Luận án Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (npv) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
LÊ THANH HẢI HÀ 
PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV) 
TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT 
THUèC TRõ S¢U SINH HäC 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
HÀ NỘI - 2020 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 
LÊ THANH HẢI HÀ 
PH¸T TRIÓN SINH KhèI VIrus NH¢N §A DIÖN (NPV) 
TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT 
THUèC TRõ S¢U SINH HäC 
Ngành: Công nghệ Sinh học 
Mã số: 9420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
 GS.TS. Hoàng Đình Hoà 
 PGS.TS. Lê Văn Trịnh 
Hà Nội - 2020 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là 
trung thực, không trùng lặp với các đề tài luận án nào khác và chưa được tác giả 
khác công bố. 
 Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Tác giả 
ii 
MỤC LỤC 
 Diễn giải Trang 
LỜI CAM ĐOAN i 
LỜI CẢM ƠN ii 
MỤC LỤC iii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v 
DANH MỤC BẢNG vi 
DANH MỤC HÌNH ix 
MỞ ĐẦU 
1.Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1 
2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 3 
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4 
5. Những đóng góp mới của luận án 4 
CHƯƠNG 1. CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 5 
1.2. Tổng quan tài liệu 6 
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6 
1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 6 
1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 8 
1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 12 
1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng 18 
1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 28 
1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32 
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 35 
1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 35 
1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 36 
1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng 37 
iii 
1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38 
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 43 
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 43 
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 43 
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44 
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 44 
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 44 
2.3. Nội dung nghiên cứu 44 
2.4. Phương pháp nghiên cứu 44 
2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 44 
2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây 
nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân 48 
2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 50 
2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi 54 
2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 60 
2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào 60 
2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 61 
2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 
2.4.4. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu 65 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu 
khoang 66 
3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện 
(NPV) ngoài đồng ruộng 66 
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao 70 
3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế 
bào nhân nuôi 77 
3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 
iv 
3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 
3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm 88 
3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 92 
3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 93 
3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây 
nhiễm virus nhân đa diện (NPV) 101 
3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế 
bào và trên sâu 105 
3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào 107 
3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm 
nước 109 
3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang 109 
3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 114 
3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 117 
3.3.3.1. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm 117 
3.3.3.2. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới 117 
3.3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 120 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 
1. Kết luận 126 
2. Đề nghị 127 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 
PHỤ LỤC 
v 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Ký hiệu, 
chữ viết tắt 
Diễn giải 
ADN Axit Deroxyribo Nucleic 
CT Công thức 
CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) 
FBS Fetal Bovin Serum (Huyết thanh) 
et al. Những người khác 
MOI Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm) 
nnk. Những người khác 
NSNN Ngày sau nuôi nhân 
NSLN Ngày sau lây nhiễm 
NPV Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện) 
OB Occlusion Bodies (Thể vùi) 
PBS Photphatse Buffer Saline 
PIB Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện) 
QCVN 
TCVN 
Qui chuẩn Việt Nam 
Tiêu chuẩn Việt Nam 
SDS Sodium Dodecyl Sulfate 
TB Trung bình 
vi 
DANH MỤC BẢNG 
 Diễn giải Trang 
Bảng 3.1. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng 
ngoài đồng ruộng (2014- 2015) 68 
Bảng 3.2. Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài 
đồng ruộng (2014- 2105) 69 
Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây 
nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1 72 
Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau lây nhiễm của 
các chủng NPV sau phân lập lần 2 74 
Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng 
NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4 75 
Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng 
NPV đã được lựa chọn 76 
Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường 
khác nhau 79 
Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau 81 
Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác 
nhau 83 
Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung 
huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau 85 
Bảng 3.11. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 86 
Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc 
trên bình lọc khuẩn 250ml 89 
Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trường 
trên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc 91 
Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác 
nhau 94 
vii 
Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI 
khác nhau 95 
Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau
 97 
Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang 
với các loại môi trường khác nhau 98 
Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang 
ở nhiệt độ khác nhau 99 
Bảng 3.19. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang 
ở các mức pH môi trường khác nhau 101 
Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây 
nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau 104 
Bảng 3.21. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm 
trên tế bào và trên sâu khoang 105 
Bảng 3.22. Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên 
tế bào và trên sâu khoang 106 
Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế 
bào và trên sâu khoang 108 
Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các 
phương pháp khác nhau 111 
Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ 113 
Bảng 3.26. Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng sử dụng chế phẩm NPV 
dạng bột thấm nước 116 
Bảng 3.27. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau 6 ngày phun 
trong điều kiện phòng thí nghiệm 117 
Bảng 3.28. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm NPV trong 
điều kiện nhà lưới 118 
Bảng 3.29. Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang trên bắp cải sau khi sử 
dụng chế phẩm NPV ngoài nhà lưới 119 
viii 
Bảng 3.30. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải ngoài 
đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 121 
Bảng 3.31. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều 
lượng khác nhau trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 122 
Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều 
lượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội) 124 
Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương tại 
Mỹ Thành (Hà Nội) 124 
ix 
DANH MỤC HÌNH 
 Diễn giải Trang
Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang 7 
Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) 8 
Hình 2.3. Buồng đếm hồng cầu Neubauer 54 
Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải 67 
Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng 69 
Hình 3.3. Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm 72 
Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a 77 
Hình 3.5. Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu; 
B: Sau nuôi nhân 3 ngày 80 
Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau. 
A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C 81 
Hình 3.7. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016 quan sát 
dưới kính với độ phóng đại 100X 86 
Hình 3.8. Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có 
độ phóng đại 600X và 200X 87 
Hình 3.9. Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B) 90 
Hình 3.10. Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi 
với độ phóng đại 200X và 600X 111 
Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và trên sâu 112 
Hình 3.12. Thể vùi sau tinh sạch (A), được đưa vào lọ bảo quản (B) 113 
Hình 3.13. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining. 114 
Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV sau khi tạo dạng sử dụng 116 
1 
MỞ ĐẦU 
1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 
Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp thường gây hại trên 
các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và 
á nhiệt đới. Theo Kumari và Singh (2009); Hong (2002), sâu khoang có thể sống và 
gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau [1, 2]. Ở Việt Nam, sâu 
khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các 
loại rau họ Thập tự, nho, đậu đỗ, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá, 
đậu tương, lạc, bông, đay, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2003, 2006) [3, 98]. 
Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), để bảo vệ cây trồng 
khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường phải sử dụng nhiều loại thuốc hóa học 
bảo vệ thực vật với liều lượng cao [4]. Sự lệ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa 
học đã làm tăng mức độ kháng thuốc của sâu khoang, gây khó khăn cho công tác 
phòng trừ và gây nhiễm bẩn thực phẩm, gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người 
sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể 
các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng . 
Trên đồng ruộng, cũng như các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn khác, sâu 
khoang thường bị chết do nhiễm NPV. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực 
vật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu chết do bị nhiễm NPV 
(Nuclear Polyhedrosis Virus) từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu 
tương và 0,3- 1,9% trên lạc [4]. 
Rohrmann và George (2011), Kitajima (1989); Kamakoff và Ward (2007) đã 
xác định NPV lây nhiễm, gây chết trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện 
(Nuclear Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rút 
sinh thể vùi (Oclusion Bodies - OB), mỗi thể vùi có thể chứa tới 200 thể vi rút hoạt 
động (virion) hình que có vỏ ngoài protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng 
xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,15- 
15µm. NPV sâu khoang rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu 
khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó [5, 6, 7]. 
2 
Vì vậy, việc khai thác sử dụng và nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối 
NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học NPV là cần thiết, nhằm đáp ứng yêu cầu 
phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp. Sử dụng chế phẩm sinh 
học NPV còn góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản 
xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài 
sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. Đồng thời, thông qua việc sử 
dụng chế phẩm sinh học này trong việc phòng trừ sâu khoang, sẽ góp phần bổ sung 
nguồn vi sinh vật có ích NPV vào đồng ruộng. 
Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ 
công với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm 
NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm 
et al., 1996) [8]. Theo cách này, việc sản xuất chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại khó 
thực hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn cá thể của một loài 
sâu hại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn, phải có đủ nhà 
xưởng, trang thiết bị và việc nuôi sâu phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. 
 Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui mô 
công nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công 
kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV 
phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp (Granados et al., 2007; 
Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) [9, 10, 11]. Đến nay, nhiều nước như: Mỹ, Hà 
Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã và đang ứng dụng để sản xuất, cung 
cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu 
hại cây trồng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối NPV trên cơ sở ứng 
dụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề còn rất mới, kết quả 
thu được mới dừng lại ở bước khởi đầu và còn rất hạn chế. 
Việc thực hiện đề tài: ”Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế 
bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”được tiến hành nhằm đóng 
góp tư liệu khoa họ ... . W. (1974). Replication of a nuclear polyhedrosis 
virus in a continous cell culture of Spodoptera frugiperda: Purification, assay of 
infectivity and growth cheracterristics of the virus. Journal of virology. No. 4. 
Volum 14. 934- 944. 
59. Petchprakob P., Mekvichitsaeng P., Akeprathumchai S., Dechmahikl W. and 
Poomputsa K. (2007). Improvement of Baculovirus NPV production from cell in 
Bioreactor for use as insecticides. Agricultural Scientific Journal. No. 38(6). 79- 
82. 
60. McAteer J., Davis J. (1994). Basic cell culture technique and the maintenance of 
cell lines. Basic Cell Culture - A Practical Approach. Editor: Davis. Oxford 
University Press Inc., New York. Pg. 93- 148. 
61. Mishuhashi J. (1995). A continuous cell line from pupal ovaries of theo common 
cutworm Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Applied entomology and 
zoology. 30(1). 75-82. 
62. Mishuhashi J. and Goodwin A. (1976). Primary cultures of the cells from 
ovaries of the Cabbage Armyworm, Mamestra brassicae L. (Lepidoptera: 
Noctuidae). Journal of Development, Growth and Differentiation. Volume 18. 
No. 2. Page 163- 166 
136 
63. Agathos S.N. (1994). Large scale insect cell production. Book: Inscet Cell 
Biotechnology by Editors: Maramorosch K. and Mclntosh. CRC Press, Tokyo. 
89- 103. 
64. Demir I., Gorel N., Naloacioglu R., Demirbag Z. (2009). Comparative 
susceptibilities of six insect cell lines to infection by Malacosoma neustria 
nucleopolyhedrovirus (ManeNPV). Turkey Journal of Biology. No. 33 (2009), 
Page 259-273 
65. Felio J.B. G., Jorge B., Gloria R., Alberto M. and Olano V.A. (1995). Initiation 
of primary cell culture from embryos of the mosquitoes Anopheles albimanus 
and Aedestaeniorhynchus (Diptera: Culicidae). Journal ff Mem Institute of 
Oswaldo Cruz.. Rio de Janeiro. Volume 90. No. 4. Page 547- 551. 
66. Yeh S.C., Lee S. T., Wu C.Y, Wang C.H. (2007). A cell line (NTU- MV) 
established from Maruca vitrata (Lepidoptera: Pyralidae): Characterrization, 
viral susceptibility and polyhedra production. Journal of Invertebrate Pathology. 
No. 96 (2007). 138- 146. 
67. Lynn D.E. and Shapiro M. (1998). New cell lines from Heliothis virescens: 
Characterization and susceptibility to baculoviruses. Journal of Invertebrate 
Pathogology. No. 72. Page 276- 280. 
68. Trang T.T.K, Chaudhari S. and Gautam R.D. (2003). A note on the spread of 
nuclear polyhedrosis virus through Cotesia (Apanteles) angaleti Muesbeck 
(Hymenoptera: Braconidae). Omonrice No.11. 151- 152 (2003). 
69. Jakubowska A., Ferre J., Herrero S. (2009). Enhancing the multiplication of 
nucleopolyhedrosis virus in vitro by manipulation of the pH. Journal of 
Viological methods. No. 161(2009). 254- 258. 
70. Rey G.J., Ferro C., Bello F.J. (2000). Establishment and characterization of new 
continuous cell line from Lutzomya longipalpis (Diptera: Psychodidae) and its 
susceptibility to infections with Arboviruses and Leishmania chagasi. Inst. of 
Oswaldo, Colombia. Vol.95 (1). 103-110. 
71. Petcharawan O.; Mongkopoch K. and Belloncik S. (2006). Establishment of cell 
line devived from embryonic tissue of the Diamondback Moth, Plutella 
137 
xylostella (L.). KMITL Science Technological Journal. Vol.6. No. 2. Dec. 2006. 
56- 66. 
72. Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010). Công nghệ sinh học trên người và 
động vật. NXB Giáo dục Việt nam. 895 trang. 
73. Maeda S., Mukohara Y. and Kondo A. (1990). Characteristically distinct 
isolates of the nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura. Journal of 
General Virology (1990). No. 71. 2631- 2639. 
74. Mclntosh A.h., Grasela J.J., Kariuki C.W., Goodman C.L., Brennan L.A. and 
Dierks P.M. (2003). Evaluation of recombinant diamondback moth baculvirus in 
selected Lepidopteran cell lines and larvae. Journal of Insect Biochemistry and 
Molecular Biology. Vol. 33 (2003). 927- 931. 
75. Popham H. J.R., Grasela J.J., Goodman C. L. and Mclntosh A.H. (2010). 
Baculovirus infection influences host protein expression in two established 
insect cell lines. Journal of Insect Physiology. No.56 (2010). 1237- 1245. 
76. Woo S. D., Jong Y. R., Choi J. Y. and Jin B. R. (2007). Propagation of Bombyx 
mori nucleopolyhedrovirus in nonpermissive insect cell lines. The journal of 
microbiology. April 2007. Page 133- 138. 
77. Lery X., Zeddam J. L., Giannotti J., Fedriere G. and Ela S.A. (1995). 
Establishment of a cell line derived from embryos of the potato tuber moth 
Phthorimaea opercurella (Zeller). Journal of In Vitro Cell Development and 
Biology of Animal. No. 31. 836-839. 
78. Vaughn J.L., Goodwin R.H. and others. (1977). The establishment of two cell 
lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). Vitro 
Journal. Vol. 13, No. 4. 213- 219. 
79. Kanokwan P., Kathariya P., Phenjun M. and Uthai K. (2003). Pilot scale 
production of baculovirus using insect cell culture for biopesticides. Proceeding 
of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology 2003. Page 
148- 155. 
138 
80. Maiorella B., Inlow D., Shauger A. and Harano D. (1988). Large scale insect 
cell culture for recombinant protein production. Biotechnology Journal. No. 6 
(1988). 1406-1410 
81. Miranda E.A., Murcia G.D and Murcia M.D. (1997). Large- scale production 
and purification of recombinant protein from an insect cell/ baculovirus system 
in Erlenmeyer flasks: application to the chiken poly (ADP- ribose) polymerase 
catalytic domain. Barzillian Jounal of Medical and Biological Research. No.30 
(1997). 923- 928. 
82. Cynthia B.E., Barbara J. and Kamine K. (2007). Recombinant protein 
production in large- scale agitated bioreactor using the Baculovirus expression 
vector system. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second 
edition, Edited by D. W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 224- 
245 
83. Tipvadee A., Sudawan C., Suvalux C., Supat A. and Pissawan C. (1988). 
Characterization of the nuclear polyhedrosis virus of the Cotton Bollworm, 
Heliothis armigera. Kaseart Jounal (Natural Science). Vol. 22. No. 5. 14- 23. 
84. Zitzmann J., Sprick G., Weidner T., Schreiber C. and Peter C. (2017). Process 
optimization for recombinant protein expression in insect cells. The Hessen 
State Ministry of Higher Education. 110 pages. 
85. Lynn D.E. (2003). Comparative susceptibilities of twenlve insect cell lines to 
infection by three Baculovirus. Journal of Invertebrate Pathogology. No. 82. 
129- 131. 
86. Barbara J. K., Linda A.K. and Robert D.P. (2007). Introduction to baculovirus 
molecular biology. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second 
Ed., Edited by D.W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 25- 54. 
87. Bryony C.B. and Nusawadany T. (2007). Introduction to the use of 
Baculoviruses as biological insecticides. In: Baculovirus and insect cell 
expression protocol. Second edition, Edited by D.W. Murhammer. Humana 
Press. Totowa, New Jersey. Page 359- 366. 
139 
88. King L.A., Hitchman R., and Posee R.D. (2007). Recombinant baculovirus 
isolation. In: Baculovirus and insect cell expression protocol. Second edition, 
Edited by D.W. Murhammer. Humana Press. Totowa, New Jersey. 76- 93 
89. Kanokwan P., Kathariya P., Phenjun M. and Uthai K. (2004). Pilot scale 
production of baculovirus using insect cell culture for biopesticides. Proceeding 
of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology 2003. 148- 
155. 
90. Shapiro M. and Shepard B.M., (2008). Evaluation of clays and fluorescent 
brightener upon the activities of the Gypsy Moth (Lepidoptera: Lymantriidae) 
nuleopolyhedrovirus. Jounal of agricultural uban entomology. 24(4). 165- 175. 
91. Patricia T. G., McGuire R., Behle R. W., Shasha B. S. and Pingel R. L. (2002). 
Storage stability of Anagrapha falcifera nucleopolyhedrovirus in spray- dried 
formulations. Journal of Invertebrate Pathology. Vol. 79. Page 7- 16. 
92. Mushobozi W., Grzywacz D., Moscardi F. and Wilson K. (2004). The African 
Armyworm Spodoptera exempta nucleopolyhedrovirus (NPV) production and 
application manual. Project Report. Natural Resources Institute. United 
Kingdom. 116 pps. 
93. Goulson D.; Martinez A. M.; Hughes W. O. H. and Williams T. (2000). Effects 
of optical brighteners used in biopesticide formulations on the behavior of 
pollinators. Journal of Biological Control. No. 19. 232- 236. 
94. Cisneros J., Perez J. A., Penagos D. I., Ruiz J. V. Cabellero P. Cave R. D. and 
Williams T. (2002). Formulation of a nucleopolyhedrosis with Boric acid for 
control of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in maize. J. of 
Biological Control Vol. 23. 87- 95. 
95. Javier G. O., Sudawan C. Barbara L.C., Motoko I. And Michihiro K. (2008). 
Susceptibility of the cell line Hv-AM1 from Heliothis virescens to eight selected 
Nucleopolyhedroviruses. Journal of insect biotechnology and Sericology. No. 
77. Page 141- 150. 
96. Inst. of Zoology, Chinese Academy of Sciences. 2006. Introduction of bio- 
pesticides products based biotechnological application. 12 pgs. 
140 
97. Cục BVTV, Viện BVTV, Trường ĐH Tổng hợp Hà Nội (1995). Báo cáo khoa 
học về cải tiến công tác BVTV ở Việt Nam (VNM-8910-030) giai đoạn 1990- 
1995. NXB Nông nghiệp. 154 trang. 
98. Viện Bảo vệ thực vật (2006). Nghiên cứu chế phẩm sinh học đa chức năng bằng 
công nghệ sinh học. Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước 
KC.04-12 (2001- 2005). 119 trang 
99. Nguyễn Duy Nhất (1970). Đặc tính sinh vật học, qui luật phát sinh và những 
yếu tố ảnh hưởng đến mật độ sâu khoang trên đồng ruộng vùng Hà Nội. Tạp chí 
KHKT Nông nghiệp. Số 6, 1970. 674- 679. 
100. Lê Văn Trịnh (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của một số 
sâu hại rau họ Thập tự vùng đồng bằng sông Hồng và biện pháp phòng trừ. 
Luận án Tiến sỹ. 181 trang. 
101. Nguyễn Văn Cảm, Hoàng Thị Việt; Nguyễn Văn Hoa và Lương Thanh Cù; 
Trần Quang Tấn; Nguyễn Đậu Toàn và Huỳnh Thị Huệ (1996b). Bệnh thối nhũn 
sâu đo xanh (Anomis falava Fabr.) và khả năng sử dụng chúng trong việc phòng 
trừ sâu đo xanh hại đay. Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990- 
1995. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Trang 173- 181. 
102. Hoàng Thị Việt, Nguyễn Văn Cảm et al. (2002). Một số kết quả nghiên cứu 
về NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) và khả năng sử dụng trong phòng trừ sâu 
hại cây trồng. Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 2000- 2002. 
NXB Nông nghiệp, Hà Nội, Trang 113- 130. 
103. Trịnh Thị Xuân, Trương Thanh Xuân Liên, Dương Thị Thu Nhi và Trần Văn 
Hai. (2016). Tiềm năng của vi rút SeNPV (Spodoptera exigua 
nucleopolyhedrovirus) đối với sâu keo da láng Spodoptera exigua Hübner 
(Lepidoptera: Noctuidae) tại đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Bảo vệ thực 
vật. Số 5/2016. 19- 26 
104. Trần Văn Hai, Trần Thị Xuân, Nguyễn Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ánh Tuyết 
và CTV. (2010). So sánh các dòng Nucleopolyhedrosis Virus tại đồng bằng 
sông Cửu Long bằng phương pháp PCR và tiềm năng trong phòng trừ sâu ăn 
141 
tạp (Spodoptera litura Fabr.). Báo cáo Hội nghị khoa học công nghệ toàn quốc 
về BVTV lần thứ 3. Trang 481- 487. 
105. Lê Văn Trịnh, Lê Thanh Hải Hà (2011). Tạo dòng tế bào sâu khoang 
Spodoptera litura từ mô phôi và mô mỡ. Tạp chí Bảo vệ thực vật. Số 3. 17- 20. 
106. Nguyễn Thị Hai (2005). Sử dụng virus Nucleopolyhedrosis trong phòng trừ 
sâu keo da láng (Spodoptera exigua) hại cây trồng. Báo cáo Hội nghị: Các biện 
pháp sinh học trong phòng chống sâu bệnh hại cây trồng nông nghiệp. NXB 
Nông nghiệp. Trang 175- 181 
107. Trương Thanh Giản; Lê Văn Thuyết; Trần Quang Tấn; Nguyễn Đậu Toàn và 
CTV. (1996). Bước đầu nghiên cứu sử dụng NPV của sâu róm thông 
(Dendrolimus punctatus Walker) trên rừng thông Thanh Hóa. Tuyển tập công 
trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 90- 95. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Trang 173- 
181. 
108. Viện Bảo vệ thực vật (1997). Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật- 
Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng. Tập 
1. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 99 trang. 
109. Viện Bảo vệ thực vật (2000). Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật- 
Phương pháp điều tra, đánh giá sâu, bệnh, cỏ dại, chuột hại cây trồng cạn. Tập 
III. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 80 trang. 
110. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2018). Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 
về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật. 
111. Viện Bảo vệ thực vật (1976). Kết quả điều tra cơ bản côn trùng 1967- 1968. 
NXB Nông thôn, Hà Nội. 415 trang. 
112. Khattab M. (2013). Isolation of Nucleopolyhedrovirus (NPV) from the Beet 
armyworm Spodoptera exigua (Hübner) (SpexNPV). International Journal of 
Environmental Science and Engineering. Vol. 4: 75-83 (2013) 
113. Senthil Kumar C.M.; Sathiah N. and Rabindra R.J. (2005). Optimizing the 
time of harvest of Nucleopolyhedrovirus infected Spodoptera litura (Farbricius) 
larvae under in vivo production systems. Current Science, Vol. 88. No. 10. 
1682- 1684. 
142 
114. Sireesha K., Kumar Ch. S., Rao G.V. R, Arjuna R. P. and Lava P.K. (2010). 
Effect of different storage conditions on the virulence of Helicoverpa armigera 
nuclea polyhedrosisvirus (HaNPV). Journal of Entomology and Resources. Vol. 
34.No. 1. 65-69. 
115. Goodman C.L., Mclntosh A.H., Sayed G.N.E., Grasel J.J. and Stiles B. 
(2001). Production of selected Baculoviruses in newly established Lepidopteran 
cell lines. Journal of In Vitro Cell Development and Biology. No. 37 (2001). Pg. 
374- 379. 
116. Hink W. F., Strauss E. M. and Ramoska W.A. (1977). Propagation of 
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus in cell culture: Method for 
infection cells. Journal of Invertebrate Pathology. No. 30. 185- 191. 
117. Phejun M. Kanokwan P., Lertwerawat Y., Ketunuti U. And Morakot T. 
(2003). Production of baculovirus for biopesticide in insect cell culture. 
Proceeding of The 13th annual meeting of the Thai society for biotechnology 
2003. 252- 260. 
118. Huda N.; Sajap A. S. and Lau W. H. (2012). Stability of Spodoptera litura 
nucleopolyhedrosis virus in Sodium Dodecyl Sulphate. African Journal of 
Biotechnology. Vollume 11. No. 16. 3877- 3881. 
119. Nazli H., Sajap A.S. and Lau W.H. (2012). Stability of Spodoptera litura 
nucleo polyhedrosis virus in sodium dodecyl sulphate. African Journal of 
Biotechnology. Volume 11. No. 16. 3877- 3881. 
120. Salama, M.S., A. El-Salam, A.M.E., D. M. Mahmoud and Samah M.M.A. 
(2017). Effect of ultra violet radiations on insecticidal activity of Spodoptera 
littoralis multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus against Spodoptera 
littoralis Boisd (Lepidoptera: Noctuidae). Bioscience Research. Vol. 14(3): 645-
652. 
121. Winardo D. and Soebandrijo. (2006). Effectiveness of NPV formulated with 
different carriers to Spodoptera litura F. and Helicoverpa armigera Hubner on 
coton. Annual Reports of Indonesian Tobacco and Fiber Crops Research 
Institute. Page 214- 234.