Tóm tắt Luận án Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen phương nam ở Việt Nam

1 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
ĐỖ THỊ HẠNH 
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ 
PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VIRUS 
LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM Ở VIỆT NAM 
 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
 Mã số : 62 42 02 01 
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Hà Nội – 2017 
2 
 Công trình đƣợc hoàn thành tại: 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 
 Thầy hƣớng dẫn 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội 
 Thầy hƣớng dẫn 2: PGS.TS. Hà Viết Cƣờng 
Phản biện 1:  
Phản biện 2:. 
Phản biện 3:. 
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà 
nƣớc họp tại:Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam 
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2017 
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam 
- Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 
1 
MỞ ĐẦU 
1. Tính cấp thiết của tề tài 
Việt Nam là quốc gia trồng lúa và là một trong các nƣớc xuất 
khẩu lúa hàng đầu thế giới. Sản xuất lúa có vai trò cực kỳ quan trọng 
đối với khoảng 70% dân số nông nghiệp và an ninh lƣơng thực của 
đất nƣớc. Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm 
nhất và là nguyên nhân chính làm cho sản lƣợng lúa không ổn định 
và tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Dịch bệnh vius mỗi khi xảy ra 
thƣờng để lại những hậu quả nghiêm trọng, xảy ra luân phiên và tái 
bùng phát dịch sau một khoảng thời gian nhất định. 
Virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam (Southern rice black-streaked 
dwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát hiện lần 
đầu tiên vào năm 2001 tại các vùng trồng lúa thuộc tỉnh Quảng 
Đông, phía Nam Trung Quốc. Virus này là thành viên mới thuộc 
nhóm Fijivirus-2, họ Reoviridae. Triệu chứng chủ yếu của cây lúa 
nhiễm bệnh thƣờng thấy là cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, 
lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những 
u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá 
hoặc các đốt thân. Bệnh chủ yếu nhiễm trên các cây thuộc dạng thực 
vật thân cỏ nhƣ: lúa, ngô, cỏ. Môi giới truyền bệnh của SRBSDV là 
rầy lƣng trắng và rầy nâu nhỏ nhƣng chỉ có rầy lƣng trắng mới có khả 
năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô. Hệ gen virus có chiều dài 
29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi có kích thƣớc từ 1,8 đến 
4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 nhƣng hầu hết đều 
chƣa đƣợc xác định chức năng. Dựa vào mức độ bảo thủ protein, 
phân đoạn S9 và S10 có mức độ bảo thủ cao, mã hóa cho protein vỏ 
2 
của virus, do vậy thích hợp để nghiên cứu chẩn đoán. Phân đoạn S7 
cũng có mức bảo thủ cao và mã hóa protein P7.1 có vai trò quan 
trọng trong tiến hóa, do vậy thích hợp để nghiên cứu mức độ biến 
động trong quần thể virus. 
Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát hiện thấy lần 
đầu tiên trên lúa mùa năm 2009 tại 20 tỉnh miền Bắc và miền Trung 
với diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 ha. Vì là virus mới và lần 
đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam nên công tác chẩn đoán gặp rất nhiều 
khó khăn. Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hiện đại và phổ biến 
nhất hiện nay là kỹ thuật RT-PCR và E IS . Trong khi kỹ thuật 
chẩn đoán bằng RT-PCR cho kết quả có độ chính xác cao thì kỹ thuật 
chẩn đoán bằng ELISA cho kết quả tƣơng đối chính xác, kỹ thuật 
đơn giản, giá thành rẻ nên rất phù hợp với điều kiện Việt Nam. Tuy 
nhiên, do chƣa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bị 
nhiễm SRBSDV đều đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR sử 
dụng cặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình tự phân 
đoạn S10 của một số mẫu bệnh. Ngoài ra, các virus thực vật vốn có 
tốc độ đột biến rất cao do đặc tính mắc lỗi sao mã của enzyme RdRP 
(RNA dependent RNA polymerase) của virus, sự thay đổi nhanh 
chóng các lực tiến hóa nhƣ ký chủ và vector cũng nhƣ bản chất bộ 
gen phân đoạn nên khả năng hình thành các chủng/loài virus mới rất 
cao. Cho đến nay, chúng ta vẫn chƣa có một nghiên cứu nào về đánh 
giá đa dạng di truyền SRBSDV gây bệnh ở các vùng sinh thái trồng 
lúa khác nhau ở Việt Nam cũng nhƣ nghiên cứu chuẩn hóa quy trình 
chẩn đoán SRBSDV. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề 
tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán 
virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam”. 
3 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở các vùng sinh thái trồng 
lúa khác nhau của Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tự phân 
đoạn S7, S9 và S10. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng kỹ 
thuật RT-PCR và ELISA. 
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 
Đối tượng 
- Các mẫu virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam ở Việt Nam. 
- Các mẫu lúa nhiễm bệnh, sạch bệnh và các mẫu rầy nhiễm, sạch 
virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam 
Nội dung 
- Phân lập, giải trình tự ba phân đoạn S7, S9, S10 của 13 mẫu 
SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái ở Việt Nam và đánh 
giá đa dạng di truyền. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam 
bằng kỹ thuật RT-PCR. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam 
bằng ELISA. 
4. Tính mới của luận án 
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu chuyên 
sâu và có hệ thống về đa dạng di truyền virus lúa lùn sọc đen phƣơng 
Nam và bƣớc đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ 
di truyền gần gũi hơn với mẫu SRBSDV Quảng Đông. 
Luận án đã phát triển thành công kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV 
bằng RT-PCR cho kết quả chính xác 100% với các mẫu lúa nhiễm 
bệnh đã biểu hiện rõ triệu chứng và có thể phát hiện sớm mẫu lúa 
nhiễm bệnh chƣa biểu hiện rõ triệu chứng. 
4 
Luận án cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên tạo thành công 
kháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam bằng 
protein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu cao, có 
thể phát hiện virus ở cả mẫu lúa và rầy nhiễm virus. 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 
Luận án cung cấp các cơ sở dữ liệu, thông tin khoa học mới về đa 
dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam, cung cấp tƣ liệu khoa học mới 
về cơ sở khoa học và khả năng áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử 
trong chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam 
Kết quả đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam làm cơ 
sở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch và đề xuất các biện 
pháp phòng trừ hiệu quả giúp giảm thiểu tổn thất mùa màng cho 
ngƣời nông dân. 
Kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR có độ chính xác 
cao, phát hiện đƣợc sự có mặt của virus trong những cây lúa chƣa 
biểu hiện rõ triệu chứng và chẩn đoán virus bằng ELISA phát hiện 
nhanh sự có mặt của virus trong mẫu lúa và mẫu rầy nhiễm virus rất 
có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân gây 
bệnh. 
6. Cấu trúc của luận án 
Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 6 bảng số 
liệu, 49 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài 
liệu 34 trang; Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 22 
trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 71 trang; Kết luận và kiến 
nghị 02 trang. Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếng 
Việt và 102 tài liệu tiếng Anh. 
5 
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. CÁC VIRUS HẠI LÚA 
Virus hại lúa đã có từ lâu và đƣợc xem là bệnh hại nguy hiểm 
hàng đầu ở cây lúa trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. 
Tuy nhiên phải đến năm 1895 các nhà khoa học Nhật Bản mới 
nghiên cứu và lần đầu tiên virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarf 
virus-RDV) đƣợc phát hiện. Tiếp theo, virus lúa lùn sọc đen 
(RBSDV) đƣợc phát hiện và rất nhiều virus hại lúa khác đƣợc xác 
định nhƣ virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBV 
và Tungro spherical virus-RTSV), vàng lá di động (RTYV- Rice 
transitory yellow-ing virus), lá khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosis 
mosaic virus), lùn xoắn lá (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn 
(RGSV- Rice grassy stunt virus), trắng lá lúa (RHBV-Rice hoja 
blanca virus) Cho tới nay, đã có 16 loại virus gây hại trên lúa đƣợc 
phát hiện. 
Các virus phát hiện (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đen 
phƣơng Nam...) ở Việt Nam đều có tầm quan trọng kinh tế và lan 
truyền qua rầy. Việc chẩn đoán các virus trên lúa thƣờng khó do triệu 
chứng có thể bị nhầm lẫn do sử dụng thuốc trừ cỏ hoặc các nguyên 
nhân sinh lý. Phát hiện virus trên rầy buộc phải sử dụng các kỹ thuật 
chẩn đoán nhƣ E IS hoặc PCR. 
1.2. ĐẶC ĐIỂM CÁC FIJIVIRUS THUỘC HỌ REOVIRIDAE 
Các virus thuộc họ Reoviridae đƣợc đặc trƣng bởi bộ gen RN 
sợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm 9 đến 12 phân tử RNA sợi kép 
mạch thẳng. Chi Fijivirus có hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA 
sợi kép, mạch thẳng (S1-S10). Các phân tử RN này có kích thƣớc 
dao động từ 1,4 kb đến 4,5 kb. 
6 
1.3. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M 
Bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng nam lần đầu tiên xuất hiện ở tỉnh 
Quảng Đông, Trung Quốc (2001) và đƣợc xem là một biến chủng 
của RBSDV. Cây lúa bị nhiễm SRBSDV sinh trƣởng còi cọc, lá xanh 
đậm, xoăn trắng ở lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu 
trắng hoặc đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các 
đốt thân. Rầy lƣng trắng và một tỷ lệ nhỏ rầy nâu nhỏ là vector 
truyền SRBSDV. Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm 
10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb. Trong 
đó, phân đoạn S7 dài 2176 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein 
(40,5 kDa và 36,4 kDa); phân đoạn S9 dài 1899 bp, chứa hai ORF 
mã hóa hai protein (39,9 kDa và 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797 
bp, chứa một ORF mã hóa protein (62.6 kDa) hình thành lớp vỏ 
ngoài của phân tử virus. SRBSDV có sự tƣơng đồng về triệu chứng, 
phổ ký chủ, hình thái học phân tử virus, huyết thanh học với các 
thành viên khác trong chi Fijivius, đặc biệt là RBSDV. Hai kỹ thuật 
chẩn đoán SRBSDV phổ biến nhất là thử nghiệm miễn dịch liên kết 
men (E IS ) và phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR). 
1.4. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M Ở VIỆT NAM 
SRBSDV lần đầu tiên xuất hiện vào tháng 8 2009, tại Nghệ An, 
sau đó lan ra tại 20 tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ với diện tích bị 
hại tới 42.000 ha. Do tính chất nghiêm trọng của SRBSDV, ngoài 
việc xác định tác nhân gây bệnh, nhiều nghiên cứu về bản chất hệ 
gen và đa dạng di truyền của SRBSDV ở Việt Nam đƣợc nghiên cứu 
trong thời gian qua. Năm 2010 và 2011, bệnh có xu hƣớng mở rộng 
ra nhiều địa bàn trồng lúa khác nhau và có tới 34 tỉnh có diện tích 
trồng lúa bị bệnh. 
7 
Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
2.1. VẬT LIỆU 
2.1.1. Vật liệu thực vật 
13 mẫu lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen đặc trƣng đƣợc xác định 
bằng RT-PCR và ELISA và các mẫu lúa nghi nhiễm bệnh thu thập 
vào vụ xuân và vụ mùa các năm 2009-2012 tại các tỉnh: Thái Bình, 
Nam Định, Ninh Bình, Sơn a, ào Cai, Nghệ An, Quảng Trị, Huế 
do phòng Bệnh học phân tử - Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp. 
Các mẫu rầy khỏe, rầy nhiễm SRBSDV; các cây lúa nhiễm 
SRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp bởi Trung tâm 
bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 
Bảng 2.1. Mẫu lúa nhiễm SRBSDV dùng trong nghiên cứu 
STT Tên mẫu Giống lúa Thời vụ 
Địa điểm 
thu mẫu 
1 SonLa-1 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a 
2 SonLa-2 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a 
3 LaoCai -1 Nhị ƣu 838 Vụ xuân 2009 Lào Cai 
4 NinhBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Ninh Bình 
5 NinhBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Ninh Bình 
6 ThaiBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Thái Bình 
7 ThaiBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Thái Bình 
8 NamDinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Nam Định 
9 NgheAn-1 Xi 23 Vụ mùa 2009 Nghệ An 
10 QuangTri-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Quảng Trị 
11 QuangTri-2 Xi 23 Vụ xuân 2010 Quảng Trị 
12 Hue-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế 
13 Hue-2 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế 
2.1.2. Chủng vi sinh vật 
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α mua của hãng Invitrogen, E.coli 
8 
Rosetta (DE3) mua của hãng Novogen. 
2.1.3. Vector và oligonucleotide 
Vector pET28a/P10 do phòng Bệnh học phân tử, Viện di truyền 
Nông nghiệp cung cấp; pET32a mua của hãng Novogen; pGEM-T 
mạch thẳng có đầu T mua của hãng Promega. 
Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu đặt mua từ hãng 
Invitrogen và Sigma. 
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 
- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng RT-PCR. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng ELISA. 
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA 
- Định lƣợng protein bằng bằng phƣơng pháp Bradford. 
- Thiết kế mồi dựa trên trình tự đƣợc công bố trên GenBank 
(EU784841.1, EU784843.1, EU784840). 
- Nhân bản DNA/RNA bằng PCR và RT-PCR. 
- Nhân dòng và giải trình tự DNA. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR. 
- Xác định vùng gen mã hóa polypeptide giàu tính kháng nguyên 
bằng phần mềm Immune Epitope Database Analysis Resource. 
- Thiết kế vector biểu hiện gen đích trong tế bào vi khuẩn. 
- Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV theo phƣơng pháp 
Amero (1994) và Regenmortel (1993). 
- Phƣơng pháp kháng nguyên kháng thể: Kỹ thuật Western blot 
của Sambrook & Rusel (2001); kỹ thuật Dot-blot của Wang 
(2012); kỹ thuật PTA-ELISA của Mowat & Dawson (1987). 
9 
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. NGHIÊN CỨU Đ DẠNG DI TRUYỀN SRBSDV Ở VIỆT NAM 
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là đánh giá đặc điểm phân tử 
và đa dạng di truyền SRBSDV của Việt Nam dựa trên trình tự 3 phân 
đoạn S7, S9 và S10 của các mẫu virus thu thập từ các vùng sinh thái 
trồng lúa Việt Nam. 
Hình 3.2. Tinh sạch phân đoạn S10, S9 và S7 
Ghi chú: Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: hệ gen SRBSDV; giếng 
2: phân đoạn S10; giếng 3: phân đoạn S9; giếng 4: phân đoạn S7. 
Hệ gen của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái 
trồng lúa đƣợc tách chiết và điện di trên gel agarose. Các băng RN 
tƣơng ứng với các phân đoạn S7, S9 và S10 đƣợc tinh sạch từ gel 
agarose. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tinh sạch có kích thƣớc 
tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của các phân đoạn (Hình 3.2). 
Phân đoạn S7, S9, S10 đƣợc dòng hóa vào vector nhân dòng 
pGEM-T, giải trình tự và phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm 
MEGA5. 
Kết quả giải trình tự cho thấy thấy tất cả các phân đoạn S7, S9 
và S10 của 13 mẫu SRBSDV phân lập tại Việt Nam đều có kích 
thƣớc giống nhau, lần lƣợt là 2176 bp, 1849 bp và 1798 bp. Mức độ 
tƣơng đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam với nhau dao 
động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao động từ 97,3 - 
99,8%. Kết quả so sánh trình tự axit amin trên các khung đọc mở cho 
10 
thấy chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi hơn với 
SRBSDV Quảng Đông (Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.13). 
Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid của protein P9.1 
Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid của protein P9.2 
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của protein P10 
11 
Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của SRBSDV cho thấy 
các mẫu Việt Nam và Trung Quốc xuất hiện xen kẽ trên cây phả hệ, 
chứng tỏ chúng là một quần thể virus gây hại trong một vùng địa lý ở 
cùng một thời điểm, chƣa hình thành chủng mới. 
 Hình 3.9. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự 
phân đoạn S7 
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị b ... riển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam bằng kỹ 
thuật E IS . Các định hƣớng tạo kháng thể đa dòng nhƣ: (1) sử 
dụng hạt virus tinh chiết từ cây nhiễm bệnh hoặc (2) sử dụng protein 
vỏ (dạng đầy đủ hoặc một đoạn peptide) tái tổ hợp. 
3.3.1. Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV bằng hạt virus 
tinh chiết 
Hạt virus đƣợc tinh chiết từ mẫu lúa lây nhiễm nhân tạo 
SRBSDV để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. Kháng thể IgG tinh 
sạch đƣợc kiểm tra bằng PTA-ELISA. Kết quả thu đƣợc cho thấy 
14 
kháng thể IgG tinh sạch có hiệu giá là 1/200 (Hình 3.30) và phát hiện 
chính xác sự có mặt của SRBSDV trong mẫu cây bệnh (Hình 3.31). 
Hình 3.30. Xác định hiệu giá kháng thể IgG bằng PTA- ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/100, 
1/200, 1/500, 1/1000, mẫu dịch chiết cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe 
(cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện ODA405 trung bình 3 lần xét nghiệm. 
Hình 3.31. Xét nghiệm SRBSDV trong mẫu lúa bệnh 
Ghi chú: Mẫu dich chiết cây được pha loãng theo tỷ lệ 1/5; 1/10 và 1/20. 
Kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/200, mẫu dịch chiết 
cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe (cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện giá trị 
ODA405 trung bình của 3 lần xét nghiệm. 
3.3.2. Nghiên cứu tạo kháng thể kháng SRBSDV bằng protein 
vỏ tái tổ hợp P10 của SRBSDV 
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu của 
SRBSDV bằng protein vỏ tái tổ hợp sử dụng vector pET28a/P10. 
Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E. coli Rossetta 
và tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực Ni2+ agarose (Hình 3.33). Protein 
15 
tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên 
chuột. Kháng thể IgG đƣợc tinh sạch từ kháng huyết thanh (đã kiểm 
tra đáp ứng miễn dịch) bằng cột sắc ký ái lực Protein A-sepharose 
(Hình 3.35). 
Hình 3.33. Tinh sạch protein P10 bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA 
Ghi chú: (A) Dịch chiết tế bào và các phân đoạn tinh sạch protein được 
điện di trên gel SDS-PAGE 12%. (B). Protein P10 được phát hiện bằng 
kháng thể anti-His-tag pha loãng 1: 5000. MK: thang chuẩn protein; giếng 
1: Dịch chiết tế bào; giếng 2: dịch không gắn cột; giếng 3,4: phân đoạn rửa 
cột; giếng 5-8: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250 mM. 
Hình 3.35. Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch 
Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột Protein A-Sepharose được điện di 
trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng Mk: Thang chuẩn protein; giếng 1: phân 
đoạn rửa giải. (B) Khả năng phát hiện protein P10 của kháng thể IgG tinh 
sạch pha loãng 1: 2000; Giếng Mk: Thang chuẩn Protein; Giếng 1: Protein 
P10 tinh sạch; Giếng 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm); 
Giếng 3: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10. 
16 
Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot. Kết 
quả thu đƣợc cho thấy kháng thể IgG sau đƣợc tinh sạch phát hiện 
đƣợc protein P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:6000 (Hình 3.36A 
cột 2) và SRBSDV trong mẫu dịch chiết lúa và ngô bệnh ở nồng độ 
pha loãng 1:5000 (Hình 3.36B). 
Hình 3.36. Xác định hiệu giá kháng thể tinh sạch bằng Dot-blot 
Ghi chú: (A) Xác định hiệu giá của kháng thể sau tinh sạch được đánh giá 
bằng protein P10 bằng phương pháp Dot-blot; kháng huyết thanh (cột 1) và 
kháng thể sau tinh sạch (cột 2) được pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 
1:4000, 1:5000 và 1:6000. (B) Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch được 
đánh giá bằng dịch chiết cây lúa và ngô pha loãng theo tỉ lệ 1:50, 1:100 và 
1:200; mẫu kháng thể tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1:1000 và 1:5000; (+): 
dịch chiết cây nhiễm SRBSDV; (-): dịch chiết cây sạch bệnh. 
Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch đƣợc tiếp tục xác định bằng 
kĩ thuật ELISA sử dụng mẫu lúa nhiễm SRBSDV và RRSV. Kết quả 
cho thấy kháng thể ở nồng độ pha loãng 1:5000 có khả năng nhận 
biết đặc hiệu SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen (Hình 
3.37), ngoài ra, kháng thể sau tinh sạch cũng có khả năng phát hiện 
sớm sự có mặt của SRBSDV trong trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy 
nhiễm SRBSDV cao hơn 50% (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân 
tạo) (Hình 3.38). 
A B
1: 50
1: 100
1: 200
17 
Hình 3.37. Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể bằng ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được 
kiểm tra bằng ELISA với mẫu dịch chiết cây khỏe (cột màu xanh dương), 
cây nhiễm SRBSDV (cột màu đỏ) và cây nhiễm RRSV (cột màu xanh lá) pha 
loãng tỉ lệ 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 và 1/60. Đồ thị thể hiện giá trị ODA492 
trung bình của 3 lần xét nghiệm. 
Hình 3.38. Đánh giá khả năng phát hiện SRBSDV trong mẫu rầy 
nhiễm SRBSDV bằng ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được 
kiểm tra bằng ELISA với mẫu rầy được trộn theo tỉ lệ [số rầy bệnh (B)]:[số 
rầy khỏe (K)] là 0B:5K, 1B:4K, 2B:3K, 3B:2K, 4B: 1K và 5B:0K. Đồ thị thể 
hiện giá trị ODA492 trung bình của 3 lần xét nghiệm. (ĐC) đối chứng âm. 
3.3.3. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng SRBSDV bằng 
polypeptide giàu tính kháng nguyên 
Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể kháng P10 từ 
polypeptide giàu tính kháng nguyên nhằm tăng tính đặc hiệu cho xét 
18 
nghiệm ELISA 
Đoạn polypeptide giàu tính kháng nguyên trên protein vỏ P10 
đƣợc lựa chọn bằng các phần mềm tin sinh. 
Kết quả phân tích tính ƣa nƣớc, khả năng nằm trên bề mặt và cấu 
trúc không gian của các vùng polypeptide trên P10 bằng phần mềm 
IEDB cho thấy 2 vùng polypeptide ở vị trí 259-425 và vị trí 365-557 
đƣợc dự đoán là giàu tính kháng nguyên (Hình 3.39 và 3.40) và đảm 
bảo tính bảo thủ trên tất cả các mẫu SRBSDV đã phân lập ở Việt 
Nam. 
A 
B 
Hình 3.39. Dự đoán tính kháng nguyên trên protein P10 
Ghi chú: Biểu đồ dự đoán tính ưa nước (A) và khả năng nằm trên bề mặt 
phân tử (B) của các vùng polypeptide trên P10. Vùng màu vàng: vùng 
polypeptide ưa nước và nằm trên bề mặt phân tử; vùng màu xanh: vùng 
polypeptide kỵ nước và không nằm trên phân tử. Threshold: giá trị ngưỡng. 
19 
Hình 3.40. Dự đoán vùng polypeptide có cấu trúc không gian có 
khả năng tạo epitope 
Ghi chú: Các vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả năng tạo 
epitope nằm ở vị trí 1-166 (A), 235-415 (B), 446-557 (C) trên P10. 
2 đoạn nucleotide mã hóa chuỗi axit amin ở vị trí 259-425 và 
365-557 (đặt tên là P10.1 và P10.2) đƣợc phân lập bằng kỹ thuật 
PCR (Hình 3.41, giếng 1 và 3). Sản phẩm PCR sau đó đƣợc nhân 
dòng vào vector pGEM-T. 
Hình 3.41. Nhân bản đoạn gen P10.1 và P10.2 bằng PCR 
Ghi chú: Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 và 2: PCR với cặp 
mồi S10-P1-Fw/ S10-P1-Rv ; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/ 
S10-P2-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/S10; giếng 2 và 4: Đối chứng âm 
(khuôn là H2O) 
Tiếp theo, đoạn gen P10.1 và P10.2 đƣợc cắt và ghép nối vào 
vector biểu hiện pET32a. Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng PCR 
và cắt bằng enzyme giới hạn. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.45 cho 
thấy đoạn gen P10.1 và P10.2 đã đƣợc ghép nối thành công vào 
vector biểu hiện pET32a. Các vector pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2 
20 
sau đó đƣợc giải trình tự bằng mồi T7. 
Hình 3.45. Kiểm tra pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2 bằng PCR 
và cắt giới hạn 
Ghi chú: (A) PCR pET32a/P10.1; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P1-
Fw/S10-P1-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3: 
đối chứng âm (khuôn là H2O); giếng 2 và 4: khuôn là plasmid. (B) PCR 
pET32a/P10.2; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/S10-P2-Rv; 
giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là 
plasmid; giếng 2 và 4:đối chứng âm (khuôn là H2O).(C) Cắt giới hạn 
plasmid bằng EcoRI/XhoI; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 
4: plasmid nguyên bản; giếng 1 và 2: pET32a/P10.1; giếng 3 và 4: 
pET32a/ 10.2. iếng : Thang DN chuẩn 1 kb. 
Hình 3.46. Biểu hiện protein tái tổ hợp P10.1 và P10.2 trong tế 
bào E. coli 
Ghi chú: (A) Kết quả điện di dịch chiết tế bào trên SDS-PAGE 12%. (B) 
Polypeptide P10.1 và P10.2 phát hiện bằng kháng thể anti-His-tag (pha 
loãng 1: 5000). Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào 
mang pET32a trống; giếng 2: thể tan của dịch chiết tế bào mang 
pET32a/P10.1; giếng 3: thể cặn của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.1; 
giếng 4: thể tan của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2; giếng 5: thể cặn 
của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2. 
21 
Polypeptide tái tổ hợp P10.1 và P10.2 đƣợc biểu hiện trong vi 
khuẩn E. coli Rossetta (Hình 3.46) và tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực 
Ni
2+
 agarose (Hình 3.47). Protein tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng 
để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột. 
Hình 3.1. Tinh sạch polypeptide P10.1 và P10.2 bằng sắc ký ái 
lực Ni-NTA 
Ghi chú: Mẫu protein được điện di trên gel SDS-PAGE 12%. (A) Kết quả 
tinh sạch polypeptide P10.1; giếng 1-4: dịch rửa cột bằng imidazol 30 mM; 
giếng 5-14: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250m . (B) Kết quả tinh 
sạch P10.2; giếng 1: dịch chiết tế bào không cảm ứng bằng IPTG; giếng 2: 
dịch chiết tế bào cảm ứng bằng IPTG; giếng 3: dịch rửa cột; giếng 4: thang 
chuẩn protein; giếng 5-12: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250m 
Kháng huyết thanh chuột sau 4 tuần tiêm đƣợc kiểm tra khả năng 
nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn 
dịch. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.48 cho thấy kháng thể có mặt 
trong 2 mẫu kháng huyết thanh chuột ở độ pha loãng 1:2000 đều có 
khả năng nhận biết đặc hiệu với protein P10 tái tổ hợp tinh sạch cho 
phép kết luận việc gây kháng thể đa dòng từ polypeptide P10.1 và 
P10.2 tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công. 
22 
Hình 3.48. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh 
Ghi chú: Kháng huyết thanh chuột sau khi tiêm P10.1 (giếng 1) và P10.2 
(giếng 2) 4 tuần (pha loãng 1:2000) được kiểm tra bằng lai thẩm tách miễn 
dịch. Giếng Mk: thang protein chuẩn; giếng 1 và 2: mẫu P10 tinh sạch. 
Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định bằng kĩ thuật Dot-blot. Kết 
quả thu đƣợc cho thấy kháng huyết thanh tạo ra từ polypeptide P10.1 
ở độ pha loãng 1:7000 (Hình 3.49 hàng 1) và P10.2 ở độ pha loãng 
1:6000 (Hình 3.49 hàng 2) có thể phát hiện protein tái tổ hợp P10. 
Hình 3.49. Xác định hiệu giá của kháng huyết thanh 
Ghi chú: Hiệu giá của kháng huyết thanh kháng P10.1 (hàng 1) và P10.2 
(hàng 2) được đánh giá bằng mẫu protein P10 tinh sạch. Kháng huyết thanh 
được pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 
1:6000,1:7000 và 1:8000. 
23 
KẾT LUẬN 
1. Đã phân lập và giải trình tự đầy đủ ba phân đoạn S7, S9 và 
S10 của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái khác nhau 
của Việt Nam với các kích thƣớc lần lƣợt là 2176 bp, 1849 bp và 
1798 bp. Mức độ tƣơng đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam 
với nhau dao động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao 
động từ 97,3 - 99,8%. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide cho 
thấy các mẫu virus Việt Nam và Trung Quốc là một quần thể virus 
gây hại trong một vùng địa lý ở cùng một thời điểm. Kết quả so sánh 
trình tự amino acid trên các khung đọc mở, SRBSDV Việt Nam có 
quan hệ di truyền gần gũi hơn với SRBSDV Quảng Đông. 
2. Đã phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng 
kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu S10-t1-Fw/S10-t1-Rv. 
Thử nghiệm kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV trên 192 mẫu bệnh cho kết 
quả chính xác 100% với các mẫu lúa nhiễm bệnh đã biểu hiện rõ 
triệu chứng. Đặc biệt, kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV có thể phát hiện 
sớm sự có mặt của virus ở giai đoạn cây lúa chƣa biểu hiện rõ triệu 
chứng bệnh. 
3. Đã tạo thành công bốn kháng thể kháng SRBSDV từ hạt 
virus gây bệnh, protein tái tổ hợp P10 và các polypeptide giàu tính 
kháng nguyên để phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng 
ELISA. Kháng thể tạo ra từ hạt SRBSDV ở nồng độ pha loãng 1:200 
có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của SRBSDV trong dịch chiết mẫu 
cây nhiễm bệnh bằng kỹ thuật PTA - ELISA. Kháng thể tạo ra từ 
protein vỏ P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:5000 có thể phát 
24 
hiện đƣợc sự có mặt của SRBSDV trong dịch chiết mẫu cây nhiễm 
bệnh bằng kỹ thuật Dot blot. Kháng thể tạo ra từ polypeptide tái tổ 
hợp P10.1 ở nồng độ pha loãng 1:7000 có thể phát hiện đƣợc protein 
tái tổ hợp P10 bằng kỹ thuật Dot-blot. Kháng thể tạo ra từ 
polypeptide tái tổ hợp P10.2 ở nồng độ pha loãng 1:6000 có thể phát 
hiện đƣợc protein tái tổ hợp P10 bằng kỹ thuật Dot-blot. 
4. Đã thử nghiệm thành công kháng thể tạo ra từ protein vỏ P10 
tái tổ hợp trong chẩn đoán SRBSDV bằng kĩ thuật ELISA trên lúa và 
rầy. Ở nồng độ pha loãng 1:5000, kháng thể tạo ra từ protein vỏ P10 
tái tổ hợp có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của SRBSDV trong dịch 
chiết mẫu cây nhiễm bệnh. Đặc biệt kháng thể tạo ra từ protein vỏ 
P10 tái tổ hợp có thể phát hiện chính xác sự có mặt của SRBSDV 
trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy nhiễm SRBSDV cao hơn 50%, mở 
ra cơ hội phát hiện sớm diễn biến phát dịch phục vụ công tác dự tính 
dự báo. 
KIẾN NGHỊ 
1. Tiếp tục phân lập và giải trình tự các phân đoạn còn lại của hệ gen 
SRBSDV để hoàn thiện việc giải mã hệ gen SRBSDV Việt Nam ở 
các vùng sinh thái khác nhau phục vụ nghiên cứu đa dạng di truyền, 
nguy cơ phát sinh chủng mới và kiểm soát virus bằng công nghệ gen. 
2. Tiếp tục đánh giá độ đặc hiệu, phản ứng chéo của kháng thể đa 
dòng tạo ra trong nghiên cứu để đảm bảo tính chính xác của phƣơng 
pháp ELISA. 
3. Sản xuất kháng huyết thanh SRBSDV với số lƣợng lớn phục vụ 
công tác dự tính dự báo, chẩn đoán bệnh trong trƣờng hợp dịch bùng 
phát, tiến tới sản xuất bộ kit chẩn đoán nhanh virus bằng quick-stick. 
25 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH 
ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
1. Nguyễn Hoàng Quang, Lại Phƣơng iên, Đỗ Thị Hạnh, Hà 
Viết Cƣờng, Phạm Xuân Hội, 2014, “Nghiên cứu đa dạng di 
truyền phân đoạn S7 của virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam 
ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 
số 2. 
2. Nguyễn Hoàng Quang, Phạm Thanh Tâm, Đỗ Thị Hạnh, 
Phạm Xuân Hội, 2014, “Phân tích đa dạng di truyền và chức 
năng phân đoạn S9 của một số chủng virus lúa lùn sọc đen 
Phƣơng Nam ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam”, Tạp 
chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 20. 
3. Nguyễn Hoàng Quang, Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thị Vân, Trần 
Thị Nhƣ Hoa, Hà Viết Cƣờng, Phạm Xuân Hội, 2013, “Phân 
tích trình tự phân đoạn S10 của các chủng virus gây bệnh lúa 
lùn sọc đen ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và công nghệ 
nông nghiệp Việt Nam, số 2(41). 
4. Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội, 2015, “Tạo 
kháng thể đa dòng kháng vi rút lùn sọc đen Phƣơng Nam hại 
lúa bằng protein tái tổ hợp”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát 
triển Nông thôn, số 23. 
5. Đỗ Thị Hạnh. Đàm Quang Hiếu, Nguyễn Duy Phƣơng, Phạm 
Xuân Hội, 2015, “Biểu hiện và tinh sạch polypeptit giàu tính 
kháng nguyên P10.2 trên protein vỏ P10 của virus gây bệnh 
lúa lùn sọc đen”, Tạp chí Khoa học và công nghệ nông 
nghiệp Việt Nam, số 6(59). 
6. Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thanh Tâm, Phạm Xuân Hội, 2015, 
“Phân lập và biểu hiện đoạn gen mã hóa polypeptit giàu tính 
kháng nguyên trên protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn 
sọc đen”, Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 13, số 7.