Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A / H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
LÊ THỊ THỦY 
NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN 
TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 
BẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI 
TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) 
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”. 
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật 
 Mã số: 9 42 01 12 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Hà Nội, 2019
i 
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. 
Chu Hoàng Hà đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi 
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. 
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận 
đƣợc sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hƣớng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học, 
các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn 
Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công 
nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án. 
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng 
Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh 
học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. 
Luận án đƣợc thực hiện tại, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử 
nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ 
Việt Nam. Với sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài 
cấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. 
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động 
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này. 
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Nghiên cứu sinh 
Lê Thị Thủy 
 Lê Thị Thủy 
ii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan: 
Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi các số liệu và kết quả trình bày 
trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên 
ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố 
trong bất kỳ công trình nào khác. 
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong 
luận án. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 
Tác giả 
Lê Thị Thủy 
iii 
MỤC LỤC 
 LỜI CẢM ƠN...................................................................................... i 
 LỜI CAM ĐOAN................................................................................ Ii 
 MỤC LỤC........................................................................................... Iii 
 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..................................................... Vi 
 DANH MỤC BẢNG........................................................................ Viii 
 DANH MỤC HÌNH......................................................................... Xi 
MỞ ĐẦU............................................................................................... 1 
1 Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................... 1 
2 Mục tiêu nghiên cứu............................................................................ 3 
3 Nội dung nghiên cứu............................................................................ 3 
4 Những đóng góp mới của luận án........................................................ 3 
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.......................................... 4 
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 5 
1.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9..................................... 5 
1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9............................................................ 5 
1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9.................................................. 6 
1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9....................................................... 9 
1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9...................... 10 
1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9............................................................... 13 
1.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A...................................................... 16 
1.2.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay................................... 16 
1.2.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật................................................................. 19 
1.2.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam...................................... 20 
1.2.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam 21 
1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua 
Agrobacterium.................................................................................... 
24 
1.3.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât..................... 24 
1.3.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium........................... 26 
iv 
1.3.3 Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật.. 28 
1.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật.. 34 
1.4 Nano kim cƣơng (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công 
nghệ sinh học................................................................................. 
37 
1.4.1 Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cƣơng....................................... 37 
1.4.2 Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ 
sinh học.................................................................................................. 
37 
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 41 
2.1 Vật liệu.................................................................................................. 41 
2.1.1 Chủng vi khuẩn...................................................................................... 41 
2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật............................................... 41 
2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 42 
2.1.4 Hóa chất 42 
2.1.5 Thiết bị... 43 
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................... 43 
2.2.1 Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo 
chủng A. tumefaciens cho biểu hiện tạm thời...................................... 
43 
2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen............. 45 
2.2.3 Các phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu 
hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá........................................... 
47 
2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp . 50 
2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên 
tinh sạch. 
51 
2.2.6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm 55 
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU........................................................ 56 
3.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa 
kháng nguyên HA. 
56 
3.1.1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA.. 56 
3.1.2 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA 
mono_ELP.............................................................................................. 
59 
3.1.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA 
trimeric_ELP ......................................................................................... 
62 
v 
3.1.4 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA 
trimeric................................................................................................................... 
65 
3.1.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc................ 68 
3.2. Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp. 71 
3.2.1 Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp 71 
3.2.2 Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA. 75 
3.2.3 Kết quả đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA 
trimeric bằng phản ứng liên kết ngang... 
83 
3.3 Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của 
kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND .............................. 
84 
3.3.1 Kết quả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND............................. 
84 
3.3.2 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA 
trimeric-IgMFc................................................................................ 88 
3.3.3 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA 
mono_ELP và HA trimeric_ELP... 89 
3.4 Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng 
nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND trên động vật.... 91 
3.4.1 Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột....... 91 
3.4.2 Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu với HA... 92 
Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................... 95 
4.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa 
kháng nguyên HA. 95 
4.1.1 Lựa chọn gen trong thiết kế vector biểu hiện........................ 95 
4.1.2. Cấu trúc vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA .................... 96 
4.2 Biểu hiện tạm thời gen mã hóa kháng nguyên HA thông qua vi 
khuẩn Agrobacterium... 101 
4.2.1 Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp....................... 101 
4.2.2 Khả năng hình thành oligomer............................................................ 103 
4.3 Khả năng tạo phức hệ và gây ngƣng kết hồng cầu của kháng 
nguyên HA ....................................................................................... 104 
vi 
4.3.1 Khả năng tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND........................ 104 
4.3.2 Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ 
kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12)............................................... 105 
4.4 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột... 105 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 108 
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN....... 110 
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH............................................. 111 
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 115 
PHỤ LỤC 
vii 
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 
2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b của virus khảm dƣa chuột) 
35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) 
Aa Amino acid (axit amin) 
Bp Base pair (Cặp base) 
BSA Bovine serum albumin 
CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) 
Cs Cộng sự 
DNA Deoxyribonucleic acid 
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 
ELP Elastin-like polypeptide 
ER Endoplasmic reticulum (Lƣới nội chất) 
Fc Fragment crystallizable 
HA Hemagglutinin 
HAU Hemagglutination unit 
HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) 
HRP Horseradish peroxidase 
IgG 
IMAC 
Immunoglobulin G 
Immobilized Metal Affinity Chromatoraphy (sắc khí ái lực) 
Kb Kilobase 
KDa Kilodalton 
LB Luria-Bertani (Môi trƣờng nuôi vi khuẩn) 
mITC Membrane-based ITC (phƣơng pháp tinh sạch qua màng) 
NA Neuraminidase 
OD Optical density (Mật độ quang) 
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 
PBS Phosphate-buffered saline 
PCR Polymerase Chain Reaction 
viii 
PCS Polycloning site 
ARN Ribonucleic acid 
RNase Ribonuclease 
SAP Shrimp alkaline phosphatase 
ScFv Single chain variable fragment 
SDS Sodium dodecyl sulfate 
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis 
TAE Tris Acetate EDTA 
TaqDNA 
polymerase 
Thermus aquaticus DNA polymerase 
TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) 
v/p vòng/phút 
VLP Virus-like particle 
WHO World Health Oganization 
WT Wild type (Cây không chuyển gen) 
viii 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả năng lây nhiễm, 
gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus cúm 
gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm... 14 
Bảng 1.2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao 
cho cơ sở có nhu cầu sản xuất. 
20 
Bảng 1.3 Sự so sánh các đặc trƣng kỹ thuật giữa CVD diamons, Titanium 
và thép không gỉ............................................................................ 38 
Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen HA mono_ELP, 
 HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc............... 42 
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR............................................................ 44 
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen.............................................. 44 
Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (3
4
).. 49 
Bảng 3.1 Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA 
khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ 
HcPro PRSV/2b CMV.. 72 
Bảng 3.2 Kết quả phân tích phƣơng sai của các công thức thí nghiệm 
trong thí nghiệm trực giao. 75 
Bảng 3.3 Mức độ biểu hiện và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của protein 
HA....................................................................................................... 90 
ix 
DANH MỤC HÌNH 
Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A...................................................... 8 
Hình 1.2 Nguồn ngôc các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp.. 9 
Hình 1.3 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin..................................................... 12 
Hình 1.4 Sơ đồ mô tả bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời thông qua 
Agrobacterium... 27 
Hình 1.5 Quy trình tinh sạch protein bằng phƣơng pháp mITC. 36 
Hình.1.6 Cấu trúc tinh thể của Nanodiamons. 37 
Hình.1.7 Hình ảnh minh họa cho ứng dụng ND trong dẫn thuốc... 40 
Hình 2.1 Chuyển gen vào lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm 
thời nhờ A. tumefaciens................................................................ 48 
Hình 2.2 Cơ chế gây phản ứng ngƣng kết hồng cầu....................................... 52 
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bạch BALB/C............. 54 
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen HA............................... 59 
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP.... 60 
Hình 3.3 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 61 
Hình 3.4 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 62 
Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme 
giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 63 
Hình 3.6 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA 
trimeric_ELP................................................................................ 64 
Hình 3.7 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng 
enzyme cắt giới hạn....................................................................... 65 
Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme 
giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 66 
Hình 3.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA 
trimeric............................................................... ... ................. 
A/Jiangsu/60462/2016 .............................................A........................ 
A/Zhejiang/6/2016 .............................................A........................ 
A/chicken/Shanghai/019/2013 ...................................................................... 
A/chicken/Guangdong/SD641/2013 ...................................................................... 
A/duck/Anhui/SC702/2013 ...................................................................... 
A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 ...................................................................... 
A/chicken/zhejiang/JX148/2014 ...................................................................... 
A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 .............................................A.................E...... 
A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 .............................................A........................ 
 136 
 430 440 450 460 470 480 490 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
A/Shanghai/2/2013 NWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMAS 
A/Shanghai/1/2013 ...................................................................... 
A/Guangdong/1/2013 ...................................................................... 
A/Anhui/1/2013 ...................................................................... 
A/Hangzhou/1/2013 ...................................................................... 
A/Shantou/1002/2014 ...................................................................... 
A/Zhejiang/1/2014 ...................................................................... 
A/Fujian/2014 ...................................................................... 
A/Shanghai/PD-02/2014 ...................................................................... 
A/Beijing/40610/2015 ...................................................................... 
A/Guangdong/15SF050/2015 ...................................................................... 
A/Fujian/54840/2016 ..................I................................................... 
A/Jiangsu/60462/2016 ..................I................................................... 
A/Zhejiang/6/2016 ..................I................................................... 
A/chicken/Shanghai/019/2013 ...................................................................... 
A/chicken/Guangdong/SD641/2013 ...................................................................... 
A/duck/Anhui/SC702/2013 ...................................................................... 
A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 ...................................................................... 
A/chicken/zhejiang/JX148/2014 ...................................................................... 
A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 ...................................................................... 
A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 ..................I................................................... 
 500 510 520 530 540 550 560 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
A/Shanghai/2/2013 IRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI* 
A/Shanghai/1/2013 ..................................................A...................* 
A/Guangdong/1/2013 ......................................................................* 
A/Anhui/1/2013 ......................................................................* 
A/Hangzhou/1/2013 ......................................................................* 
A/Shantou/1002/2014 .............................................M........................* 
A/Zhejiang/1/2014 ......................................................................* 
A/Fujian/2014 ................................................................Q.....* 
A/Shanghai/PD-02/2014 ......................................................................* 
A/Beijing/40610/2015 ........R.............................................................* 
A/Guangdong/15SF050/2015 ........R.............................................................* 
A/Fujian/54840/2016 ........R.............................................................* 
A/Jiangsu/60462/2016 ........R.............................................................* 
A/Zhejiang/6/2016 ........R.............................................................* 
A/chicken/Shanghai/019/2013 ......................................................................* 
A/chicken/Guangdong/SD641/2013 ......................................................................* 
A/duck/Anhui/SC702/2013 ......................................................................* 
A/Pigeon/Shanghai/S1069/2013 ......................................................................* 
A/chicken/zhejiang/JX148/2014 ......................................................................* 
A/Chicken/Guangdong/SW154/2015 ........R.............................................................* 
A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016 ........R.............................................................* 
 137 
Hình 3.2. So sánh trình tự gen HA/H7N9 trƣớc và sau khi tối ƣu. 
 10 20 30 40 50 60 70 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCATTCCAACAA 
 M N T Q I L V F A L I A I I P T 
HA/H7N9 opt ATGGCTTCCAAACCTTTTCTATCTTTGCTTTCACTTTCCTTGCTTCTCTTTACAAGCACATGTTTAGCAG 
 M A S K P F L S L L S L S L L L F T S T C L A 
 80 90 100 110 120 130 140 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACTGAAAG 
 N A D K I C L G H H A V S N G T K V N T L T E R 
HA/H7N9 opt GATCC.....G..A.....G..T.....C..A..C..C..T.....T..G..G..T.....G..A..... 
 G S D K I C L G H H A V S N G T K V N T L T E R 
 150 160 170 180 190 200 210 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGG 
 G V E V V N A T E T V E R T N I P R I C S K G 
HA/H7N9 opt ...C..T.....G..A.....G.....G..T.....GA....C..T........A..T..T..T.....A 
 G V E V V N A T E T V E R T N I P R I C S K G 
 220 230 240 250 260 270 280 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAAT 
 K R T V D L G Q C G L L G T I T G P P Q C D Q 
HA/H7N9 opt .....A..T..C...T.A.....G.....C..TT....C..T..T.....C..T..G..G..C..T.... 
 K R T V D L G Q C G L L G T I T G P P Q C D Q 
 290 300 310 320 330 340 350 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) TCCTAGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATT 
 F L E F S A D L I I E R R E G S D V C Y P G K F 
HA/H7N9 opt ..T.G.....CAGC...........C..C..A...A....G..T..C..C..T........A..T..... 
 F L E F S A D L I I E R R E G S D V C Y P G K F 
 360 370 380 390 400 410 420 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) CGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTC 
 V N E E A L R Q I L R E S G G I D K E A M G F 
HA/H7N9 opt ...T.....G..G..CT.A.........T.G..G..G..T..A.....A..T..A..G........C..T 
 V N E E A L R Q I L R E S G G I D K E A M G F 
 430 440 450 460 470 480 490 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ACATACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAG 
 T Y S G I R T N G A T S A C R R S G S S F Y A 
HA/H7N9 opt ..G..TTCC..G..C.....C.....G..G..ATCG..G..C.....GAGT..T..C.....T....... 
 T Y S G I R T N G A T S A C R R S G S S F Y A 
 500 510 520 530 540 550 560 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATAC 
 138 
 E M K W L L S N T D N A A F P Q M T K S Y K N T 
HA/H7N9 opt .......G.....T..T..T.....C..C.....A........A........A..A..G..C........ 
 E M K W L L S N T D N A A F P Q M T K S Y K N T 
 570 580 590 600 610 620 630 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTA 
 R K S P A L I V W G I H H S V S T A E Q T K L 
HA/H7N9 opt C......TCA..T..G..G..T..G.....A..A........G..C..T..G...........A..AT.G 
 R K S P A L I V W G I H H S V S T A E Q T K L 
 640 650 660 670 680 690 700 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) TATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAG 
 Y G S G N K L V T V G S S N Y Q Q S F V P S P 
HA/H7N9 opt ..C..TTCA..............T.........TCAAGC.....C..G.....A........T.....C. 
 Y G S G N K L V T V G S S N Y Q Q S F V P S P 
 710 720 730 740 750 760 770 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) GAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGA 
 G A R P Q V N G L S G R I D F H W L M L N P N D 
HA/H7N9 opt .T..A.....T...........CT..AGC..C.....A..T.........T.....T.G..C..G..... 
 G A R P Q V N G L S G R I D F H W L M L N P N D 
 780 790 800 810 820 830 840 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) TACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCT 
 T V T F S F N G A F I A P D R A S F L R G K S 
HA/H7N9 opt C..C..T..C...TC...T........G........C..G..TA.A..TTCT..TT.A..G.....G... 
 T V T F S F N G A F I A P D R A S F L R G K S 
 850 860 870 880 890 900 910 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAA 
 M G I Q S G V Q V D A N C E G D C Y H S G G T 
HA/H7N9 opt .....G..T..ATCA..T..C.....G.....G...........A.....T..C...TC......A..C. 
 M G I Q S G V Q V D A N C E G D C Y H S G G T 
 920 930 940 950 960 970 980 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) TAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCA 
 I I S N L P F Q N I D S R A V G K C P R Y V K Q 
HA/H7N9 opt .T..TTC...T..............T..T..C.....A..T..C..T..G.....A..G.....G..A.. 
 I I S N L P F Q N I D S R A V G K C P R Y V K Q 
 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAGGAGTCTGCTGCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGT 
 R S L L L A T G M K N V P E I P K G R G L F G 
HA/H7N9 opt ...A...T.AT.AT....C..C..A.....A........A...........A..C..G..AT.G...... 
 R S L L L A T G M K N V P E I P K G R G L F G 
 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) GCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGA 
 139 
 A I A G F I E N G W E G L I D G W Y G F R H Q 
HA/H7N9 opt ...........A....................G..AT.G.......................G.....A. 
 A I A G F I E N G W E G L I D G W Y G F R H Q 
 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAAA 
 N A Q G E G T A A D Y K S T Q S A I D Q I T G K 
HA/H7N9 opt ....T..A.....A..G.....A..C..C..T..GTC...A...AGC..C..C..C.....T..C..G.. 
 N A Q G E G T A A D Y K S T Q S A I D Q I T G K 
 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATTAAACCGGCTTATAGAAAAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATAGACAATGAATTCAATGAGGTAGAG 
 L N R L I E K T N Q Q F E L I D N E F N E V E 
HA/H7N9 opt .C.T...A..T.A..T..G..G..T..............AC.T..T..T..C..G..T.....A..T..A 
 L N R L I E K T N Q Q F E L I D N E F N E V E 
 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAGCAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCATACAATGCTGAAC 
 K Q I G N V I N W T R D S I T E V W S Y N A E 
HA/H7N9 opt ..A..G...........C..C..C.....G......AG......C.....C...AGC..T.....A.... 
 K Q I G N V I N W T R D S I T E V W S Y N A E 
 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) TCTTGGTAGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACG 
 L L V A M E N Q H T I D L A D S E M D K L Y E R 
HA/H7N9 opt .AC.A..G..G...........A.....T..A...T.A..A.....G..G.....T..GT.A..T...A. 
 L L V A M E N Q H T I D L A D S E M D K L Y E R 
 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGT 
 V K R Q L R E N A E E D G T G C F E I F H K C 
HA/H7N9 opt ...T.....G...T.A.....A.....A...........T..G..A.....C.....T.....T..A... 
 V K R Q L R E N A E E D G T G C F E I F H K C 
 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) GATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGC 
 D D D C M A S I R N N T Y D H S K Y R E E A M 
HA/H7N9 opt ........T........ATCA..C.....C.....A..C..C..T..T...........G..A..C.... 
 D D D C M A S I R N N T Y D H S K Y R E E A M 
 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) AAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTT 
 Q N R I Q I D P V K L S S G Y K D V I L W F S F 
HA/H7N9 opt .G........T..A..C..T..T..A...T.GTCT..T..G..T..G..C.....C..G......TCA.. 
 Q N R I Q I D P V K L S S G Y K D V I L W F S F 
 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 
 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 
HA (A/Shanghai/02/2013) CGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTAAAGAATGGAAAC 
 G A S C F I L L A I V M G L V F I C V K N G N 
 140 
HA/H7N9 opt .......AGT.....T...T.GT.G..A..C..G......T.A..T.....T.....C..A......... 
 G A S C F I L L A I V M G L V F I C V K N G N 
 1690 1700 
 ....|....|....|....|....|.. 
HA (A/Shanghai/02/2013) ATGCGGTGCACTATTTGTATATAA 
 M R C T I C I * 
HA/H7N9 opt ...A.......A.....C...GGGCCC 
 M R C T I C I G P 
Trình tự màu đen: 54 nucleotide mã hóa chuỗi peptide tín hiệu gồm 18 axit amin 
dẫn đầu. Trình tự gạch chân: 75 nucleotide mã hóa cho LeB4 ER-signal peptide là 
đoạn peptide tín hiệu của gen LeB4. Trình tự bôi vàng: vị trí nhận biết của 
enzyme hạn chế BamHI và PspOMI.