ra lựa chọn thanh trùng nước cam ở nhiệt độ 90oC 
cho thanh trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% trong 
thời gian 10-15 phút. 
3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lượng giò 
3.11.1. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt 
xay. 
Nghiên cứu này được dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo 
của khối thịt khi sử dụng mỗi loại phụ gia. Các phụ gia được sử dụng 
trong nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), 
22 
borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là những phụ 
gia đã được sử dụng và không được sử dụng trong ngành chế biến 
thực phẩm hiện nay. Các phụ gia được sử dụng mức giới hạn của Bộ 
Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh mục (hàn the) được sử 
dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích của việc sử 
dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh, gợi mở ra những thay đổi trong 
việc sử dụng phụ gia an toàn trong thực phẩm hình 3.36. 
Hình 3.36. Biểu đồ ảnh hưởng của 
phụ gia tạo cấu trúc đến chất lượng 
khối thịt xay. 
Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt 
của giò thành phẩm 
3.11.2. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến chất lượng của giò. 
3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén và lực cắt. 
Sự thay đổi về tính chất, cấu trúc của khối thịt xay trong quá trình 
làm giò đã phần nào đánh giá được mức độ ảnh hưởng của các loại 
phụ gia đến quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên để phân tích 
đánh giá cấu trúc của sản phẩm cần đánh giá trên các mẫu sản phẩm 
cuối cùng. Các mẫu phụ gia được bổ sung vào các mẫu giò nghiên 
cứu sau đó được chế biến trong cùng một điều kiện (bao gói tiêu 
chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ như nhau) các 
mẫu được bảo ôn và đem đi phân tích trên máy đo cấu trúc cho kết 
quả trong hình 3.37. 
Khi kết hợp giữa hai yếu tố lực nén và lực cắt lên sản phẩm giò có 
thể đánh giá được mức độ giòn, cứng của sản phẩm. Nhìn vào biểu 
đồ 3.37 về lực nén (LN) và lực cắt (LC) của máy đo cấu trúc phân 
tích giò thành phẩm cho thấy lực nén của các mẫu có sử dụng 
Chitosan và γ-PGA là lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi và độ 
cứng của giò thành phẩm là tốt nhất. Để đánh giá mức độ đồng nhất, 
độ đàn hồi về cấu trúc của giò tiến hành thử nghiệm cường lực gel 
23 
đối với các mẫu khi sử dụng các loại phụ gia khác nhau, kết quả cho 
thấy cường lực gel lớn nhất ở mẫu có sử dụng chitosan thấp hơn nữa 
lần lượt là các mẫu chứa γ-PGA; STPP; Tinh bột biến tính và thấp 
nhất là hàn the và mẫu đối chứng. Qua phân tích về cường lực gel 
một lần nữa khẳng định việc sử dụng chitosan và γ-PGA làm phụ gia 
ổn định cải thiện cấu trúc trong sản phẩm giò lụa là ưu việt và an 
toàn. 
3.11.2.2. Đánh giá chất lượng giò sử dụng các loại phụ gia tạo 
cấu trúc bằng phương pháp cảm quan 
Các mẫu giò sau khi được đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt 
được phân tích bằng phương pháp cảm quan để đánh giá chất lượng, 
kết quả cho thấy: Khả năng sử dụng các loại phụ gia thực phẩm trong 
việc ổn định và cải thiện chất lượng của giò được thử nghiệm so sánh 
giữa γ-PGA và 4 loại phụ gia khác hiện đang được sử dụng rộng rãi 
trên thị thường sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trạng 
thái, cho màu sắc đặc trưng của giò tươi, có thể thay thế các phụ gia 
độc hại như hàn the, tạo cấu trúc trong sản phẩm giò tốt hơn khi sử 
dụng các hợp chất photphat và các loại tinh bột biến tính. Về mặt 
ứng dụng thực tiễn và hiệu quả kinh tế chưa đáp ứng được như 
chitosan, nhưng ở một góc độ nhất định γ-PGA có khả năng tạo màu 
cho sản phẩm nên đây cũng là một lợi thế của γ-PGA trong quá trình 
ứng dụng. 
3.11.3. Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng của giò. 
Nghiên cứu về ảnh hưởng của γ-PGA đến khả năng ổn định, cải 
thiện cấu trúc của giò cho thấy ở nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện 
được chất lượng giò tốt hơn các phụ gia hiện đang sử dụng trên thị 
trường. 
Từ nghiên cứu thực tế cho thấy có thể sử dụng γ-PGA nồng độ 
0,20% làm phụ gia trong chế biến giò, nhằm cải thiện chất lượng giò, 
thay thế cho hàn the đang sử dụng tràn lan trên thị trường chế biến. 
KẾT LUẬN 
Sau một quá trình nghiên cứu, luận án đã thu được kết quả cơ bản 
sau: 
Từ các mẫu thực phẩm truyền thống đã phân lập được 27 chủng 
vi khuẩn và đã tuyển chọn được chủng B5 có khả năng sinh tổng hợp 
γ-PGA cao từ sản phẩm tương Bần. Bằng phương pháp xác định đặc 
24 
điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử đã định tên 
được chủng B5 là B. subtilis B5. 
Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và phương pháp quy 
hoạch thực nghiệm bậc 2 Box- Bernken đã xác định được điều kiện 
tối ưu chủng B. subtilis B5 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất natri 
glutamat là 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 
5%, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 39,7oC, pH = 8 sau thời gian 97 giờ thu 
nhận γ-PGA có nồng độ 25,02 g/l. 
Đã đưa ra quy trình thu nhận, tinh sạch chế phẩm γ-PGA dạng 
bột: Chủng giống Lên men Dịch lên men Bổ sung H2O gia nhiệt 
(100oC) Tảy màu, tảy mùi Lọc thô Lọc tinh Kết tủa bằng cồn 98% 
(2 lần, tỷ lệ 3:1) Thẩm tích γ-PGA Sấy phun (maltodextrin 5%, 
nhiệt độ 160oC ở 11.000 v/p, lưu lượng cấp dịch 5 l/h) Chế phẩm γ-
PGA dạng bột. Hiệu suất thu hồi γ-PGA trên thực tế triển khai quy 
mô pilot so với tính toán lý thuyết đạt 95%. 
Đã xác định được cấu trúc và một số đặc tính của sản phẩm γ-
PGA thu được: Mw>158 kDa, trong γ-PGA có chứa α NH+ và γ 
COO-; tỷ lệ đồng phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt 
trong vùng axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt trong khoảng 25–125oC 
và đáp ứng tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm, về vi sinh vật và 
hàm lượng kim loại nặng. 
Bước đầu thử nghiệm ứng dụng γ-PGA 0,05% trong ổn định nước 
cam tự nhiên và 0,1- 0,2% trong sản phẩm giò lụa cho kết quả tốt. 
Chế phẩm γ-PGA có thể dùng để thay thế hàn the trong chế biến bảo 
quản giò cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt khác. 
Các hướng nghiên cứu tiếp tục dự kiến. 
- Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong lĩnh vực nông nghiệp và mỹ 
phẩm 
- Nghiên cứu tạo γ-PGA từ các phụ phẩm của nhà máy chế biến 
thực phẩm 
- Nghiên cứu sản xuất các túi đựng sinh học từ γ-PGA