Luận án Nghiên cứu tạo interferon chifn - Α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men pichia pastoris và thử nghiệm trên các virus gây bệnh ở gà

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học 
Mã ngành: 62420201 
NGUYỄN THỊ THANH GIANG 
NGHIÊN CỨU TẠO INTERFERON ChIFN-α 
BIỂU HIỆN TRÊN HỆ THỐNG TẾ BÀO 
NẤM MEN Pichia pastoris VÀ THỬ NGHIỆM 
TRÊN CÁC VIRUS GÂY BỆNH Ở GÀ 
Cần Thơ, 2020 
 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG 
ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Hồ Quảng Đồ 
Người hướng dẫn phụ: TS. Nguyễn Đăng Quân 
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ 
cấp trường 
Họp tại:, Trường Đại học Cần 
Thơ 
Vào lúc .. giờ .. ngày .. tháng .. năm .. 
Phản biện 1: 
Phản biện 2: 
Phản biện 3: 
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 
1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam. 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 
1. Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ 
Quảng Đồ, 2020. Hiệu quả ức chế virus gây bệnh Gumboro 
của intereron trên gà thực nghiệm. Tạp chí Khoa học và 
Công nghệ Việt Nam, số 5 (62): 48-53. 
2. Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ 
Quảng Đồ, 2020. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính 
sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α). Tạp chí Khoa 
học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(111): 103-
107. 
3. Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ 
Quảng Đồ, 2020. Khả năng ức chế virus gây bệnh gumboro 
trên gà 3 tuần tuổi của interferon alpha gà. Tạp chí Khoa 
học Đại học Mở, sô 15 (7): 3-13. 
1 
Chương 1 
MỞ ĐẦU 
1.1 Tính cấp thiết của luận án 
Trong những năm gần, bệnh do virus trên gia cầm 
ngày càng nguy hiểm, có rất nhiều loại virus ảnh hưởng đến 
sức khỏe và năng suất của gia cầm như cúm gà, Gumboro, 
Newcastle. Việc sử dụng cytokines như tác nhân hỗ trợ 
nhằm tăng cường hiệu quả phòng ngừa và điều trị bệnh do 
virus ở gia cầm được quan tâm và ngày càng khả thi nhờ sự 
hỗ trợ của các kỹ thuật di truyền. Trong đó, ChIFN-α là một 
cytokine có tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghiệp chăn 
nuôi gia cầm. ChIFN-α là một phần của hệ miễn dịch không 
đặc hiệu, là yếu tố kích hoạt miễn dịch thường được sử dụng 
liều thấp kèm với vaccine nhằm tăng cường hiệu quả của 
vaccine. Các gene mã hóa cho ChIFN-α đã lần lượt được 
tạo dòng, biểu hiện và cho hoạt tính khi thử nghiệm in vitro 
và cả in vivo từ những năm 1994. Thêm nữa, việc sản xuất 
ChIFN-α với số lượng lớn sử dụng hệ thống Pichia pastoris 
là lựa chọn tốt nhất. hoàn toàn phù hợp tiêu chí: hiệu quả 
cao; giá thành thấp; đơn giản và tiện lợi khi sử dụng. Đây 
cũng chính là những lý do hướng đến "nghiên cứu tạo 
ChIFN-α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men Pichia 
pastoris nhằm sử dụng trong điều trị các bệnh do virus ở gà". 
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 
1.2.1 Mục tiêu chung: 
2 
Tạo được ChIFN-α tái tổ hợp, có khả năng kháng lại 
các virus gây bệnh trên gà, hướng đến sử dụng như thuốc 
điều trị các bệnh này. Đồng thời, xây dựng quy trình xác 
định đơn vị hoạt tính sinh học của ChIFN-α tái tổ hợp. 
1.2.2 Nội dung nghiên cứu: 
Nghiên cứu được tiến hành với 3 nội dung: 
(1) Tạo chủng nấm men Pichia pastoris mang gene 
mã hóa cho ChIFN-α có khả năng biểu hiện hệ thống lên 
men tự động BioFlo®/Cellien® 115 (New Brunswick) dung 
tích 5L với hàm lượng cao (>500µg/L) và ổn định. 
(2) Đánh giá hoạt tính kháng virus của ChIFN-α tái tổ 
hợp (rChIFN-α) biểu hiện trên nấm men Pichia pastoris 
trong điều kiện in vitro, in ovo và in vivo. 
(3) Xây dựng quy trình xác định đơn vị hoạt tính 
(IU/mg) của rChIFN-α. 
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 
Đối tượng nghiên cứu là protein interferon alpha gà 
tái tổ hợp (rChIFN-α) được thu nhận từ dịch nuôi cấy nấm 
men Pichia pastoris. 
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 
Interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α)thu nhận từ 
dịch nuôi cấy được đánh giá hoạt tính kháng virus gây 
bệnh Newcastle trên tế bào UMNS/DF1; đánh giá khả 
năng ngăn cản sự nhân lên của virus Cúm trên phôi gà và 
3 
đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh Gumboro trên gà 
3 tuần tuổi. 
1.4 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 
Thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 tại 
Trường Đại học Cần Thơ, Trung tâm Công nghệ Sinh học 
Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế 
Nha Trang. 
1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn và tính mới của luận án, 
Hiện nay, bệnh do virus trên gia cầm ngày càng 
nghiêm trọng. Có rất nhiều loại virus ảnh hưởng đến sức 
khỏe và năng suất gia cầm như cúm gà, Gumboro, 
Newcastle. Do đó, việc tìm ra phương pháp trong ngừa và 
trị các bệnh trên gia cầm là yêu cầu cấp bách. Trong đó, 
việc sử dụng các cytokine đang nhận được nhiều sự quan 
tâm. ChIFN- là một cytokine có tiềm năng ứng dụng lớn 
trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm. ChIFN- là một phần 
của hệ miễn dịch không đặc hiệu, có đặc tính ức chế sự hoạt 
động của mRNA dẫn đến sự ức chế quá trình nhân lên virus. 
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ChIFN- chưa nhiều, cũng 
như chưa có nghiên cứu sản xuất ChIFN- ở quy mô pilot. 
Nghiên cứu này tạo cơ sở ban đầu cho việc sản xuất ChIFN- 
tái tổ hợp, có khả năng kháng lại các bệnh do virus gây ra 
trên gà, có tiềm năng ứng dụng cao trong chăn nuôi gia cầm 
trong điều kiện Việt Nam, hướng dẫn tạo chế phẩm dùng 
trong phòng ngừa, điều trị bệnh do virus gây ra trên gia 
cầm. Do vậy, nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn 
cao. 
4 
Luận án là một công trình nghiên cứu đầu tiên xây 
dựng được quy trình sản xuất ChIFN-α tái tổ hợp trên hệ 
thống lên men 5L và xác định hiệu quả kháng virus gây 
bệnh trên gà (cúm, Newcastle, Gumboro), từ đó có thể ứng 
dụng trong phòng ngừa và khu trú các ở dịch khi có dịch 
bệnh xảy ra. Ngoài ra, luận án đã xây dựng được quy trình 
thường quy xác định đơn vị hoạt tính của ChIFN-α, dễ dàng 
thực hiện tại các phòng thí nghiệm cơ bản. Kết quả nghiên 
cứu này chứa thông tin tham khảo có giá trị cho các Trung 
tâm Kiểm nghiệm Sinh học. Hơn nữa, nghiên cứu này đặc 
biệt có ý tính mới vì hiện nay các cơ quan Kiểm nghiệm 
thuốc Thú y chưa kiểm tra được chất lượng sản phẩm 
interferon dùng cho Thú y đang lưu hành trên thị trường. 
1.6 Bố cục của luận án 
 Luận án dài 130 trang, gồm các phần giới thiệu, tổng 
quan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết quả thảo luận, 
kết luận đề nghị và tài liệu tham khảo. Luận án có 35 bảng, 
60 hình và 138 tài liệu tham khảo. 
Chương 2 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
Tổng quan tài liệu gồm 4 nội dung với các kiến thức 
tổng quát. Nội dung 1 trình bày sơ lược về interferon gà 
(ChIFN) gồm danh pháp, chi tiết về interfron alpha gà 
(ChIFN-α) và ứng dụng, các hệ thống dùng để biểu hiện 
ChIFN-α. Nội dung 2 trình bày về một số virus gây bệnh 
5 
trên gà bao gồm virus Newcastle, virus gây bệnh Gumboro 
và virus Cúm A. Nội dụng 3, trình bày về hệ thống biểu 
hiện protein, pichia pastoris, bao gồm các kiến thức về các 
chủng pichia pastoris, con đường biến dưỡng metanol và 
quá trình biến đổi sau dịch mã của pichia pastoris, các 
vector biểu hiện và cơ chế hình thành chủng mang nhiều bản 
sao gene ngoại lai của pichia pastoris. Nội dung 4 nói về các 
phương pháp xác định đơn vị hoạt tính của ChIFN-α, trong 
đó có trình bày về các chọn chủng virus tương tứng với dòng 
tế bào, và quy trình xác định hiệu giá iterferon alpha 2b người, 
quy định trong dược điển Việt Nam V. 
Chương 3 
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
3.1 Vật liệu thí nghiệm 
Dòng tế bào UMNSAH/DF1 (ATCC) 
Chủng E. coli DH5α (Nanogen Biopharma) 
Chủng Pichia pastoris SMD1168 (his4) (Nanogen 
Biopharma) 
Vector biểu hiện pPIC9K (Invitrogen) 
Dịch virus Newcastle, Gumboro (Đại học Cần Thơ) 
Dịch virus H5N1, phôi sạch bệnh 10 ngày tuổi (viện 
Vaccine & Sinh phẩm Y tế Nha Trang). 
6 
Gà giống lai giữa gà Lương Phượng, Tam Hoàng và 
gà công nghiệp (Trại gà giống Vĩnh Long). 
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 
Luận án thực hiện 3 nội dung chính, được trình bày 
theo sơ đồ thí nghiệm tổng quát hình 3.1. 
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của luận án 
3.2.1 Nội dung 1: biểu hiện ChIFN-α tái tổ hợp trên 
nấm men Pichia pastoris 
Nội dung này thực hiện theo sơ đồ hình 3.2. 
Chỉ tiêu đánh giá: gene ChIFN-α có trình tự tương 
đồng 100% so với trình tự trong gene bank; chủng pichia 
pastoris có mang gene ChIFN-α mọc được trên môi trường 
có chứa G418 nồng độ 10 mg/L; protein biểu hiện bắt cặp 
đặc hiệu với kháng thể kháng ChIFN-α và khi nuôi cấy biểu 
7 
hiện ở điều kiện nuôi cấy lắc, lên men trên bồn 5L có lượng 
protein mục tiêu chiếm 80% protein tổng số. 
Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm biểu hiện ChIFN-α tái tổ hợp 
3.2.2 Nội dung 2: đánh giá hoạt tính kháng virus của 
dịch ChIFN-α biểu hiện trên tế bào Pichia pastoris 
Hoạt tính kháng virus của interferon alpha gà tái tổ 
hợp được thử nghiệm ở điều kiện in vitro, in ovo và in vivo. 
(1) Khả năng kháng virus gây bệnh Newcastle 
(Newcastle disease virus, NDV) nhiễm trên lớp đơn tế bào 
UMNSAH/DF1 (điều kiện in vitro). 
8 
(2) Khả năng ức chế sự nhân lên của virus cúm trên 
phôi gà sạch bệnh 10 ngày tuổi (điều kiện in ovo) 
(3) Khả năng kháng virus gây bệnh Gumboro trên gà 
con 3 tuần tuổi (điều kiện in vivo). 
3.2.2.1 Khả năng kháng virus Newcastle của rChIFN-α ở 
điều kiện in vitro 
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng 
virus NDV của dịch rChIFN-α ở điều kiện in vitro 
Chỉ tiêu đánh giá: virus gây bệnh tích cho tế bào có 
các biểu hiện đặc trưng, xác định nồng độ dịch rChIFN-α 
không ảnh hưởng đến sự sống của tế bào và tỉ lệ tế bào sống 
khi bị nhiễm virus ở nhóm có xử lý với rChIFN-α cao hơn 
khác biệt so với nhóm không điều trị. 
3.2.2.2 Khả năng kháng virus Cúm A H5N1 của 
rChIFN-α ở điều kiện in ovo 
Thí nghiệm được thực hiện theo sơ đồ hình 3.5 
9 
Chỉ tiêu đánh giá: liều gây nhiễm 50% phôi thử 
nghiệm (EID50) của nhóm có xử lý rChIFN-α phải thấp hơn 
nhóm phôi không xử lý rChIFN-α (nhóm đối chứng). 
Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng virus 
Cúm của dịch rChIFN-α trên phôi gà 10 ngày tuổi 
3.2.2.3 Khả năng kháng virus gây bệnh Gumboro của 
rChIFN-α ở điều kiện in vivo 
Thí nghiệm được thể hiện trong hình 3.6. 
Chỉ tiêu đánh giá: tỉ lệ gà bảo được hộ, tỉ lệ gà sống. 
10 
Hình 3.6 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng virus 
gây bệnh Gumboro của rChIFN-α trên gà 3 tuần tuổi. 
3.2.3 Nội dung 3: Xây dựng quy trình xác định đơn vị 
hoạt tính (IU/g) của rChIFN-α 
 Quy trình xác định đơn vị hoạt tính của rChIFN-α 
được thực hiện theo quy trình xác định hiệu giá của 
Interferon alpha 2b Dược điển Việt Nam V (Bộ Y tế, 2018) 
có cải biến để phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm. 
Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ tế bào phù hợp đưa lên giếng; 
chủng virus phù hợp sử dụng trong thí nghiệm. 
11 
Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm xây dựng quy trình xác định đơn 
vị hoạt tính của rChIFN-α. 
 Thí nghiệm xác định đơn vị hoạt tính (IU/mg) của các 
mẫu rChIFN-α được bố trí theo sơ đồ hình 3.9 
Hình 3.9 Sơ đồ bố trí các nghiệm thức khi xác định đơn vị 
hoạt tính sinh học của rChIFN-α tái tổ hợp trên đĩa 96 giếng. 
12 
3.3 Xử lý số liệu 
Tất cả các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm 
thống kê Stagraphic XV.I. 
Chương 4 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
4.1 Tạo chủng Pichia pastoris mang gene mã hóa cho 
ChIFN-α 
4.1.1 Tổng hợp gene mã hóa cho ChIFN-α 
Với khuôn mẫu (sample) là bộ gene gà, phản ứng PCR 
được thực hiện với cặp mồi xuôi và mồi ngược nhằm 
khuếch đại đoạn gene mã hóa cho đoạn peptide trưởng thành 
của ChIFN-α, có chiều dài 506 bp. 
4.1.2 Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid 
pPIC9K tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho ChIFN-α 
 Đoạn gene ChIFN-α được cắt nối vào plasmid 
pPIC9K để tạo plasmid pPIC9K tái tổ hợp mang gene, sau 
Hình 4.1 Khuếch đại gene 
ChIFN-α bằng phản ứng PCR với 
mồi CHIFNα-F/R. M: thang 
DNA; giếng 1, 2: sản phẩm PCR 
(vạch sản phẩm ở mức 500 bp 
tương ứng với ChIFN-α đã được 
khuếch đại thành công từ genomic 
DNA của gà) 
13 
đó biến nạp vào Ecoli, chọn lọc được 04 khuẩn lạc chứ 
plasmid mang gene. 
Hình 4.2 Phản ứng cắt giới hạn bằng EcoR I và Not I kiểm 
tra sự hiện diện của ChIFN-α trong rpPIC9K. M: thang 
DNA; Ở các giếng 2, 3, 7 và 8 xuất hiện vạch ở vị trí 500 
bp tương ứng với kích thước của ChIFN-α chứng tỏ chủng 
có chứa plasmid mang gene. 
Kết quả giải trình tự plasmid pPIC9K tái tổ hợp cho 
thấy gene ChIFN-α có trình tự đúng hoàn toàn với trình tự 
lý thuyết. 
4.1.3 Tạo dòng tế bào Pichia pastoris mang nhiều bản 
sao của gene mã hóa cho ChIFN-α 
Nấm men Pichia pastoris có mang gene ChIFN-α sẽ 
mọc được trên môi trường MD không có histidine. Quá 
trình sàng lọc chủng mang nhiều bản sao gene mục tiêu thực 
hiện trên môi trường YPD, chứa kháng sinh G418 
(geneticin, một loại kháng sinh chuyên dùng cho sàng lọc 
các dòng Pichia pastoris được chèn nhiều gene mục tiêu) 
với nồng độ tăng dần 2, 4, 6, 8, 10 mg/ml để sàng lọc ra các 
dòng tế bào nấm men có mang nhiều bản sao gene mục tiêu. 
14 
Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc Pichia pastoris tái tổ hợp mang 
nhiều bản sao gene mục tiêu bằng môi trường YPD chứa 
kháng sinh G418 
Môi trường sàng lọc 
G418 (mg/ml) 
2 4 6 8 10 
Số khuẩn lạc 112 48 19 9 5 
4.1.4 Biểu hiện rChIFN-α trên quy mô nuôi cấy lắc 
(shaking flask) 
Kết quả cho thấy rChIFN-α bắt đầu xuất hiện từ 24 
giờ cảm ứng với methanol (bảng 4.2). Kết quả điện di trên 
gel Tricine SDS-PAGE cho thấy các vạch có kích thước 
khoảng 19 kDa tương ứng với ChIFN-α là các vạch đậm 
nhất. Phân tích bằng phần mềm ImageJ cho phép ước lượng 
rằng protein mục tiêu (ChIFN-α) chiếm hơn 80% protein 
tổng số của dịch lên men (hình 4.4). 
Bảng 4.2 Hàm lượng protein tổng số tạo ra trong quá trình 
biểu hiện ChIFN-α ở quy mô nuôi cấy lắc 
Thời gian cảm ứng 
biểu hiện (giờ) 
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 
Protein tổng số 
(g/L) 
3,67a 2,1 92,67b 2,0 166,67c 51,3 217c 30,1 
* Các chữ số trong cùng một hàng khác nhau thì sai khác nhau có ý 
nghĩa thống kê (P<0,05) 
15 
Hình 4.4 Thành phần protein biểu hiện của chủng Pichia 
pastoris mang gene mã hóa cho ChIFN-α trên quy mô nuôi 
cấy lắc được phân tích bằng Tricine SDS-PAGE. M: thang 
protein; giếng 1-4: lượng protein biểu hiện tại thời điểm 0 giờ, 
24 giờ và 72 giờ. Hàm lượng protein tổng số biểu hiện tăng 
dần theo thời gian và đạt 0,217 mg/L tại thời điểm 72 giờ. 
Hình 4.5 Kết quả Western blot của dịch nổi biểu hiện 
ChIFN-α ở các thời điểm cảm ứng methanol. M: thang 
protein; tại thời điểm 24 giờ biểu hiện, bắt đầu có protein 
xuất bắt đầu có sự hiện diện của có sự ChIFN-α và hàm 
lượng protein tăng theo thời gian biểu hiện. 
16 
4.1.5 Biểu hiện ChIFN-α trên hệ thống lên men 
BioFlo®/Cellien® 115 
 Theo khuyến cáo của nhà cung cấp chủng pichia 
pastoris (hãng Invitrogen), hàm lượng methanol cảm ứng 
có ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của tế bào nấm men 
cũng như khả năng sinh tổng hợp protein. Do đó, hàm lượng 
methanol, bổ sung vào môi trường trong giai đoạn cảm ứng 
biểu hiện rChIFN-α trên hệ thống nuôi cấy tự động, sẽ được 
khảo sát ở tốc độ bơm cố định 5 ml/L (chiến lược 1) và tốc 
độ bơm tăng dần theo thời gian cảm ứng từ 5ml/ L.h, 7ml/ 
L.h và 9ml/ L.h (chiến lược 2) trong suốt 72h giờ cảm ứng 
biểu hiện. Kết quả chi tiết về khối lượng sinh khối ướt 
(lượng tế bào nấm men) và hàm lượng protein tổng số của 
quá trình lên men theo từng chiến lược được trình bày trong 
hình 4.6 và 4.7. 
Hình 4.6 Lượng sinh khối ướt và hàm lượng protein được 
sản xuất theo thời gian trong quy trình lên men sử dụng 
chiến lược 1 
17 
Hình 4.7 Lượng sinh khối ướt và hàm lượng protein được 
sản xuất theo thời gian trong quy trình lên men sử dụng 
chiến lược 2 
4.2 Đánh giá hoạt tính của dịch rChIFN-α biểu hiện trên 
tế bào nấm men Pichia pastoris 
4.2.1 Khả năng kháng virus NDV của rChIFN-α ở điều 
kiện in vitro 
* Ảnh hưởng của dịch rChIFN-α lên sự phát triển tế bào 
UMNSAH/DF1 
Khi cho tế bào tiếp xúc rChIFN-α ở nồng độ 12,5 
µg/ml và 6,25 µg/ml tế bào có tỉ lệ sống đạt 97%, không 
khác biệt so với nhóm đối chứng (bảng 4.6). Tuy nhiên, chỉ 
ở nhóm tiếp xúc rChIFN-α nồng độ 12,5 µg/ml, tế bào có 
hiện tượng tăng sinh bất thường, tế bào mọc chồng lên 
nhau, tạo thành các cụm, không duy trì hình dạng của tế bào 
bình thường. Do vậy, rChIFN-α nồng độ 6,25 µg/ml được 
khẳng định là an toàn, không ảnh hưởng đến sự sống cũng 
như khả phát triển của tế bào. 
18 
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của rChIFN-α đến sự sống của tế bào 
Độ pha 
loãng 
mẫu 
rChIFN-α 
(μg/ml) 
Giá trị OD595 
(Mean ± SD) 
Tỉ lệ sống (%) 
1 50 0,114d ± 0,015 15,24d ± 1,97 
2 25 0,242c ± 0,004 32,44c ± 0,57 
4 12,5 0,723b ± 0,027 97,13b ± 3,64 
8 6,25 0,725b ± 0,013 97,33b ± 1,72 
16 3,12 0,732ab ± 0,018 98,29ab ± 2,45 
32 1,56 0,73ab ± 0,008 98,2ab ± 1,10 
Đối chứng 0 0,745a ± 0,008 100a ± 1,05 
* Các chữ số trong cùng một cột khác nhau thì sai khác nhau có ý 
nghĩa thống kê (P<0,05)
.ư. 
Đối chứng: tế bào nuôi cấy trong DMEM, 10% FBS
* Hiệu quả kháng sự hình thành CPE do virus gây ra 
của rChIFN-α 
Bảng 4.7 Hiệu quả ức chế sự hình thành CPE của rChIFN-α 
Nhóm 
Giá trị OD595 
(Mean ± SD) 
Tỉ lệ tế bào 
sống (%) 
rChIFN-α 1 µg/ml 0,709b ± 0,016 89,87b ± 4,70 
rChIFN-α 0,1 µg/ml 0,710b ± 0,018 89,96b ± 4,65 
rChIFN-α 0,01 µg/ml 0,414d ± 0,014 52,40d ± 2,59 
rChIFN-α 0,001 µg/ml 0,268e ± 0,013 33,95e ± 2,43 
ChIFN-α chuẩn 1000 
IU/ml 
0,441c ± 0,021 55,82c ± 3,03 
Đối chứng (-) 0,212f ± 0,016 26,94f ± 2,78 
Đối chứng tế bào 0,791a ± 0,035 100a ± 0,0 
19 
* Các chữ số trong cùng một cột khác nhau thì sai khác nhau có 
ý nghĩa thống kê (P<0,05) 
Đối chứng (-): tế bào được xử lí với NDV, không ChIFN-α 
Đối chứng tế bào: tế bào không xử lí với NDV, không ChIFN-α 
Dịch rChIFN-α đã bảo vệ tế bào khỏi tác hại của virus, 
hiệu quả bảo vệ phụ thuộc liều sử dụng. Nồng độ tối ưu để 
bảo vệ giúp khoảng 90% tế bào sống là 0,1 µg/ml. Dịch 
rChIFN-α ở nồng độ này có hiệu quả bảo vệ tế bào tốt hơn 
sản phẩm thương mại với liều 1000 IU/ml (bảng 4.7) 
4.2.2 Khả năng kháng virus Cúm của rChIFN-α ở 
điều kiện in ovo 
* Hiệu quả của rChIFN-α trong phòng bệnh Cúm A/H5N1 
Kết quả trình bày trong bảng 4.13 cho thấy, rChIFN-α 
ở liều 100µg đã làm tăng sức đề kháng của phôi gà với 
chủng virus cúm A/H5N1 thử nghiệm thể hiện qua lượng 
virus cần để gây nhiễm 50% phôi cao gấp 10 lần so với lô 
phôi không xử lý IFN (độ pha loãng 107,24 /108,24). 
Bảng 4.13 Tác dụng bảo vệ phôi gà của rChIFN-α khi thử 
thách với chủng cúm A/H5N1 
Nhóm 
Số 
phôi 
Hàm lượng 
rChIFN-α 
(µg/phôi/0,1ml) 
Kết quả 
(EID50/0,1ml) 
1 80 100 µg 10 7.24 
2 80 10 µg 10 7.54 
3 80 1 µg 10 7.79 
5 80 PBS 10 8.24 
20 
4.2.3 Khả năng kháng virus Gumboro của rChIFN-α ở 
điều kiện in vivo 
* Hiệu quả của rChIFN-α trong điều trị bệnh Gumboro 
Khả năng kháng của rChIFN-α thể hiện rõ ở tỉ lệ gà 
được bảo hộ và tỉ lệ gà sống . Kết quả cho thấy tỉ lệ gà bảo 
hộ ở các nhóm sử dụng rChIFN-α hàm lượng 0,1 µg - 100 
µg/con dao động từ 46,67% - 66,67%, tương ứng (hình 
4.28). Trong khi đó, nhóm ĐC (+), gà không được bảo hộ 
(0%) và khác biệt có ý nghĩa so với các nhóm được điều trị 
(P=0,001). Tương tự, tỉ lệ gà sống ở các nhóm sử dụng 
rChIFN-α dao động 80 – 93,3% và cao hơn so với nhóm 
đối chứng ĐC(+) (60%). Hai nhóm sử dụng rChIFN-α 100 
µg/con và 10 µg/con, có tác dụng điều trị như nhau. Kết quả 
thí nghiệm cho thấy sử dụng rChIFN-α với liều 10µg/con 
đạt hiệu quả cao nhất, hạn chế tỉ lệ bệnh và chết trong điều 
trị bệnh Gumboro hơn so với các liều khác 
Hình 4.28 Hiệu quả kháng virus Gumboro của rChIFN-α qua 
các nồng độ sử dụng 
21 
* Hiệu quả của rChIFN-α trong phòng và trị bệnh 
Gumboro 
Kết quả cho thấy, rChIFN-α (liều 10 µg/con) khi dùng 
phòng bệnh tỉ lệ bảo hộ đạt 83% và khi gà đã bị nhiễm bệnh, 
nên sử dụng liều 100 µg/con để điều trị, tỉ lệ bảo hộ đạt 73,3%. 
Hình 4.31 Hiệu quả rChIFN-α khi sử dụng trong phòng và 
điều trị bệnh Gumboro 
4.3 Quy trình xác định đơn vị hoạt tính (IU/g) của rChIFN-α 
4.3.1 Mật độ tế bào UMNSAH/DF-1 phù hợp đưa lên đĩa 
Mật độ tế bào được khảo sát đưa lên đĩa 96 giếng với 
mục tiêu sau 24 giờ đưa lên đĩa, tế bào sẽ bám khoảng 80% 
diện tích bề mặt nuôi cấy. Số lượng tế bào được đưa vào mỗi 
giếng lần lượt là 5×103 tế bào/giếng, 1×104 tế bào/giếng, 
2×104 tế bào/giếng và 4×104 tế bào/giếng. Quan sát hình thái 
ở các mốc thời điểm sau 24 giờ và 48 giờ đưa tế bào lên đĩa 
ghi nhận được một số kết quả (hình 4.32; 4.33). Kết quả cho 
22 
thấy, lượng tế bào đưa vào ban đầu phù hợp nhất là 2×104 
tế bào/giếng hay 2×105 tế bào/ml. Kết quả này phù hợp với 
mật độ tế bào sử dụng trong các quy trình thực hiện được 
trình bày trong nghiên cứu của Xia (2004), Wang (2019). 
Hình 4.32 Hình thái tế bào sau 24 giờ nuôi với lượng tế bào trên 
mỗi giếng là 5×103 (a); 1×104 (b), 2×104 (c) và 4×104 (d). Mũi 
tên trắng chỉ các hình thái của tế bào bám trải; mũi tên đen 
chỉ các tế bào tròn, không bám trải và chết. 
23 
Hình 4.33 Hình thái tế bào sau 48 giờ nuôi với lượng tế bào 
trên mỗi giếng là 5×103 (a); 1×104 (b), 2×104 (c) và 4×104 (d). 
vùng vòng tròn màu trắng là nơi tế bào có hiện tượng mọc 
chồng lên nhau 
4.3.3 Xác định liều TCID50 của virus NDV và VSV 
Virus VSV và NDV sau khi đã thích nghi trên tế bào 
UMNSAH/DF-1 được nhân lên và xác định liều TCID50 để 
sử dụng cho các thử nghiệm xác định đơn vị hoạt tính. 
Liều virus sử dụng trong quy trình xác định hoạt tính 
là 100 TCID50/ml, nên các mẫu virus sẽ được pha loãng để 
đạt được nồng độ này. 
24 
Bảng 4.20 bảng tính TCID50 của dịch virus VSV và NDV 
Các thông số VSV NDV 
Nồng độ virus 
pha loãng CPE 
trên và dưới 50% 
10-6 và 10-7 10-4 và 10-5 
Khoảng cách tỉ 
lệ (PD) 
0,41 0,71 
Nồng độ virus 
pha loãng cho 
CPE 50% 
10-6,41 10-4,71 
TCID50/0,1 ml 106.41 104.71 
Ý nghĩa chỉ số 
TCID50/0,1 ml 
1 ml dịch virus 
VSV ban đầu chứa 
107.4 TCID50 
1 ml dịch virus 
NDV ban đầu chứa 
105.71 TCID50 
4.3.4 Xác định đơn vị hoạt tính (IU/mg) của rChIFN-α sử 
dụng NDV và VSV 
Đơn vị hoạt tính (IU/mg) của rChIFN-α được xác định 
dựa trên quy trình xác định hiệu giá của của Interferon 
alpha 2b (Dược điển Việt Nam V, Bộ Y tế, 2018) có cải 
tiến. Các mẫu rChIFN-α thử nghiệm có hàm lượng protein 
lần lượt là 160 μg/ml, 120 μg/ml và 104 μg/ml. 
25 
Bảng 4.27 Kết quả tính đơn vị hoạt tính và các giá trị liên 
quan của mẫu rChIFN-α thử nghiệm ở 2 quy trình sử dụng 
NDV và VSV 
rChIFN-α 
Quy trình 
với NDV 
Quy trình 
với VSV 
Mẫu 1 
(160 
μg/ml) 
Nr 4,313 4,138 
Ns 6,65 6,296 
Hiệu giá 504,939 446,541 
Hoạt tính (IU/ml) 5x106 4,5x106 
Hoạt tính (IU/mg) 3,1 x 107 2,8 x 107 
Mẫu 2 
(120 
μg/ml) 
Nr 3,832 3,945 
Ns 6,799 6,862 
Hiệu giá 781,939 749,831 
Hoạt tính (IU/ml) 7,8x106 7,5x106 
Hoạt tính (IU/mg) 6,5x107 6,3x107 
Mẫu 3 
(104 
μg/ml) 
Nr 3,948 3,942 
Ns 7,069 6,952 
Hiệu giá 870,158 805,36 
Hoạt tính (IU/ml) 8,7x106 8,1x106 
Hoạt tính (IU/mg) 8,4x107 7,7x107 
Nếu lấy kết quả theo quy trình VSV làm chuẩn (tương 
đương độ chính xác 100%) để làm quy chiếu cho kết quả 
tính theo quy trình NDV, kết quả nhận được theo quy trình 
sử dụng virus NDV của các mẫu lần lượt là 90,3%, 96,9%, 
92,8% tương ứng với độ chênh lệch kết quả 9,7%; 3,1% và 
92,8% của các mẫu 1, 2 và 3. Những kết quả này cho thấy, 
độ chênh lệch đơn vị hoạt tính khi sử dụng 2 loại virus đều 
nằm trong khoảng cho phép của bộ y tế (hiệu giá sai số cho 
26 
phép nằm trong khoảng 70%-150%). Do vậy có thể sử dụng 
virus NDV trong quy trình xác định đơn vị hoạt tính 
rChIFN-α. Từ đó, quy trình xác định đơn vị hoạt tính của 
rChIFN-α sẽ sử dụng virus NDV liều 100 TCID50, lượng tế 
bào đưa vào mỗi giếng là 2×104 tế bào. 
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
5.1 Kết luận 
Sau quá trình thực hiện nghiên cứu, đề tài đã thu được 
1 số kết quả: 
- Đã thu được 5 dòng nấm men chứa nhiều bản sao 
gene ChIFN-α trong bộ gene nấm men. Chủng nấm men 
biểu hiện protein rChIFN-α có hàm lượng 1,48 g/L, trong 
đó của protein mục tiêu chiếm 80% protein tổng số. 
- Dịch rChIFN-α khi sử dụng ở nồng độ 0,1 μg/ml có 
hiệu quả bảo vệ tế bào nhiễm NDV, lượng tế bào sống đạt 
89,9% so với đối chứng nhiễm virus không được điều trị 
(26,9%). Trên phôi gà, rChIFN-α hàm lượng 100 µg/con 
giúp ngăn cản sự lây nhiễm của virus Cúm A/H5N1 bằng 
cách làm giảm liều gây nhiễm 50% phôi thử nghiệm 
(EID50). Liều EID50 của nhóm đối chứng sử dụng PBS 
(108,24) cao hơn nhóm sử rChIFN-α (107,24)10 lần. Trên gà, 
điều trị với liều rChIFN-α 0,1 µg/con - 10 µg/con, tỉ lệ bảo 
hộ đạt 46,7 - 66,7% tương ứng. Dịch rChIFN-α khi sử dụng 
phòng bệnh Gumboro với liều 10 µg/con đạt tỉ lệ bảo hộ 
hơn 83%. Các kết quả trên cho thấy rChIFN-α có khả năng 
kháng virus ở điều kiện in vitro, in ovo và in vitro, hiệu quả 
bảo vệ phụ thuộc vào liều sử dụng. 
27 
- Quy trình xác định đơn vị hoạt tính rChIFN-α với 
các thông số cụ thể: mật độ tế bào đưa lên đĩa 96 là 2x105 
tế bào/ml (2x104 tế bào/giếng/100µl); sử dụng virus NDV 
với liều 100 TCID50/0,1ml; đơn vị hoạt tính (IU/mg) của 
cùng một mẫu ở các lần thí nghiệm lặp lại có sai số khoảng 
10%. Đơn vị hoạt tính của mẫu rChIFN-α (IU/mg) khoảng 
3,1- 8,4 107. 
5.2 Kiến nghị 
- Khảo sát thêm 04 chủng Pichia pastoris còn lại (05 
chủng mọc trên môi trường chứa G418 10mg/L) để chọn 
chủng có khả năng biểu hiện protein cao. 
- Khảo sát các điều kiện lên men trên hệ thống lên men 
tự động để tăng hiệu suất thu nhận protein: khảo sát thành 
phần của môi trường nuôi cấy, tốc độ bổ sung methanol. 
- Ngiên cứu, đánh giá hiệu quả kháng virus của 
rChIFN-α khi thực hiện qua đường tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm 
cơ với niêm mạc để có khuyến cáo phù hợp. 
- Nghiên cứu, đánh giá việc bổ sung rChIFN-α cùng các 
vaccine phòng bệnh do virus trong việc tăng cường đáp ứng 
và hiệu quả miễn dịch của gà