Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài xáo tam phân (paramignya trimera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
Phí Thị Cẩm Miện 
XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG 
VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN 
LOÀI XÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
HÀ NỘI, 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC 
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 
----------------------------- 
Phí Thị Cẩm Miện 
Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân 
giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9.42.02.01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Chu Hoàng Hà 
Hà Nội, 2021 
 i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của 
PGS.TS. Chu Hoàng Hà. Các kết quả thu được trong luận án Hoàn toàn trung thực 
và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
 Tác giả luận án 
 Phí Thị Cẩm Miện 
 ii 
LỜI CẢM ƠN 
Để hoàn thành Luận án, tôi xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Chu 
Hoàng Hà, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình 
thực hiện Luận án. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng 
nghiệp tại Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, 
tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực 
hiện Luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học và Công Nghệ - Viện 
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong 
thời gian thực hiện Luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 
2014-2019) đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and 
biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging 
to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai 
đoạn 2018-2019 để giúp tôi có nguồn kinh phí thực hiện các nội dung nghiên cứu 
của Luận án. 
Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình và 
bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành Luận án. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn ! 
 Phí Thị Cẩm Miện 
 iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii 
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi 
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii 
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix 
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 
2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................... 2 
2.1. Mục tiêu tổng quát ........................................................................................... 2 
2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2 
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................... 2 
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................. 2 
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3 
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ................................................... 3 
4.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 3 
4.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 3 
5. Những đóng góp mới của luận án .................................................................... 4 
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5 
1.1. Giới thiệu chung về chi Paramignya ............................................................... 5 
1.1.1. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya ........................................................... 5 
1.1.2. Một số thành phần hóa học và hoạtt tính sinh học chi Paramignya ................. 8 
1.2. Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt 
chất sinh học ................................................................................................... 11 
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân ...................................... 11 
1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam ......................... 11 
1.2.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân ..................... 16 
1.3. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật .............................. 20 
1.3.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ...................................................................... 20 
 iv 
1.3.2. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân 
biệt loài ........................................................................................................... 25 
1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa ............................ 31 
1.3.4. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ............................................ 34 
1.3.5. Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi 
Paramignya và loài P. trimera ........................................................................ 36 
1.4. Nhân giống loài Xáo tam phân ...................................................................... 37 
1.4.2. Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên ...................................................... 49 
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 52 
2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 52 
2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các 
mẫu thu thập ................................................................................................... 52 
2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân .................. 52 
2.1.3. Các chỉ thị phân tử DNA ................................................................................ 53 
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 57 
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 57 
2.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố ................ 57 
2.3.2. Phương pháp mô tả hình thái ......................................................................... 58 
2.3.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ............................................................ 58 
2.3.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR ............................... 58 
2.3.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử ................................................................ 59 
2.3.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự..................................................................... 59 
2.3.7. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự.......................................................... 60 
2.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân ..................................... 66 
2.4.1. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân ......... 66 
2.4.2. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân 
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 67 
2.4.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân............................................ 67 
2.4.4. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo 
tam phân ......................................................................................................... 68 
2.4.5. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân ........ 68 
2.4.6. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm ........................................................ 69 
 v 
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 70 
3.1. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi 
Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng .................................................... 70 
3.1.1. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu ................. 70 
3.1.2. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya ................................ 75 
3.2. Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode ............. 81 
3.3. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR ..... 81 
3.4. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài ................................................... 86 
3.4.1. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA ............................................. 86 
3.4.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST .......................................... 88 
3.5. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P. trimera .................... 95 
3.5.1. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya ............. 95 
3.5.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya ........................... 95 
3.5.3. So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân ..................... 97 
3.5.4. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài .............................................................. 97 
3.5.5. Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân ................................. 103 
3.5.6. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch .............. 108 
3.6. Nhân giống in vitro Xáo tam phân ............................................................... 112 
3.6.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân .......... 112 
3.6.2. Nghiên cứu xác định môi trường nền phù hợp với nhân nhanh in vitro 
Xáo tam phân ............................................................................................... 115 
3.6.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân.......................................... 116 
3.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh 
Xáo tam phân ............................................................................................... 119 
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 129 
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 131 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................... 132 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 133 
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 141 
 vi 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery 
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism 
BAP : 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine 
BI : Bayesia interference 
CSDL : Cơ sở dữ liệu 
CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide 
CV : Coefficient of Variation 
DNA : Deoxyribonucleic acid 
IAA : Acid indoleacetic 
IBA : 3-Indolebutyric acid 
ITS : Internal transcribed spacer 
ITS : Internal transcribed spacer 
KC : Knudson C medium 
LSD : Least significant differential 
LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 
matK : Maturase K 
MS : Murashige & Skoog medium 
MSA : Multiple sequence alignment 
NCBI : National Center for Biotechnology Information 
P. trimera : Paramignya trimera 
PCR : Polemerase Chain Reaction 
RAPD : Random Amplified Polymorphic 
rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase 
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism 
SSR : Simple sequence Repeat 
STS : Silver thiosulfate 
TDZ : Thidiazuron 
WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 
α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 
2.4 D : 2.4-Dichlorophenoxyacetic 
 vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Tổng hợp các chỉ thị phân tử sử dụng đối với genome lục lạp ............. 30 
Bảng 2.1. Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh ........ 52 
Bảng 2.2. Trình tự mồi SSR sử dụng .................................................................... 53 
Bảng 2.3. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL ........................................................... 56 
Bảng 3.1. Tổng hợp vị trí thu thập các mẫu tại Khánh Hòa và Lâm Đồng ........... 70 
Bảng 3.2. Số allen và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR ........................................... 83 
Bảng 3.3. Tổng hợp thông tin về DNA barcode của các loài thuộc chi 
Paramignya trong hệ thống BOLD ....................................................... 95 
Bảng 3.4. Tổng hợp các dữ liệu trình tự của các loài thuộc chi Paramignya ....... 96 
Bảng 3.5. Tổng hợp các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của các trình tự ........ 107 
Bảng 3.6. Khoảng cách trong loài và giữa loài của các dữ liệu trình tự ............. 108 
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của dung dịch nano bạc tới khả năng tạo mẫu sạch 
Xáo tam phân ...................................................................................... 112 
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của dung dịch Johnson tới khả năng tạo mẫu sạch 
Xáo tam phân ...................................................................................... 113 
Bảng 3.9. Ảnh hưởng sự kết hợp của dung dịch Johnson và nano bạc tới 
khả năng khử trùng tạo mẫu sạch Xáo tam phân ................................ 114 
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng, nhân nhanh 
Xáo tam phân ...................................................................................... 116 
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của TDZ, IBA và 2.4 D tới khả năng tạo mô sẹo Xáo 
tam phân .............................................................................................. 117 
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa TDZ, IBA và 2.4D tới sự phát 
sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân .......................................................... 118 
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân ......... 119 
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của TDZ tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân .................. 120 
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhó ...  1. 4 7 5: p. 352. 
43. Nolan kane, S.s., Hannes dempewolf , Ji yong yang, and j.m.m.e. dapeng zhang, and 
quentin cronk, Ultra-barcoding in cacao (theobroma spp.; malvaceae) using whole 
chloroplast genomes and nuclear ribosomal DNA. American Journal of Botany, 
2012. 99(2): p. 320–329. 
44. Shadi shokralla, J.f.g., Hhamid nikbakht,Daniel h. janzen, Winnie hallwachs‡ and 
Mehrdad haj ibabaei, Next-generation DNA barcoding: using next-generation 
sequencing to enhance and accelerate DNA barcode capture from single specimens. 
Molecular Ecology Resources, 2014. 9(12): p. 435 - 446. 
45. Tran Thanh Binh, S.S., Rumiko Suzuki, Miyuki Matsuda, Tran Thi Huyen Trang, 
and S.I.a.Y.Y. Dong Hyeon Kwon, Discovery of novel mutations for clarithromycin 
resistance in Helicobacter pylori by using next-generation sequencing. Journal of 
Antimicrobial Chemotherapy, 2014. 
46. Jill M Duarte, P.K.W., Patrick P Edger, Lena L Landherr, Hong Ma, J Chris Pires, Jim 
Leebens-Mack, and C.W. dePamphilis1, Identification of shared single copy nuclear 
genes in Arabidopsis, Populus, Vitis and Oryza and their phylogenetic utility across 
various taxonomic levels. BMC Evolutionary Biology, 2010. 10(61): p. 1471-2148. 
47. Shannon c. k. straub, M.p., Kevin weitemier, Mark fishbein, and a.A.l. Richard c. 
cronn, Navigating the tip of the genomic iceberg: next-generation sequencing for 
plant systematics American Journal of Botany 2012. 99(2): p. 349–364. 
48. Ilut D. C., C.J.E., Luciano A. K., and Owens T. G. et al., A comparative 
transcriptomic study of an allotetraploid and its diploid progenitors illustrates the 
unique advantages and challenges of RNAseq in plant species. . Amer. J. Bot 2012 
99: p. 383-396. 
49. Sarwar azam, V.t., Pradeep ruperao, Trushar shah, Jayashree balaji,, A.d.f. 
Bhanuprakash amindala, David j. studholme, Gregory d. may,, and J.d.g.J. David 
edwards, and Rajeev k. varshney, Coverage-based consensus calling (cbcc) of short 
sequence reads and comparison of cbcc results to identify snps in chickpea ( cicer 
arietinum ; fabaceae), a crop species without a reference genome. American Journal 
of Botany, 2012. 99(2): p. 193–208. 
137 
50. Juan e. zalapa, h.c., huayu zhu, shawn steffan, douglas senalik, eric zeldin, brent 
mccown, rebecca harbut, and philipp simon, Using next-generation sequencing 
approaches to isolate simple sequence repeat (ssr) loci in the plant sciences 
American Journal of Botany 2012. 99(2): p. 193-208. 
51. Paul D. N. Hebert* , A.C., Shelley L. Ball and a.J.R. deWaard, Biological 
identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond.B, 2003. 270: p. 313–321. 
52. Taberlet P., G.L., Pautou G. and Bouvet J. , Universal primer for amplification of 
three non-codding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 2007. 17: 
(1105-1109). 
53. Wang, X., et al., DNA barcoding a taxonomically complex hemiparasitic genus 
reveals deep divergence between ploidy levels but lack of species-level resolution. 
AoB Plants, 2018. 10(3): p. ply026. 
54. Shen, Y., et al., DNA barcoding and evaluation of genetic diversity in Cyprinidae 
fish in the midstream of the Yangtze River. Ecol Evol, 2016. 6(9): p. 2702-13. 
55. Pires, A.C.M., L., DNA barcoding and traditional taxonomy unified through 
Integrative Taxonomy: a view that challenges the debate questioning both 
methodologies. Biota Neotrop, 2010. 10(2): p. 339-346. 
56. Carneiro de Melo Moura, C., et al., Integrating DNA Barcoding and Traditional 
Taxonomy for the Identification of Dipterocarps in Remnant Lowland Forests of 
Sumatra. Plants (Basel), 2019. 8(11). 
57. N, L.P.a.G., Models of Molecular evolution and phylogeny. Genome Research, 1998. 
8: p. 1233 – 1244. 
58. J, F., PHYLIP (Phylogenetic inference package) version 3.57c. Department of 
Genetics, University of Washington: Washington. 1995. 
59. J., F., Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution, 
1985. 39(4): p. 783-791. 
60. R., S.P.a.S., Numerical Taxonomy. . Freeman: San Francisco, 1973. 
61. M, S.N.N., The neighbor-joining method: A new method for reconstructing 
phylogenetic trees. . Molecular Biology and Evolution, 1987. 4: p. 406-425. 
62. C., L., Genera plantarum. Stockholm, 1754. 5th edition. 
63. Kimura, M., A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions 
through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol, 1980. 16(2): p. 
111-20. 
64. B.S., G., Molecular clocks and nucleotide substitution rate in higher plants. 
Evolutionary Biology 1988. 30: p. 93-120. 
138 
65. J.A., B., Extinction, survival and genetic variation”. In: Schoenwald- Cox C.M., 
Chamber S.M., Macbryde B., Thomas L. (eds), . Genetics and Conservation, 1983: p. 
125-151. 
66. Weising K., N.H., Wolff K., Kahl G. Cpc Press Taylor & Fancies group., DNA 
Fingerprinting in Plants Principles, Methods, and applications (second Edition). 
Cpc Press Taylor & Fancies group., 2005. 
67. B.H., M., Population Genetics. John Wiley & Sons, Ltd., 2009. 
68. de Vicente M.C., L.C., Fulton T., Genetic Diversity Analysis with Molecular Marker 
Data: Learning Module. y. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI) 
and Cornell Universit, 2003. 
69. B.M., M.S.A.a.P., Analysis of genetic diversity in crop plants – salient statistical 
tools and considerations”, . Crop Science 2003. 43: p. 1235–1248. 
70. Lê Trần Bình, H.H.N., Lê Thị Muội Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến 
giống cây trồng. . NXB Nông nghiệp Hà Nội, 1997. 
71. Nguyễn Quang Thạch, N.T.L.A., Nguyễn Thị Phương Thảo, Giáo trình công nghệ 
sinh học Nông nghiệp. NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, 
2004. 
72. Nhut, D.T.L., Bui V.; Fukai, Seiichi; Tanaka, Michio and TThanh, Van K.T. , Effects 
of activated charcoal, explant size, explant position and sucrose concentration on 
plant and shoot regeneration of Lilium longiflorum via young stem culture. . Plant 
Growth Regulation, 2001. 33(1): p. 59-65. 
73. Murashige T., S.E., 1962., A revised medium for rapid growth and bioassays with 
tobacco tissues. . Plant Physiol. 15((3): p. 473- 497. 
74. Gamborg O. L., M.R.A., Ojima K., , Nutrient requirements of suspension cultures of 
soybean root cells. . Exp. Cell Res., , 1968. 50(1): p. 151-158. 
75. George E. F., d.K.G.J., The components of plant tissue culture media I: macro- and 
micro-nutrients. In: George EF, Hall AM, de Klerk GJ (eds.) Plant Propagation by 
Tissue Culture, . The Background, Springer, Dordrecht, The Netherlands. , 2008. 3rd 
Edition(1): p. 65-102. . 
76. Staden, M.J.P.J.v., Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on 
sucrose hydrolysis. Plant Growth Regulation, 1999. 29: p. 135-141. 
77. Đào, L.T.K., Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số giống cây trồng rừng bằng phương 
pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, cây Hông, Trầm hương). Tạp chí Sinh học, 2001: p. 
46-50. 
139 
78. Debergh P, A.-C.J., Cohen D, Grout B, Von and Z.R. Amold S, Ziv M, 
Reconsideration of the term “vitrification” as used in micropropagation. Plant Cell 
Tissue Organ Cult 1992. 30 p. 135-140. 
79. Mabberley, D.J., The species of Citrus (Rutaceae) with pinnate leaves. Blumea, 
2010. 55: p. 73-74. 
80. Phan Hữu Tôn*, T.V.H., Đoàn Văn Lư, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xuân Viết, Nuôi 
cấy in vitro trụ trên lá mầm giống cam (citrus sinensis), quýt (citrus reticulata). Tạp 
chí Khoa học và Phát triển, 2014. 12(5): p. 641-649. 
81. Nguyễn Thị Tâm, P.H.V., Dương Hữu Lộc, Nghiên cứu tái sinh in vitro cây quýt bắc 
kạn. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 2017. 171(11): p. 65 - 69. 
82. Trương Thị Bích Phượng, N.T.H., Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây xáo tam 
phân (Paramignya trimera). Tạp chí Khoa Học, Đại học Huế, 2014. 3(1): p. 562 -
576. 
83. Tran Trung Hieu, H.V.C., Bui Thi Linh Hue, Luong Thi My Ngan, Bui Lan Anh, Bui 
Văn Le, In vitro propagation of Xao tam phan (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.). 
Science & Technology Development, 2017. 20(2). 
84. Barkley, N.A., et al., Assessing genetic diversity and population structure in a citrus 
germplasm collection utilizing simple sequence repeat markers (SSRs). Theor Appl 
Genet, 2006. 112(8): p. 1519-31. 
85. Corazza-Nunes MJ, M.M., Nunes CWM, Cristofani M, Targon MLPN Assessment of 
genetic variability in grapeiruits (Citrus paradisi Macf) and pummelos (C. maxima 
(Burm.) Merr.) using RAPD and SSR markers. Euphytica, 2002. 126: p. 169-176. 
86. Froelicher Y, D.D., Badssene JB, Costantino G, Lotiy S, Didout C, Beaumont V, 
Brottier P, Risterucci AM, Luro F, Ollitrauh P, Characterization of microsatellite 
markers in mandarin orange (Citrus reticulate Blanco). Mol Ecol Res 2008. 8: p. 
119-122. 
87. Sun, Y., et al., Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal 
transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Theor Appl Genet, 1994. 89(1): p. 
26-32. 
88. Kyndt, T., et al., Molecular phylogeny and evolution of Caricaceae based on rDNA 
internal transcribed spacers and chloroplast sequence data. Mol Phylogenet Evol, 
2005. 37(2): p. 442-59. 
89. Group, C.P.W., A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 
106(31): p. 12794-7. 
90. Klein R.M., K.D.T., Research methods in Plant science. Garden City, Newyork. 
Natural History Press, 1970. 
140 
91. Thìn, N.N., Các phương pháp nghiên cứu thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia 
Hà Nội, 2007. 
92. Doyle JJ, D.J., Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 1990. 12: p. 13-15. 
93. Hall, T.A., BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and 
Analysis Program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series,, 
1999(41): p. 95-98. 
94. R.K., N.M.a.C., Estimation of fixation indices and gene diversitie. Ann. Hum. 
Genet., 1983. 47: p. 253-259. 
95. Yang, F., et al., DNA Barcoding for the Identification and Authentication of Animal 
Species in Traditional Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative 
Medicine, 2018. 2018: p. 1-18. 
96. McCown, B.H.a.L., G., Woody Plant Medium (WPM)—A Mineral Nutrient 
Formulation for Microculture of Woody Plant Species. HortScience, 1981. 16: p. 
453-453. 
97. L. Knudson, L.K., L. A. KNUDSON, C. Knudson, A new nutrient solution for the 
germination of orchid seeds. American Orquid Society Bulletim, 1946. 13(5): p. 222-
222. 
98. Bayer RJ, M.D., MortonC, A molecular phylogeny of the orange 
subfamily(Rutaceae: Aurantioideae) using nine cpDNA sequences. American Journal 
of Botany, 2009. 96(3): p. 668–685. 
99. Shin HS., Y.H., Kim SB., Lee MS. , Mechanism of growth of colloidal silver 
nanoparticles stabilized by polyvinyl pyrrolidone in gamma – irradiated silver 
nitrate solution. J. Colloid interface Sci., 2004. 274(1): p. 89-94. 
100. Wang G., S.C., Zhao N., Du X. , Synthesis and characterization of Ag nanoparticles 
assembled in ordered array pores of porous anodic alumina by chemical deposition. 
Materials Letters, 2007. 61(18): p. 3795-3797. 
101. Reza A.G., U.R.S., Maheran A.A., Rosfarizan M., Influence of cytokinins in 
combination with GA3 on shoot multiplication and elongation of tea clone Iran 100 
(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). ScientificWorld Journal. , 2014: p. 943054. 
102. Mehdi M., V.-O.G.O., Sepide T. , The effect of different concentrations of TDZ and 
BA on in vitro regeneration of Iranian cannabis (Cannabis sativa) using cotyledon 
and epicotyl explants. Journal of Plant Molecular Breeding, 2015. 3(2): p. 20-27. 
141 
PHỤ LỤC 
Bảng 1. Tổng hợp các mẫu thu thập và phân loại dựa vào hình thái 
Các mẫu thu thập 260/280 
Nồng độ gốc 
* (ng/µl) 
Độ pha loãng 
cho mồi ITS 
Độ pha loãng cho 
mồi MatK và rbcL 
P.trimera X1 
PT.X1.1 1,82 256 200 100 
PT.X1.2 1,85 350 250 150 
PT.X1.3 1,91 365 250 150 
PT.X1.4 1,84 270 200 100 
PT.X1.5 1,96 324 250 150 
PT.X1.6 1,90 456 300 150 
PT.X1.7 1,87 273 200 100 
P.trimera X2 
PT.X2.1 1,96 368 250 150 
PT.X2.2 1,75 412 300 150 
PT.X2.3 1,82 281 250 150 
PT.X2.4 1,94 365 250 150 
PT.X2.5 1,83 273 200 100 
P.trimera X3 
PT.X3.1 1,92 257 200 100 
PT.X3.2 1,94 354 250 150 
PT.X3.3 1,87 349 250 150 
PT.X3.4 1,80 475 300 150 
PT.X3.5 1,86 289 250 150 
PT.X3.6 1,93 376 250 150 
P.trimera X4 
PT.X4.1 2,01 314 250 150 
PT.X4.2 1,84 318 250 150 
PT.X4.3 1,89 326 250 150 
PT.X4.4 1,93 319 250 150 
PT.X4.5 1,98 412 300 150 
142 
P.trimera X5 
PT.X5.1 1,97 367 250 150 
PT.X5.2 1,93 340 250 150 
PT.X5.3 1,89 413 300 150 
PT.X5.4 1,80 368 250 150 
PT.X5.5 1,82 342 250 150 
PT.X5.6 2,03 279 200 100 
P. armata 
PA.1 1,78 341 250 150 
PA.2 2,01 324 250 150 
PA.3 1,97 367 250 150 
PA.4 1,82 415 300 150 
PA.5 1,89 279 200 100 
P. monophylla 
PM.1 1,79 367 250 150 
PM.2 1,84 356 250 150 
PM.3 1,98 309 250 150 
PM.4 2.02 275 200 100 
PM.5 1,97 298 200 100 
PM.6 1,81 300 200 100 
P. scandens 
PS.1 1,82 305 250 150 
PS.2 1,77 379 250 150 
PS.3 1,95 287 200 100 
PS.4 1,80 370 250 150 
PS.5 1,75 325 200 100 
P. rectispinosa 
PR.1 2,03 289 200 100 
PR.2 1,90 315 250 150 
PR.3 1,89 320 250 150 
PR.4 1,74 356 250 150 
PR.5 1,98 267 250 150 
(*) Số liệu làm tròn đến phần đơn vị (nano gram/microlit) 
143 
Bảng 2. Các trình tự chỉ thị ITS, MatK và rbcL đăng ký trong GenBank 
Tên mẫu và ký hiệu 
mẫu trình tự đăng ký ở 
NCBI 
Vị trí 
địa lý 
Số truy cập ở GenBank/NCBI 
Kinh độ/Vĩ độ ITS matK rbcL 
P. armata PA.VN Ninh Hải Khánh 
Hòa 
MT193825 MT215526 MT215536 12°52’42”N, 
109°22’52”E 
P. monophylla 
Wight 
PR.DL Di Linh 
Lâm Đồng 
MT193832 MT215519 MT215530 11°40’24”N, 
108°30’12”E 
P. scandens PR.CT Cát Tiên, Lâm 
Đồng 
MT193830 MT215518 MT215535 11°41’15”N, 
108°33’39”E 
P.trimera 
(Oliv.) Burkill 
PT1.NV 
PT2.NV 
Ninh Van, 
Khanh Hoa 
MT193826 
MT193827 
MT215522 
MT215524 
MT215529 
MT215528 
12°38’80”N, 
109°27’72”E 
12°26’06”N, 
109°12’40”E 
PT1.NH 
PT2.NH 
Ninh Hòa, 
Khánh Hòa 
MT193831 
MT193833 
MT215523 
MT215525 
MT215533 
MT215532 
12°25’25”N, 
109°04’55”E 
12°25’09”N, 
109°08’18”E 
PT2.DK Diên Khánh, 
Khánh Hòa 
MT193834 MT215521 MT215534 12°13’14”N, 
109°01’05”E 
P. rectispinosa PC.DD Cát Tiên, Lâm 
Đồng 
MT193828 MT215517 MT215527 11°44’12”N, 
107°20’32”E 
144 
145 
Hình 1. Kết quả căn nhiều trình tự ITS của các mẫu nghiên cứu bằng chương trình 
Clustal Omega 
Ghi chú: Vùng trình tự ITS của các loài thuộc chi Paramignya 
146 
147 
148 
Hình 2. Kết quả căn nhiều trình tự matK của các mẫu nghiên cứu bằng chương trình 
Clustal Omega 
Ghi chú: Vùng trình tự matK của các loài thuộc chi Paramignya 
149 
150 
151 
152 
Hình 3. Kết quả căn nhiều trình tự rbcL của các mẫu nghiên cứu bằng chương trình 
Clustal Omega 
Ghi chú: Vùng trình tự rbcL của các loài thuộc chi Paramignya 
Hình 4. Ma trận phần trăm giống nhau giữa các cặp trình tự trong nhóm các 
trình tự ITS, matK, rbcL 
Ghi chú: Các trình tự ITS (trên), các trình tự matK (giữa) và trình tự rbcL (dưới)