Phân lập đoạn gen cp từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc rnai phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

 1 
MỞ ĐẦU 
1. Đặt vấn đề 
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị 
kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải 
tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu 
tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của 
giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác 
động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ 
bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus 
– SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus – 
BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những 
loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương. 
SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là 
môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có 
những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, 
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và 
biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV 
gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương. 
Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi 
ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc 
nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và 
chất lượng hạt [95]. 
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp 
phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các 
biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh 
đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt 
trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả 
 2 
thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV 
và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống 
đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính 
vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan 
tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây 
bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). 
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng 
để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt 
gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi 
trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98]. 
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập 
đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen 
mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”. 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
2.1. Mục tiêu chung 
Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây 
đậu tương bằng kỹ thuật RNAi. 
2.2. Mục tiêu cụ thể 
(i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu 
tương Việt Nam. 
(ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của 
SMV và cả hai loài SMV và BYMV. 
(iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng 
kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen; 
(iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi . 
 3 
3. Nội dung nghiên cứu 
3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và 
nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân 
tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen 
CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân 
hàng gen quốc tế. 
3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV 
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và 
tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP. 
3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của 
SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp 
vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens. 
3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn 
gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ 
thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen 
so với cây đối chứng không chuyển gen. 
3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens. 
Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương 
chuyển gen. 
4. Những đóng góp mới của luận án 
4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720 
nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã 
được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103. 
4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả 
năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và 
BYMV. 
 4 
4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả 
năng kháng cả hai loài SMV và BYMV. 
4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và 
DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây 
chuyển gen từ giống DT2008. 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 
5.1. Về khoa học 
Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi 
chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV, 
BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và 
BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa 
học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ chính 
loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen kháng 
virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi. 
5.2. Về thực tiễn 
Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương 
đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc 
RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng 
dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở 
Việt Nam. 
Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và 
BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây chuyển gen đối với 
thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật 
RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng 
ở Việt Nam. 
 5 
Chương 1 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 
1.1.1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương 
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40) 
thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae). Đậu tương là 
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất. Hạt đậu 
tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho 
hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin, 
tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức 
năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức 
khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể 
so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82]. 
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây 
hàng năm. Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ 
tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có 
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm 
[1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều 
lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu 
tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá 
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang 
một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ 
nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, 
có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn 
tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng 
và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có 
lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Quả thẳng 
 6 
hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu 
tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn 
và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen nhưng đa số là hạt màu 
vàng. Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt 
dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc 
trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2]. 
Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại 
cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư 
chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu 
và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước 
đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể. Đậu 
tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước, 
trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Cây đậu tương ở nước ta 
được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng 
65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông 
Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích 
trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với 
những năm trước. Nguồn giống đậu tương kháng bệnh và chống chịu cao là 
một trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của 
ngành sản xuất đậu tương ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ 
sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tương là cách tiếp cận 
mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tương hiện nay. 
Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus, 
như bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm 
Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm 
Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc 
Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số 
bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại 
 7 
trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại 
lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại những nơi bị nhiễm bệnh 
nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên 
đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm [17]. Một số nước 
có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ 
(37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-
50%) [28], [80], [158]. 
Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh 
được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu 
tương đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [80]. Việt 
Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung 
ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, 
khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [1], [12]. 
Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm, 
gây hại trên cây đậu tương, trong đó có SMV và BYMV [17], [73]. SMV là 
loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ 
Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương, 
bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44]. SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, 
thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu 
tương. Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển 
chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn 
sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [85] [86]. Họ Potyviridae được biết 
đến là có số lượng loài lớn nhất trong các loài virus gây bệnh ở thực vật. Nếu 
nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng 
hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145]. Những cây bị nhiễm Potyvirus 
cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145]. SMV có thể lây nhiễm qua hạt với 
tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật và thời 
gian bị nhiễm [104]. 
 8 
Phản ứng khác biệt của giống về sức đề kháng với SMV được biểu hiện 
ở hiện tượng cây đậu tương mẫn cảm với bệnh khảm hoặc khảm hệ thống (S), 
chết hoại (N), và không có triệu chứng hoặc kháng (R). Quan sát này đã được 
Cho và Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành các nhóm, chủng 
SMV từ G1 đến G7 [49]. 
BYMV là loài virus cũng thuộc nhóm Potyvirus, có thể tìm thấy ở các 
cây thuộc họ đậu đỗ (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, ) và một số loài thực 
vật khác [28], [80]. Khi cây đậu tương nhiễm BYMV sẽ xuất hiện những vết 
khảm và đường biến vàng ngoằn ngoèo trên bề mặt lá, làm cây không phát 
triển được và dẫn tới bị chết. Bệnh khảm vàng do BYMV cũng gây thiệt hại 
đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, đặc biệt đối với các cây đậu đỗ, trong 
đó có đậu tương [137]. Khi cây bị nhiễm BYMV, năng suất hạt đậu tương bị 
giảm, một số trường hợp có thể giảm tới 74% - 80% [96]. 
Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên 
cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm 
cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm 
từ 66% - 80% [80], [91]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine 
đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương 
vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển 
vi điện tử và kỹ thuật ELISA [103]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây 
phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng 
hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào 
cây chủ [142]. Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ 
thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, 
nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [41]. 
1.1.2. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tương 
SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc 
có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có 
 9 
mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ 
thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành 
ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được 
nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng 
truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn 
trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [12], [13]. 
SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ 
xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt 
phấn bị nhiễm virus rơi vào no ... 112. Li Z., Meyer S., Essig J. S., Liu Y., Schapaugh M. A., Muthukrishnan S., 
Hainline B. E., Trick H. N. (2005), “High-level expression of maize γ-zein 
protein in transgenic soybean (Glycine max)”, Mol. Breed., 16, pp. 11–20. 
113. Lim H. S., Ko T. S ., Hobbs H. A., Lambert K. N., Yu J. M., McCoppin N. K., 
Korban S. S., Hartman G. L., Domier L. L. (2007), “Soybean mosaic virus 
Helper Component-Protease Alters Leaf Morphology and Reduces Seed 
Production in Transgenic Soybean Plants”, Phytopathology, 97(3), pp. 366-
372 
114. Lopez S. J., Kumar R. R., Pius P. K., Muraleedharan N. (2004), 
“Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea 
(Camellia sinensis [L.] O. Kuntze)”, Plant molecular biology reporter, 22, pp. 
201-201. 
115. Maruthi M. N., Seal S., Colvin J., Briddon R. W., Bull, S. E.(2004), “East 
African cassava mosaic Zanzibar virus – a recombinant begomovirus species 
with a mild phenotype”, Arch. Virol., 149, pp. 2365–2377. 
116. Masuta C., Nishimura M., Morishita H., Hataya T. (1999), “A single amino 
acid change in viral genome- associated protein of potato virus Ycorrelates 
with resistance breaking in‘Virgin A Mutant’ tobacco”, Phytopathology, 89, 
pp. 118 -123. 
117. McCabe D. E., Swain W. F., Martinell B. J., Christou P. (1988), “Stable 
transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration”, Nat. 
Biotechnol., 6, pp. 923–926. 
118. McKern N. M., Barnett O. W., Whittaker L. A., Mishra A., Strike P. M., Xiao 
X. W., Ward C. W., Shukla D. D. (1993), “Sequence relationship among the 
coat proteins of strains of peamosaic, white lupin mosaic and bean yellow 
moasaic potyviruses”, Phytopathology, 83, pp. 255-361. 
 122 
119. Nicolas O., Dunnington S. W., Gotow L., Pirone T. P., Hellmann G. M. 
(1997), “Variation in the VPg protein allow a potyvirus to overcome va gene 
resistance in tobacco”, Virology, 237, pp. 452-459. 
120. Nishizawa K., Kita Y., Kitayama M., Ishimoto M. (2006), “A red fluorescent 
protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable 
transformation in soybean”, Plant Cell Rep., 25, pp. 1355–1361. 
121. Nishizawa K., Takagi K., Teraishi M., Kita A., Ishimoto M. (2010), 
“Application of somatic embryos to rapid and reliable analysis of soybean 
seed components by RNA interference-mediated gene silencing”, Plant 
Biotechnol., 27, pp. 409–420. 
122. Olhoft P. M., Donovan C. M., Somers, D. A. (2006), Soybean (Glycine max) 
transformation using mature cotyledonary node explants. Methods in 
molecular biology: Agrobacterium protocols, 2nd ed. Humana Press Inc, 
Totowa, N, pp. 385-396. 
123. Owens L. D., Cress, D. E. (1985), “Genotypic variability of soybean response 
to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids”, Plant Physiol., 77, 
pp. 87–94. 
124. Padgette S. R., Kolacz K. H., Delannay X., Re D., LaVallee B. J., Tinius C. 
N., Rhodes K., Otero Y. I., Barry G. F., Eichholtz D. A. (1995), 
“Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant 
soybean line”, Crop Sci., 35, pp. 1451–1461. 
125. Parrott W. A., Williams E .G., Hildebrand D. F., Collins G. B. (1989), “Effect 
of genotype on somatic embryogenesis from immature cotyledons of 
soybean”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 16, pp. 15–21. 
126. Paz M. M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Banerjee A. K., Wang K. (2004), 
“Assessment of conditions affecting Agrobacterium - mediated soybean 
transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp. 
167–179. 
127. Paz M. M., Martinez J. C., Kalvig A. B., Fonger T. M., Wang K. (2006), 
“Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived 
from mature seed for efficient Agrobacterium - mediated soybean 
transformation”, Plant Cell Rep., 25, pp. 206–213. 
 123 
128. Pfosser M. F., Baumann H. (2002), “Phylogeny and geographical 
differentiation of Zucchini yellow mosaic virus isolates (Potyviridae) based 
on molecular analysis of the coat protein and part of the cytoplamsic 
inclusion protein genes”, Arch. Virol., 147, pp. 1599-1610. 
129. Pradeep K., Satya V. K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., 
Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., 
Balasubramanian P., Velazhahan R. (2012), “Engineering resistance against 
Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA 
interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp. 735-741. 
130. Qi Q., Huang J., Crowley J., Ruschke L., Goldman B. S., Wen L., Rapp, W. 
D. (2011), “Metabolically engineered soybean seed with en-hanced threonine 
levels: biochemical characterization and seed-specific expression of lysine-
insensitive variants of aspartate kinases from the enteric bacterium 
Xenorhabdus bovienii”, Plant Biotechnol., 9, pp. 193–204. 
131. Qiong H., Yanbing N., Kai Z., Yong L., Xueping Z. (2011), “Virus-derived 
transgenes expressing hairpin RNA give immunity to Tobacco mosaic virus 
and Cucumber mosaic virus”, Virology Journal, 8 : 41. 
132. Qusus S. (1997), Molecular studies on soybean mosaic virus-Soybean 
interactions. Ph.D. Dissertation, Virginia Polytechnic Institute and State 
University, pp.163. 
133. Rao S. S., Hildebrand D. (2009), “Changes in oil content of transgen-ic 
soybeans expressing the yeast SLC1 gene”, Lipids, 44, pp. 945–951. 
134. Reinhart B. J., Weinstein E. G., Rhoades M. W., Bartel B., Bartel D. P. 
(2002), “MicroRNAs in plants”, Genes Dev., 16, pp. 1616–1626. 
135. Restrepo H. M., Carrington J. C. (1994), “The tobacco etch potyvirus 6-
kilodalton protein is membrane associated and involved in viral replication”, 
J. Virol., 68, pp. 2388-2397. 
136. Rhoades M. W., Reinhart B. J., Lim L. P., Burge C. B., Bartel B., Bartel D. P. 
(2002), “Prediction of Plant MicroRNA Targets”, Cell, 110, pp. 513-520 
137. Roberts C. A., Dietzgen R. G., Heelan L. A., Maclean D. J. (2000), “Real - 
time RT-PCR fluorescnet detection of tomato spotted wilt virus”, J. Virol. 
Meth., 88, pp.1-8. 
 124 
138. Saghai M. M. A., Soliman K. M., Jorgensen R. A., Allard R. W. (1984), 
“Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian 
inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc. Natl. 
Acad. Sci. USA, 81, pp. 8014-8018. 
139. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (2001), Molecular Cloning: A 
Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 
140. Schaad M. C., Haldeman C. R., Cronin S., Carrington J. C. (1996), “Analysis 
of the VPg-proteinase (NIa) encoded by tobacco etch potyvirus: Effects of 
mutations on the subcellular transport, proteolytic processing, and genome 
amplification”, J. Virol., 70, pp. 7039-7048. 
141. Schwarz D. S., Hutvagner G., Haley B., Zamore P. D. (2002), “Evidenc that 
siRNAs funtion as guides, nt primers in the Drosophila and human RNAi 
pathways”, Mol. Cell, 10, pp. 537-548. 
142. Selvaraj T., Nisha M. C., Rajeshkumar S. (2009), “Effect of indigenous 
arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical 
constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal of 
science and technology, 3 (1), pp. 222-234. 
143. Setchell K. D. (1998), “Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and 
implications for human health of soy isoflavones”, J. Clin. Nutr., 68, pp. 
1333–1346 
144. Shukla D. D., Ward C. W. (1988), “Amino acid sequence homology of coat 
proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group”, 
J. Gen. Virol., 69, pp. 2703-2710. 
145. Shukla D. D., Ward C. W., Brunt, A. A. (1994), The Potyviridae, CAB 
International, University Press, Cambridge, UK. 
146. Smith N. A., Singh S. P., Wang M. B., Stoutjesdijk P. A., Green A. G., 
Waterhouse P.M. (2000), “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”, 
Nature, 407, pp. 319–320. 
147. Srivastava V., Vasil V., Vasil I. K. (1996), “Molecular characterization of the 
face of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.)”, Theor. Appl. 
Genet., 92, pp. 1031-1037. 
 125 
148. Stewart C. N. J., Adang M. J., All J. N., Boerma H. R., Cardineau G., Tucker 
D., Parrott W. A. (1996), “Genetic transformation, recovery, and 
characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus 
thuringiensis cryIAc gene”, Plant Physiol., 112, pp. 121–129. 
149. Sugano M. (2005), Soy in Health and Disease Prevention, CRC Press, New 
York, USA. 
150. Sunkar R., Zhu, J.K. (2004), “Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and 
Other Small RNAs from Arabidopsis”, Plant Cell, 16, pp. 2001-2019. 
151. Tabashnik B.E. (1994), “Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis”, 
Annu. Rev. Entomol., 39, pp. 47–79. 
152. Takagi K., Nishizawa K., Hirose A., Kita A., Ishimoto M. (2011), 
“Manipulation of saponin biosynthesis by RNA interference-mediated 
silencing of β-amyrin synthase gene expression in soybean”, Plant Cell Rep., 
30, pp. 1835–1846. 
153. Tavva V. S., Kim Y. H., Kagan I. A., Dinkins R. D., Kim K. H., Collins G. B. 
(2007), “Increased α-tocopherol content in soybean seed overexpressing the 
Perilla frutescens γ -tocopherol methyltransferase gene”, Plant Cell Rep., 26: 
pp. 61–70. 
154. Tomlin E. S., Branch S. R., Chamberlain D., Gabe H., Wright M. S., Stewart, 
C.N. (2002), “Screening of soybean, Glycine max (L.) Merrill, lines for 
somatic embryo induction and maturation capability from immature 
cotyledons”, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 38, pp. 543–548. 
155. Topping J.F. (1998), “Tobacco transformation”, Methods of Mol. Biol., 81, pp. 
365 – 372. 
156. Topping J. F., Wei W., Lindsey, K. (1991), “Functional tagging of regulatory 
elements in plant genome”, Development, 112, pp. 1009-1019. 
157. Tougou M., Yamagishi N., Furutani N., Shizukawa Y., Takahata Y., Hidaka S. 
(2007), “Soybean dwarf virus -resistant transgenic soybeans with the sense 
coat protein gene”, Plant Cell Rep., 26, pp. 1967–1975. 
158. United Soybean Board (2000), World Soybean Production 1999, Report, 
Chesterfield, MO, USA. 
 126 
159. Urcuqui I. S., Haenni A. L., and Bernardi F. (2001), “Potyvirus proteins: a 
wealth of functions”. Virus Research 74: pp. 157-175. 
160. Valente M. A. S., Faria J. A. Q. A., Soares-Ramos J. R. L., Reis P. A. B., 
Pinheiro G. L., Piovesan N. D., Morais A. T., Menezes C. C., Cano M. A. O., 
Fietto L. G. (2009), “The ER luminal binding protein (BiP) mediates an 
increase in drought tolerance in soybean and delays drought-induced leaf 
senescence in soybean and tobacco”, J. Exp. Bot., 60, pp. 533–546. 
161. Vanderveken J. J., Harris K. F.,Maramorosch K. (1977), Oils and other 
inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus Vectors. 
Academic Press, London, pp. 435-454. 
162. Walker D., Boerma H. R., All, J. Parrott W. (2002), “Combining cry1Ac with 
QTL alleles from PI 229358 to improve soybean resistance to lepidopteran 
pests”, Mol. Breed., 9, pp. 43–51. 
163. Walsh K., North J., Barker I., Boonham N. (2001), “Detection of different 
strains of Potato virus Y and their mixed infections using com petetive RT-
PCR”, J. Virol. Meth., 91, pp. 167-173 
164. Wang D., Maule A.J. (1995), “Inhibition of host gene expression associated 
with plant virus replication”, Science, 267, pp. 229-231. 
165. Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B (1998), “Virus resistance and 
gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense 
and antisense RNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, pp. 13959–13964. 
166. Wesley S. V., Helliwell C. A., Smith N. A., Wang M. B., Rouse D. T., Lie Q., 
Gooding P. S., Singh S. P., Abbott D., Stoutjesdijk P. A., Robinson S. P., 
Gleave A. P., Green A. G., Waterhouse, P. M. (2001), “Construct design for 
efficient, effective and high - throughput gene silencing in plants”, Plant, 27, 
pp. 581–590. 
167. Wingard S. A. (1928), “Hosts and symptoms of ring spot, a virus disease of 
plants”, J. Agric. Res., 37, pp. 127−153. 
168. Won S. L, Yul H. K., Kook H. K. (2003), “Complete Genome Sequences of 
the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, Plant 
Pathol., 19 (3), pp. 171-176. 
 127 
169. Xue R. G., Xie H. F., Zhang B. (2006), “A multi-needle-assisted 
transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol. Lett., 28, pp. 
1551–1557. 
170. Yadav N. S. (1996), “Genetic modific ation of soybean oil quality. In : Verma, 
D. P. S. and R.C.Shoemaker (eds.) Soybean”, Genetics, Molecular Biology 
and Biotechnology, Cab International, USA, pp. 165–188. 
171. Yamada T., Takagi K., Ishimoto, M. (2012), “Recent advances in soybean 
transformation and their application to molecular breeding and genomic 
analysis”, Breeding Science, 61, pp. 480–494. 
172. Yamada Y., Nishizawa K., Yokoo M., Zhao H., Onishi K., Teraishi M., 
Utsumi S., Ishimoto M., Yoshikawa M. (2008), “Anti-hypertensive activity of 
genetically modified soybean seeds accumulating novo – kinin”, Peptides, 
29, pp. 331–337. 
173. Yan P. Q., Bai X. Q., Wan X. Q., Guo Z. K., Li L. J., Gong H. Y., Chu C. C. 
(2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco 
plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), 
pp. 1018-22. 
174. Ye F., Signer E. R. (1996), “RIGS (repeat - induced gene silencing) in 
Arabidopsis is transcriptional and alters chromatin configuration”, Proc. Natl. 
Acad. Sci. USA, 93, pp. 10881-10886. 
175. Yin Z., Malepszy S. (2003), “The transgenes are expressed with different level 
in plants”, Biotechnologia, 2 (61), pp. 236-260. 
176. Zeng P., Vadnais D. A., Zhang Z., Polacco J.C. (2004), “Refined glu-fosinate 
selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max 
(L.) Merrill]”, Plant Cell Rep., 22, pp. 478–482. 
177. Zhang C., Song Y., Jiang F., Li G., Jiang Y., Zhu C., Wen F. F. (2012), 
“Virus resistance obtained in transgenic tobacco and rice by RNA interference 
using promoters with distinct activity”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp. 742-
748. 
178. Zhang X., Sato S., Ye X., Dorrance A. E., Morris T. J ., Clemente T. E., Qu F., 
(2012), “Robust RNAi-based resistance to mixed infection of three viruses in 
 128 
soybean plants expressing separate short hairpins from a single transgene”, 
Phytopathology, ,101 (11), pp. 1264-1269. 
179. Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T. E. (1999), “The use of 
glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated trans-formation of 
soybean”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 56, pp. 37–46. 
180. Zhu S., Walker D. R., Boerma H. R., All J., Parrott W. A. (2008), “Effects of 
defoliating insect resistance QTLs and a cry1Ac transgene in soybean near-
isogenic lines”, Theor. Appl. Genet., 116, pp. 455–463. 
181. Zilberman D., Cao X., Jacobsen S. E. (2003), “Argonaute4 control of locus 
specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation”, Science 
299 (5607), pp. 716-719 
182. www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/nucleotide.