Luận án Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ / dioxin ở Biên hòa, Đồng nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
PHẠM QUANG HUY 
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT 
NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI 
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ 
CHỦNG PHÂN LẬP 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Hà Nội, 2021 
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
PHẠM QUANG HUY 
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT 
NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI 
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ 
CHỦNG PHÂN LẬP 
Chuyên ngành: Vi sinh vật học 
Mã số: 9 42 01 07 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà 
 Viện Công nghệ sinh học 
 TS. Nguyễn Kim Thoa 
 Viện Công nghệ sinh học 
Hà Nội, 2021 
i 
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và TS. 
Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công 
nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất 
cũng như động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất để tôi có thể thực hiện và 
hoàn thành luận án này. 
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học 
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận 
án. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã 
tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước: 
“Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 
nhằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS. 
TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm. 
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào 
tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục 
trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện. 
Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn, 
đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tôi tình yêu thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất 
để tôi học tập và hoàn thành tốt nội dung luận án. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn! 
 Hà Nội, ngàythángnăm 2021 
NCS. Phạm Quang Huy 
ii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các 
cộng sự khác. 
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công 
bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng 
tác giả. 
Các thông tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. 
 Hà Nội, ngàythángnăm 2021 
Tác giả 
NCS. Phạm Quang Huy 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... i 
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................... ii 
MỤC LỤC ............................................................................................................... iii 
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi 
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... ix 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4 
1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin .......................................................... 4 
1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và 
con người. ....................................................................................................... 4 
1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng.................... 5 
1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm ............................ 7 
1.2. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt 
cỏ/dioxin ....................................................................................................... 12 
1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm ......................... 12 
1.2.2. Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin ............ 13 
1.2.3. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 
chất diệt cỏ/dioxin ........................................................................................ 18 
1.3. Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô 
nhiễm POPs ................................................................................................. 19 
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27 
2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 27 
iv 
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 27 
2.1.2. Các hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................... 29 
2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 30 
2.1.4. Sơ đồ thí nghiệm .......................................................................................... 30 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 32 
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome ..................... 32 
2.2.2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu ...... 32 
2.2.3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ............ 32 
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like ........................... 33 
2.2.5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn 
hợp VSV ...................................................................................................... 34 
2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome ............................................... 35 
2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA 
metagenome.................................................................................................. 35 
2.2.8. Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR ................................ 36 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 39 
3.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn 
quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................ 40 
3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng 
phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng ..................... 40 
3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả 
năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng .................. 42 
3.2. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C 
và BHR ......................................................................................................... 46 
3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR ....................................... 46 
v 
3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C 
và BHR ......................................................................................................... 47 
3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR ................................................ 49 
3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc 
tính lý hóa của đất ........................................................................................ 69 
3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của 
metagenome C và BHR ............................................................................... 70 
3.2.6. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất 
diệt cỏ/dioxin ................................................................................................ 72 
3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome 
đã được phát hiện ......................................................................................... 76 
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................. 79 
4.1. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C 
và BHR thu được. ........................................................................................ 79 
4.2. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của 
metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và 
khoáng hóa dioxin). ..................................................................................... 92 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 95 
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN 
QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................................ 97 
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.................................................... 98 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 105 
PHỤ LỤC 
vi 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt 
cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn ....................................... 42 
Bảng 3.2. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt 
cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22 ................................................. 45 
Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt 
cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn ...................................... 45 
Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao ....................................................... 47 
Bảng 3.5. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48 
Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48 
Bảng 3.7. Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR ......... 52 
Bảng 3.8. Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả 
năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin ............................................. 57 
Bảng 3.9. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và 
BHR ............................................................................................ 66 
Bảng 3.10. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng 
trong tập dữ liệu chuẩn hóa ......................................................... 71 
Bảng 3.11. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4-
D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ 
liệu KEEG ................................................................................... 72 
vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB ................................. 4 
Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T ....... 5 
Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp 
chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương 
pháp sinh học. ................................................................................. 8 
Hình 1.4. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học ............................ 20 
Hình 1.5. Các bước thực hiện phân tích metagenomic ................................. 22 
Hình 2.1. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) ................... 27 
Hình 2.2. Mặt cắt dọc của lô xử lý. ............................................................... 28 
Hình 2.3. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học 
(ký hiệu BHR) ............................................................................... 28 
Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu .......................................................... 31 
Hình 2.5. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống 
MG RAST ..................................................................................... 37 
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, 
BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường 
MSM chứa dịch chiết đất .............................................................. 40 
Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét ..... 41 
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn ........................... 41 
Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp 
vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng 
vi khuẩn ......................................................................................... 42 
Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của 
chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ ................................. 43 
viii 
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921 ........... 43 
Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn ....... 44 
Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn ..... 45 
Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose ....................... 47 
Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng 
ngoài) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq ............... 51 
Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và 
BHR ............................................................................................... 52 
Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR ....... 53 
Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR ........ 54 
Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR ........ 55 
Hình 3.15. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR ....... 56 
Hình 3.16. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và 
BHR ............................................................................................... 63 
Hình 3.17. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và 
BHR ............................................................................................... 63 
Hình 3.18. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và 
BHR ............................................................................................... 63 
Hình 3.19. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR ...... 65 
Hình 3.20. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR ...... 65 
Hình 3.21. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong 
metagenome của mẫu C và BHR .................................................. 70 
Hình 3.22. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa 
metagenome C và BHR. ............................................................... 71 
ix 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Chú thích 
°C Độ C 
1,2,3,7,8-
PeCDD 
1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin 
2,3,7,8-
TCDD/F 
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin/ furan 
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (chất diệt cỏ) 
2,4,5-TCP 2,4,5-trichloropheno ... ....... 7 
1 
PHỤ LỤC I: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
1.1. Thu thập mẫu nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) 
Mẫu C được đồng nhất từ đất ô nhiễm lấy ở 5 hố (bằng máy xúc) thuộc khu 
vực Tây nam sân bay Biên Hòa với vị trí và độ sâu khác nhau (Hình 1.1). Đây là khu 
vực có địa hình tương đối bằng phẳng, cỏ không mọc được hay rất ít và thưa thớt bởi 
mức độ ô nhiễm rất phức tạp và không theo quy luật như đặc điểm chung của mẫu đất 
ô nhiễm POPs khác trên toàn thế giới. Đất ở các hố bị ô nhiễm với độ độc khác nhau 
dao động từ 241 ngTEQ/kg tới 801.115 ngTEQ/kg với màu sắc của đất chủ yếu là 
màu vàng trên bề mặt và màu nâu cho tới xám đen theo chiều sâu (Hình 1.1). 
Sự khác biệt về màu sắc của đất biểu hiện cho hoạt động của VSV bản địa 
theo các lớp là khác nhau. Khi mới đào lên mùi đặc trưng từ polyphenol nồng nặc. 
Khi không có tác động thì quá trình này vẫn luôn hiện hữu trong tự nhiên tuy nhiên 
khả năng và tốc độ phân hủy vẫn còn rất chậm. Việc đồng nhất mẫu phục vụ nghiên 
cứu tại hiện trường cũng được thực hiện và độ độc của mẫu nghiên cứu được xác 
định 21.605 ngTEQ/kg đất khô. Độ độc của mẫu C được xếp vào mức ô nhiễm nặng 
và cần phải loại bỏ theo WHO. Theo lý thuyết, đây cũng là độ độc ảnh hưởng rất 
lớn tới đa dạng VSV đất bởi khả năng sàng lọc và gây biến đổi gene với VSV đất. 
 Một lượng lớn đất khu vực này được chuyển ra bằng tàu từ Biên Hòa ra Hà 
Nội để phục vụ xây dựng mô hình tăng cường phân hủy sinh học quy mô pilot lên 
tới 150kg đất và các thí nghiệm phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất bằng tổ hợp VSV 
quy mô phòng thí nghiệm. Năm mươi (50 kg) đất được lưu trữ trong thùng phi 200 
lít và chôn dưới đất phục vụ nghiên cứu cùng với 0,5 kg đất được sử dụng trong 
tách chiết DNA metagenome. 
2 
32 011 
(ng TEQ/kg) 
16 567 
(ng TEQ/kg) 
801 115 
(ng TEQ/kg) 
7 528 
(ng TEQ/kg) 
241 
(ng TEQ/kg) 
10°58'14.3"N 106°48'19.3"E 
Hình 1.1. Vị trí thu thập mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) 
1.2. Thu thập mẫu đã xử lý làm sạch ô nhiễm (BHR) 
Mẫu BHR được lấy ở khu vực đã tiến hành khử độc trong hố chôn lấp tích 
cực. Đất ở lô xử lý được lấy bằng khoan chuyên dụng theo tiêu chuẩn của EPA Hoa 
Kỳ từ ít nhất 5-7 điểm trên 1 lô (mẫu BHR được đồng nhất từ đất thuộc 4 lô của 
3.384 m3 đất đã xử lý làm sạch). Tại các vị trí lấy mẫu, đất đồng nhất và có màu 
xám tro. Tổng độ độc của các mẫu thu thập ở khu vực này đều rất thấp từ 8,3 ng 
TEQ/kg cho tới 32 ng TEQ/kg và đạt ngưỡng dưới mức ô nhiễm đối với đất sử 
dụng trong nông nghiệp hàng năm theo TCVN (40 ng TEQ/kg đất khô - Quy chuẩn 
QCVN45:2012/BTNMT). 
32ngTEQ/kg 12ngTEQ/kg 11ngTEQ/kg 10ngTEQ/kg 
3 
11ngTEQ/kg 10ngTEQ/kg 8.3 ngTEQ/kg 12ngTEQ/kg 
10°57'46.4"N 106°49'22.6"E 
Hình 1.2. Vị trí thu thập mẫu đất đã xử lý làm sạch chất diệt cỏ/dioxin (BHR) 
1.3. Trình tự mồi và phân loại VSV 
Nhân dòng đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR từ DNA tổng số với cặp 
mồi 27F và 1492R. 
(27F): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’; 
(1492R): 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’ 
Hỗn hợp phản ứng PCR (20µl) gồm các thành phần sau: 
Thành phần Thể tích (µl) 
Buffer Taq 5X 2,4 
MgCl2 25 mM 2,4 
dNTPs 2,5 mM 1,6 
Mồi xuôi 20 µM 1,0 
Mồi ngược 20µM 1,0 
Taq DNA polymerase (5 U/µl) 1,0 
dd H2O 13,3 
AND khuôn 1,0 
4 
1.4. Chi tiết các bước tiến hành xác định hoạt tính laccase: 
Bước 1: Hút các thành phần phản ứng gồm 600 µl đệm acetate natri (20 mM, 
pH 5), 200 µl dịch enzyme. 
Bước 2: Xác định độ hấp thụ ánh sáng (AC) của dung dịch tại thời điểm τ = 0: 
Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước 1, voltex 
đều và chuyển sang cuvet, đọc giá trị độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 420 nm. 
Bước 3: Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng (AM) của dung dịch phản ứng 
tại thời điểm τ: Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần 
ở bước 1, voltex đều, trong thời gian τ (thường là 2 phút). Đọc giá trị độ hấp thụ ánh 
sáng ở bước sóng 420 nm. Lặp lại 2-3 lần để lấy giá trị độ hấp thụ ánh sáng trung 
bình. Công thức tính: 
6( ) 10M C pu f
E
A A V D
U
V  
Trong đó: 
U: Hoạt độ enzyme (U/l) 
ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm, ε420 = 36.000 (M-1 cm-1) 
Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) 
VE: Thể tích enzyme (200 µl) 
Aτ: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ 
A0: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ = 0 
Df: Độ pha loãng. 
Tpu: Thời gian phản ứng (2 phút) 
1.5. Tách chiết DNA dùng Kit 
Các bước tách chiết được thực hiện theo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất với 
các dung dịch sử dụng trong từng bước được ký hiệu lần lượt là C1, C2, C3, C4, C5. 
Các bước tiếp theo được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: 
- Bổ sung 250 µl dung dịch C2, vortex 5 giây. Ủ ở 4oC trong 5 phút 
- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng 
- Hút 600 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới 
5 
- Bổ sung 200 µl dung dịch C3, vortex nhẹ. Ủ ở 4oC trong 5 phút 
- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng 
- Hút 750 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới 
- Bổ sung 1.200 µl dung dịch C4 và vortex 5 giây 
- Hút 675 µl chuyển sang ống có màng lọc Spin Filter.Ly tâm 10.000 x g trong 1 
phút ở nhiệt độ phòng và loại bỏ dịch chảy qua filter. Lặp lại bước này 3 lần để hút 
hết phần dịch nổi 
- Bổ sung 500 µl dung dịch C5 vào ống Spin Filter, ly tâm 10.000 x g trong 30 giây 
ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua filter 
- Ly tâm lại một lần nữa ở tốc độ 10.000 x g trong 1 phút 
- Chuyển màng lọc Spin filter sang ống mới 
- Bổ sung 100 µl vào giữa màng filter và ly tâm 10.000 x g trong 30 giây. 
- Loại bỏ màng lọc, DNA thu được sẽ được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch và được 
bảo quản ở -20oC để gửi đi giải trình tự. 
Hình 1.3. Các bước tách chiết DNA theo kit MoBio đã cải tiến 
6 
1.6. Phương pháp đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm 
DNA hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm và số đọc A260 = 1 tương ứng với 
nồng độ 50 µg/ml của DNA sợi đôi có trong mẫu nghiên cứu. Do đó, dựa vào số 
đọc A260, nồng độ DNA được xác định theo công thức được trình bày bên dưới. 
Trong đó: A260: số đọc tại bước sóng 260 nm 
 A230: số đọc tại bước sóng 230 nm 
 Df: Hệ số pha loãng 
Công thức trên được áp dụng để xác định nồng độ DNA khi sử dụng tính 
năng hiệu chỉnh tín hiệu nền (Background Correction) tại bước sóng 230 nm (áp 
dụng cho acid nucleic) của máy Simplinano. 
Từ đó, hàm lượng DNA có trong mẫu nghiên được tính như sau: 
Tuy nhiên, không chỉ riêng DNA hấp thụ ở bước sóng 260 nm, RNA cũng 
hấp thụ mạnh ở bước sóng này. Các amino acid chứa vòng thơm có mặt trong 
protein cũng hấp thụ ở bước sóng 280 nm. Sự có mặt của RNA và protein trong 
mẫu nghiên cứu sẽ ảnh hưởng đến số đọc A260. Vì vậy, độ tinh sạch của DNA được 
xác định dựa vào tỷ lệ A260/A280. Mẫu DNA được cho là tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 
nằm trong khoảng từ 1.8 – 2.0 (Wilfinger và cs., 1997; Adams, 2013). 
Tỷ lệ A260/ A280 được xác định như sau: 
Trong đó: A260: số đọc tại bước sóng 260 nm 
 A280: số đọc tại bước sóng 280 nm 
 A320: số đọc tại bước sóng 230 nm 
Hàm lượng DNA (µg/ml) = (A260 – A230) × Df × 50 µg/ml 
Hàm lượng DNA (µg) = Nồng độ DNA (µg/ml) × Tổng thể tích mẫu (ml) 
Tỷ lệ A260/A280 = (A260 - A230) : (A280 - A230) 
7 
PHỤ LỤC II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
2.1. Đặc tính cơ bản về thổ nhưỡng hai khu vực lấy mẫu 
Điều kiện thổ nhưỡng giúp bổ sung, củng cố và giải thích rõ hơn kết quả đa 
dạng VSV khi phân tích bằng metagenome. Các chỉ tiêu gồm: pH, nhiệt độ, độ ẩm, 
độ mùn, hàm lượng nitơ, cacbon tổng số, asen trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 
được xác định. Số liệu sau phân tích được thống kê ở Bảng 3.1. Độ ẩm của 2 mẫu 
đều rất thấp (<1%) và không thuận lợi cho đa số các VSV sinh trưởng do ô nhiễm 
chất diệt cỏ/dioxin đã diễn ra trong thời gian dài. Mẫu C có pH thuộc loại kiềm nhẹ 
(8,19) và mẫu BHR có pH gần trung tính (6,67). Chỉ tiêu khác như OM, hàm lượng 
nitơ tổng số, độ mùn rất thấp. Ô nhiễm Asen thường đi kèm trong đất chứa chất diệt 
cỏ/dioxin nhưng trong 2 mẫu nghiên cứu hàm lượng As đều nằm ở dưới mức cho 
phép đối với đất nông nghiệp theo tiêu chuẩn quốc gia. 
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu thổ nhưỡng cơ bản của đất mẫu C và BHR 
Chỉ tiêu 
phân tích 
Phương pháp 
phân tích 
Đơn vị tính 
Mẫu 
C BHR 
Độ ẩm TCVN 6648:2000 (%) 0,52 0,73 
TPCG 
Cát thô TCVN 8567:2010 (%) 0,04 0,16 
Cát mịn TCVN 8567:2010 (%) 53,80 21,52 
Limon TCVN 8567:2010 (%) 26,12 37,48 
Sét TCVN 8567:2010 (%) 15,14 9,26 
pHKCl TCVN 5979:2007 (%) 8,19 6,67 
OM TCVN 8941:2011 (%) 2,12 0,78 
Nitơ tổng số TCVN 6498:1999 (% N) 0,04 0,16 
As TCVN 8467:2010 (mg/kg) 11,69 3,23 
PCDD/F – TEQ 
(WHO 2005) 
EPA 8280B 
ng TEQ/kg 
đất khô 
21.605 13,2 
8 
Phân tích thổ nhưỡng của mẫu tại Viện Thổ nhưỡng nông hóa 
9 
Hình 2.1. Kết quả phân tích thành phần cơ giới của đất tại Viện Thổ nhưỡng nông hóa 
10 
2.2. Phân tích độ độc của mẫu thí nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
3952.00 1 3,952.00 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 
3 1,2,3,7,8-PeCDD 
384.00 1 384.00 16.6667 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
565.33 0.03 16.96 0.5000 
5 2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
48.00 0.01 0.48 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
3253.33 0.01 32.53 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.17 0.01 0.00 0.1667 
16 OCDD 
261.33 0.0003 0.08 0.0050 
17 OCDF 
437.330 0.001 0.44 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
4389.33 
12 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
3794.66 1 3,794.66 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
3 1,2,3,7,8-PeCDD 
360.65 1 360.65 16.6667 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
487.15 0.03 14.61 0.5000 
13 
5 2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
56.00 0.01 0.56 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
2516.27 0.01 25.16 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.17 0.01 0.00 0.1667 
16 OCDD 
190.67 0.0003 0.06 0.0050 
17 OCDF 
356.700 0.001 0.36 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
4198.90 
Hình 2.2. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS mẫu đất dùng làm đối chứng trong thí nghiệm phân hủy có lặp lại 
14 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
1632.21 1 1,632.21 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
3 1,2,3,7,8-PeCDD 
125.33 1 125.33 16.6667 
15 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
210.66 0.03 6.32 0.5000 
5 2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
13.32 0.01 0.13 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
1421.33 0.01 14.21 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 1.67 0.01 0.02 0.1667 
16 OCDD 
109.25 0.0003 0.03 0.0050 
17 OCDF 
370.66 0.001 0.37 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
1781.46 
16 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
1695.30 1 1,695.30 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
3 1,2,3,7,8-PeCDD < 16.67 1 16.67 16.6667 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
154.00 0.03 4.62 0.5000 
17 
5 2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
16.00 0.01 0.16 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
1221.15 0.01 12.21 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 1.67 0.01 0.02 0.1667 
16 OCDD 
96.32 0.0003 0.03 0.0050 
17 OCDF 
248.90 0.001 0.25 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
1732.09 
Hình 2.3. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn có lặp lại 
18 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
1896.25 1 1,896.25 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
3 1,2,3,7,8-PeCDD < 16.66 1 16.66 16.6667 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
402.30 0.03 12.07 0.5000 
19 
5 2,3,4,7,8-PeCDF 
465.18 0.3 139.55 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
39.10 0.01 0.39 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
1608.52 0.01 16.09 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.16 0.01 0.00 0.1667 
16 OCDD 
414.15 0.0003 0.12 0.0050 
17 OCDF 
1200.81 0.001 1.20 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
2083.67 
20 
STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ 
1 2,3,7,8-TCDD 
2095.00 1 2,095.00 16.6667 
2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
3 1,2,3,7,8-PeCDD < 16.66 1 16.66 16.6667 
21 
4 1,2,3,7,8-PeCDF 
335.18 0.03 10.06 0.5000 
5 2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 
6 1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
7 1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
8 1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
9 1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
10 1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
11 2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
12 1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 
13 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 
115.21 0.01 1.15 0.1667 
14 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 
2290.00 0.01 22.90 0.1667 
15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.16 0.01 0.00 0.1667 
16 OCDD 
130.15 0.0003 0.04 0.0050 
17 OCDF < 0.0050 0.001 0.00 0.0050 
Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt) 
2148.64 
Hình 2.4. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp xạ khuẩn có lặp lại